柑橘黄龙病 (Citrus Huanglongbing，HLB) 是由不可培养的韧皮部杆菌 (Candidatus Liberibacter) 引起的一种毁灭性病害。该病菌存在亚洲种 (Ca. L. asiaticus)、非洲种 (Ca. L. africanus) 和美洲种 (Ca. L. americanus)，均可通过木虱和嫁接进行传播^[1]。赣南脐橙产业是中国脐橙主产区，是赣州重大特色产业，近几年柑桔黄龙病在赣州蔓延，2013年以来，全市18个县 (市、区) 共砍伐黄龙病树1 000多万株，占全市总株树的10%以上，给脐橙产业带来重大损失。目前对患病的果树无根本性的解决方法，国内外在柑橘黄龙病的预防和治疗方面的研究投入了大量的人力和物力，但仍然无法获得有效的途径和方法，树体一旦受到侵害，必须彻底砍除、挖蔸并烧毁，以防止其蔓延。

植物内生细菌是植物体内正常存在的微生态群落，不同类型的微生物之间可以相互作用以保持植物体的动态平衡^[2]。已有研究表明，柑橘黄龙病患病果树内存在多种内生菌，而且呈多样性分布，同一果树不同部位其内生菌种类、量大小均有明显区别^[3]。这些内生菌和黄龙病病原菌共同存在于患病果树中，有着直接或间接的相互作用。Trivedi等^[4]发现柑橘根部存在类芽孢杆菌 (Paenibacillus validus)、梭形芽孢杆菌 (Lysinibacillus fusiformis)、地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis)、恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putida)、Microbacterium oleivorans和普城沙雷氏菌 (Serratia plymutica) 时，叶片中的黄龙病菌数量明显下降。李佳等^[5]发现中短小杆菌属 (Curtobacterium sp.)、欧文氏菌属 (Erwinia sp.)、蜡样芽胞杆菌 (Bacillus cereus) 为患病长春花内生细菌的优势菌群，鞘胺醇单胞菌属 (Brevundimonas sp.)、芽胞杆菌属 (Bacillus sp.) 为健康长春花内生细菌的优势菌群，黄龙病菌的存在可以改变长春花原有内生细菌的菌群结构且菌群多样性下降。植物内生细菌可影响植物的生长发育并可用于生物防治，合理利用植物的内生微生物具有重要的理论意义和实用价值。目前关于赣南脐橙黄龙病病原菌的共生菌筛选、纯化培养研究工作相对较少，本研究采用分子生物学方法和常规传统方法相结合，分析罹病与健康脐橙植株叶片内生细菌种群多样性并找寻优势菌群，探讨伴生细菌与黄龙病菌的互作关系，为柑橘黄龙病菌的病原学研究以及防治奠定基础。

1 材料与方法 1.1 供试植物

试验用脐橙叶片均采自江西赣州赣县劳田村脐橙生产基地 (E115 12′，N26 04′)。选定10棵植株 (样本编号：051101、051102、051103、051104、051105、051106、051107、051108、051109、051110)，其中疑似病、健植株各5株，分别采集叶片样品，所有采集样品用自封口熟料袋封装后4保存，并在一周内处理。

1.2 培养基

脐橙汁液制备：取新鲜无农药残留的脐橙榨汁，用纱布过滤去除果肉等纤维组织，灭菌，4保存备用。

培养基：LB培养基^[5]，脐橙汁液培养基 (LB培养基+脐橙汁液60 mL/L，pH 5.5)。

1.3 主要试剂

细菌基因组DNA提取试剂盒、Omega Soil DNA Kit提取试剂盒、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒，上海生工生物工程有限公司；引物合成、2×Taq Mix酶，北京鼎国生物技术有限公司。

1.4 内生细菌的富集培养

样品的灭菌处理^[6]：叶片用75%的乙醇冲洗去除叶片表面等异物，再用无菌水冲洗2次，4%的次氯酸钠浸泡4 min，无菌水浸泡3次，每次1 min，取最后一次的浸泡水100 μL在LB培养基上平板涂布，28培养48 h，检验叶片表面消毒是否完全。

内生菌的富集培养：在无菌间内，将表面消毒处理好的叶片 (样品051102、051105、051108) 剪成约0.25 cm²碎片，每个样品均分别浸泡于LB培养基 (编号：P051102、P051105、P051108) 和脐橙汁液培养基 (编号：P051102H、P051105H、P051108H) 中，28 r/min培养48 h。

1.5 内生菌总基因组的提取

内生菌富集培养液总基因组DNA提取：各培养菌液分别取1 mL于2 mL离心管中，用细菌DNA提取试剂盒提取总基因组DNA。

叶片内生菌总基因组DNA提取：称取0.5 g玻璃珠于5 mL离心管中，加入0.2 g样本，以Omega D5625-01 Soil DNA Kit提取试剂盒提取。

1.6 内生菌和黄龙病菌的验证

以提取的内生细菌总DNA为模板，分别以细菌通用引物341F/805R和黄龙病菌特异性引物OI1/OI2c扩增。引物序列以及扩增程序如表 1、表 2所示。PCR扩增体系均为50 μL：2×Taq Mix 25 μL，10 μmol/L引物各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH₂O 22 μL。PCR所得产物于1.5%的琼脂糖凝胶上电泳。

黄龙病引物扩增出的目的基因片段用凝胶纯化试剂盒纯化回收，送至上海生工生物工程有限公司测序验证。

1.7 16S rRNA基因高通量测序分析内生菌多样性

16S rRNA基因高通量测序由上海生工生物工程有限公司完成，通过Miseq测序平台测定内生菌V3−V4高变区序列。将多条序列根据其序列之间的距离来对它们进行聚类，后根据序列之间的相似性作为域值分成操作分类单元 (Operational taxonomic unit，OTU)。在OTU聚类结果的基础上，获取每一个OTU聚类中的代表性序列与RDP classifier数据库 (http://rdp.cme.msu.edu/misc/resources.jsp)、Silva数据库 (http://www.arb-silva.de/) 和Unite数据库 (http://www.mothur.org/wiki/UNITE_ITS_database) 中的已知数据进行比对，得到各OTU代表序列的分类学信息，并在门纲目科属种水平统计各个样品的菌落组成。

2 结果与分析 2.1 黄龙病原菌的确定

各样品内生菌总基因组DNA提取结果如图 1所示，未培养样品内生菌含量少，所提取基因组含量较低，富集培养后DNA含量明显提高。

利用PCR法将脐橙叶片进行了黄龙病原的分子检测，经PCR扩增后，能扩增出特异性条带，说明这些叶片中含有黄龙病菌，没有扩增出相应条带则说明不含有黄龙病菌。PCR的扩增结果如图 2所示。051101−051105号样品扩增后得到长度为1 075 bp的特异性DNA序列，经Blastn比对后与已知韧皮部杆菌亚洲种的16S rRNA基因部分序列相似度达99%。由此可以得出，1−5号植株感染了黄龙病，且都是由韧皮部杆菌亚洲种引起，6−10号为健康株。

2.2 16S rRNA基因高通量测序数据分析

将测序数据进行拼接后，去除短片段序列 ( < 50 bp) 和Reads尾部质量值在20以下的碱基，得到的序列大部分分布在400−600 bp之间，平均长度均在440 bp以上 (图 3)。

对各样品序列进行归类并根据序列的相似度分成很多分组，每一分组即一个分类操作单元 (OTU)。不同OTUs测序结果与GenBank进行序列同源性比对并物种分类后，得到样品在各个分类水平上的分类学情况，其中各菌属的分布详见表 3。在各样品中还存在一些未分类菌 (Unclassified)，由图 4可以看出，1−10号未培养的样品中的未分类菌较多，在培养后的样品中明显减少 (P051108H除外)，说明这些未分类菌大部分是不可培养的。而黄龙病株 (1−5号) 各样本间未分类菌差异较大，健康植株 (6−10号) 中数量较为稳定。

2.3 不同脐橙植株叶片内生菌的多样性

在一定环境条件下能大量繁殖并在种间竞争中占优势的菌属即为优势菌属。由表 2可以看出，5株病株中共同含有的细菌属有13个，其中7个在5株健株中也共同存在，有5个只在部分健株中存在，而韧皮部杆菌是病株特有菌属。Defluviicoccus属和Granulicella属在病健株植物中都是优势菌属，且在健株中的平均含量高于病株 (图 5)。健株中Rhodoligotrophos属和沙雷氏菌 (Serratia) 含量也多于病株，而其他菌属均在病株中含量较高。

样品间相似度分析表明 (图 6)，病株 (1−5号) 与健株 (6−10号) 之间界线明显，病株之间距离较近，其中2号和4号菌群分布相近，3号、5号和1号类似。此结果说明黄龙病菌对脐橙叶片内生菌群的生长分布有显著影响。

2.4 培养和未培养内生菌比较

将2号病株、5号病株和8号健株的内生菌进行培养后，得到大量富集的菌属有肠杆菌属 (Enterobacter)、短小杆菌属 (Curtobacterium)、假单胞菌属 (Pseudomonas) 和泛菌属 (Pantoea)。在未培养内生菌中高丰度的Defluviicoccus和Granulicella在培养基中未得到富集，不动杆菌属、普雷沃菌属 (Prevotella)、沙雷氏菌属、链球菌属、短波单胞菌属 (Brevundimonas) 等9个非优势菌属也得到了不同程度的富集，但富集量较少。这些菌在不同的样本和不同的培养基中的分布不同 (图 7)。由样品间相似度 (图 6) 也可以看出，培养后样本菌群与未培养样本的内生菌群相关性小，距离远。

3 讨论

植物内生细菌是一类定殖在植物内部的细菌^[7]，其种类组成及结构变化会受到植物自身生长状况以及外界环境的影响^[8]。外界病原菌的入侵也能造成植物内生菌群落结构的改变。目前，有关黄龙病病原菌入侵脐橙而造成内生细菌群落结构改变及两者关系的研究报道较少。本研究以感染黄龙病的脐橙和未感染黄龙病的健康脐橙为研究对象，经16S rRNA基因高通量分析，共获得19个内生菌属，其中有7个菌属在所有病健株中都共同存在，5个在所有病株和部分健株中存在。在病株中特有的菌种只有韧皮部杆菌，但病株叶片内生菌种类和数目与健康植株都不同，说明黄龙病感染初期引起了叶片内生菌群的结构变化。这与Araújo等^[9]研究结果相一致。他们的研究也发现在被黄龙病原菌侵染但不表现症状的柑橘植株中，内生细菌数量比健康植株高。同样也有研究表明黄龙病菌的存在可以改变植株原有内生细菌的菌群结构，且菌群多样性下降^[5]。另外，患病与健康植株中的未分类细菌数量差异也较大。虽然无法确定这些细菌的种类是否发生了变化，但这些细菌也可能受到黄龙病菌的影响。未分类菌与黄龙病菌之间的相互作用关系还需要进一步深入研究。

我们发现Defluviicoccus属、Granulicella属是未培养植株中的优势菌属。而培养后的优势菌株是肠杆菌属、短小杆菌属和假单胞菌属等。这主要是由于细菌的培养受到所选用的培养基及培养条件的选择性影响，因此，培养后细菌的种类及数量丰富度不一定反映组织中细菌的真实状态，而非培养方法更能反映客观实际。李颜方等^[10]的研究中表明培养后的优势菌属是芽孢杆菌属和短小杆菌属，未培养样本的优势菌属是沙雷氏菌属和泛菌属，这与我们的研究结果不同，可能是由于柑橘与脐橙的内生菌种类有所不同，或者生长地域环境的不同引起了叶片内生菌群的差异，因为根际土壤是内生细菌的主要来源，内生细菌是由根向茎部以及叶片传播^[11]。由我们的结果可知，要想分离出对黄龙病菌有作用的伴生菌必须得到真正的植物内生菌群落分布，而即使用不同的培养基进行培养，也不能保证所有生活在植物组织内的内生菌都被分离出来，可能有的内生菌不能在人工培养基上生长，也有可能是植物正处在非内生性病原菌感染初期，因此富集培养后的优势菌可能并不是我们需要的功能性伴生菌。另外，内生菌长期生活在植物组织内部并与宿主植物协同进化，其形态特征必然发生一定的变化以适应其内生环境，那么传统的形态学分类标准是否能准确反映其分类地位也值得探讨。因此只有从活体植物组织内直接检测和鉴定内生菌，才能得到真正的植物内生菌群落分布情况。本研究采用高通量测序技术直接测定活体植物叶片中的内生菌群结构，结合富集培养后优势菌群的变化对比分析，对赣南脐橙黄龙病相关内生菌的研究具有重要意义。