蜜蜂属于昆虫纲 (Insecta) 膜翅目 (Hymenoptera) 细腰亚目 (Apocrita) 针尾部 (Aculeata) 蜜蜂总科 (Apoidea) 蜜蜂科 (Apidae) 蜜蜂亚科 (Apinae) 蜜蜂属 (Apis)，是以雌性个体为主的社会性群体生活昆虫，分布于除南北极以外的世界各地^[1]。蜜蜂种类不多，但是种群水平高、个体数量大，对人类生活和农业生产产生巨大影响。蜜蜂不仅是农作物最好的授粉者，蜂产品还具有很高的营养和医疗保健价值。另外，蜜蜂主要病害有美洲幼虫腐臭病、中蜂囊状幼虫病、蜜蜂白垩病和微孢子虫病。我国和其他一些国家都把美洲幼虫腐臭病和白垩病列为重点检疫的病害之一^[2]。这些幼虫性病害虽然发生在幼虫虫体上，但成年蜂是否携带还不清楚。

昆虫肠道中存在着大量正常微生物，一般认为这些微生物是寄主昆虫正常生长发育所不可缺少的。它们不仅在维生素的合成、脂肪和碳水化合物的吸收与利用中起着重要作用，而且在抵御外来菌的侵入与定殖，以及在昆虫免疫系统的功能中也起着重要作用^[3-4]。蜜蜂与细菌的共生是一种普遍存在的现象，许多共生菌对蜜蜂的生长和发育起着重要作用。Evans和Armstrong的研究表明：某些共生菌对蜜蜂主要病原细菌拟幼虫芽孢杆菌具有抑制效应，并且共生菌可能对普遍的病原体有自然的拮抗作用^[5]。此外，Gilliam研究了非致病性微生物对蜜蜂的生化贡献：例如微生物在转化、加强和保存花粉储存在蜜蜂巢房的作用；蜂群内的芽孢杆菌属产生抗真菌物质抵抗真菌疾病，例如白垩病^[6]。

本研究利用16S rRNA基因序列分析技术，对2种蜜蜂 (健康意大利蜜蜂，标记为Amlc；健康中华蜜蜂，标记为Accc) 成虫工蜂肠道可培养细菌进行了分类鉴定，并结合细菌的菌落形态观察，以及生理生化反应特征，将2种蜜蜂肠道可培养细菌鉴定到种。采用分子和常规技术相结合的方法客观、准确、全面地分析了蜜蜂成虫工蜂肠道可培养细菌的群落结构。通过研究蜜蜂成虫工蜂肠道可培养细菌群落结构组成，可为筛选潜在的益生菌奠定基础，进而改良我国蜜蜂的养殖模式，优化饲养管理、提高人工养殖蜂群的健康水平，促进蜂种的生长和发育。另外，在研究清楚肠道可培养细菌菌群结构的基础上，进一步了解肠道可培养细菌菌群与蜜蜂种类的关系，可为更广泛地理解肠道微生物菌群的功能、探索肠道菌群与宿主的共生关系以及宿主肠道内微生物的作用机理提供理论基础。

1 材料与方法 1.1 实验材料

1.1.1 蜜蜂成虫: 实验用成虫工蜂来自2种蜜蜂，分别是健康意大利蜜蜂 (Apis mellifera ligustica cultivable，Amlc) 和健康中华蜜蜂 (Apis cerana cerana Fabricius cultivable，Accc)，由江西省养蜂研究所提供，采虫后2 h内带回实验室进行肠道解剖。

1.1.2 培养基配制: NA培养基、KB培养基、NB培养基制作方法参考文献[7]。

1.1.3 引物序列: 使用的上、下游引物为细菌通用引物^[8]，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。968GClamp：5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCG GGGCGGGGGCACGGGGGGAACGCGAAGAACC TTAC-3′；L1401：5′-CGGTGTGTACAAGACCC-3′。27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-AAGTCGTAACAAGGTARCCGTA-3′。

1.1.4 主要试剂和仪器: TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒 (DP302)，北京天根生化科技有限公司；Taq DNA聚合酶、克隆T载体pMD18-T、dNTPs、琼脂糖，大连宝生物工程有限公司；PCR引物，上海立非生物技术有限公司。MyCycler ThermalCycler型PCR仪、基因突变检测仪，美国Bio-Rad公司；水平电泳仪及电泳槽，北京六一仪器厂。

1.2 研究方法

1.2.1 肠道细菌的分离: 在无菌操作下，分别选取2种蜜蜂的成虫30只，放入70%的酒精中进行虫体表面消毒2−5 min，取出虫体并用无菌水漂洗3次。在加有1 mL水的培养皿中将其解剖，取出肠道在1.5 mL EP管中加入1 mL PBS缓冲液研磨，研磨液用无菌水稀释成10⁻¹−10⁻⁶，各稀释度取0.5 mL于NA培养基、KB培养基和NB培养基平板上涂布分离，各稀释度重复3次，在30 ℃培养72 h后，选择不同生长性状的菌落进行纯化培养。每个种群各挑取100个单菌落。

1.2.2 细菌DNA抽提及16S rRNA基因片段的扩增: 采用DNA抽提试剂盒提取各细菌基因组DNA (操作步骤按说明书进行)。以各细菌抽提的DNA为模板，利用细菌通用引物968GC/L1401进行PCR扩增。30 μL PCR反应体系为：10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，5 U/μL Taq酶0.5 μL，10×PCR buffer 3.0 μL，10 μmol/L引物968GC和L1401各0.5 μL，基因组DNA 1.0 μL，加ddH₂O至30 μL。反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min；12 ℃保存。

1.2.3 PCR产物的变性梯度凝胶电泳 (DGGE) 分析: PCR产物采用Bio-Rad公司Dcode^™突变检测系统进行分析。使用8%浓度的聚丙烯酸胺凝胶，电泳缓冲液为0.5×TAE，变性剂浓度梯度30%−70% (7 mol/L尿素和40%去离子甲酰胺为100%变性)，PCR产物上样量为30 μL加5 μL 10倍的Loading buffer。在60 ℃恒温下，200 V预电泳10 min，然后85 V电泳16 h。待电泳完毕后，取下凝胶，用AgNO₃溶液染色10 min，NaOH溶液显色，待条带清晰后拿出凝胶放在白光透射仪上，数码相机拍照。

1.2.4 DGGE分离后的PCR产物的电泳条带分析及测序: 将DGGE分离到的不同条带对应的各菌株DNA，使用27F/1492R分别扩增其16S rRNA基因片段全长 (1.5 kb左右)。PCR反应体积为30 μL，反应体系同1.2.2；反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 110 s，30个循环；72 ℃ 10 min；12 ℃保存。采用Axygen公司生产的DNA凝胶回收试剂盒，对相应菌株PCR产物进行纯化，而后分别连接到pMD18-T载体上，再转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在加有氨苄青霉素 (100 mg/L) 的LB液体培养基中220 r/min、37 ℃培养过夜。采用菌液直接PCR的方法对转化后各菌株的克隆菌液进行鉴定和测序。

1.2.5 序列统计分析与系统发育树构建: 将得到的序列提交到Ribosomal Database Project Ⅱ (RDP) 数据库，利用在线检测工具CHECK-CHIMERA检测嵌合体，去除嵌合体后的有效序列通过GenBank的BLASTn程序搜索高同源序列，采用ClustalX程序进行多序列匹配排列，然后通过MEGA 4.0程序中的Neighbor-Joining (NJ) 方法、采用Jukes-Cantor计算模型构建系统发育树，bootstrap值设定为1 000。

1.2.6 序列登录号: 将所得到的2种蜜蜂可培养细菌的16S rRNA基因序列提交GenBank登记，序列号为KR269795−KR269812。

1.2.7 肠道可培养细菌的菌落形态观察: 肠道可培养细菌在固体培养基上进行纯培养，然后对其菌落特征进行观察，分别从细菌形状、革兰氏染色、芽孢有无、菌落形态、颜色、隆起度、边缘形状、表面状态、光泽、干湿情况、透明度等方面进行。

1.2.8 肠道可培养细菌的生理生化实验: 采用由法国梅里埃公司生产的ID 32E肠杆菌科和其它革兰氏阴性杆菌鉴定系统进行鉴定，具体操作参照使用说明书。

2 结果与分析 2.1 肠道可培养细菌16S rRNA基因片段的PCR扩增

采用968GC/L1401通用引物扩增且通过1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测发现，获得的细菌16S rRNA基因片段大小在400−450 bp左右，是实验所需目的片段 (图 1)。

2.2 可培养细菌的DGGE电泳及序列分析

对2种蜜蜂的200株可培养细菌的16S rRNA基因片段进行DGGE电泳分析，部分细菌电泳结果如图 2所示。

2种蜜蜂的200株可培养细菌 (其中Amlc和Accc均为100株)，经DGGE分析后，共得到18株不同的细菌 (其中Amlc和Accc中分别是7和11株)。对18株不同的细菌使用引物27F/1492R扩增其16S rRNA基因片段全长的部分结果如图 3所示。

2.3 可培养细菌的系统发育分析

系统发育分析表明，18株不同细菌分别属于肠杆菌科 (Enterobacteriaceae)、弧菌科 (Vibrionaceae) 和肠球菌科 (Enterococcaceae) 3个科。2种蜜蜂可培养细菌分属各科所占比例如图 4所示，其中Enterobacteriaceae所占比例分别为Amlc中80%和Accc中90%，为2种蜜蜂可培养细菌的最优势细菌类群。Vibrionaceae和Enterococcaceae在2种蜜蜂中只占了很少的菌株数 (每个蜜蜂种群都少于15株)。

2种蜜蜂肠道可培养细菌各个属所占比例如图 5所示。从图 5中可以看出，肠杆菌属 (Enterobacter) 所占比例最大，分别占据2种蜜蜂的60%和64%，其次为克雷伯氏菌属 (Klebsiella) 和肠球菌属 (Enterococcus)，在2种蜜蜂中所占比例分别是30%、16%和10%、12%。说明这3个属的细菌是肠道可培养细菌的优势属种类，而气单胞菌属 (Aeromonas) 在2种蜜蜂中所占的比例很小，并且只出现在Amlc中。

把2种蜜蜂中序列相似性大于97%的菌株归为相同的细菌种类^[9]，共有2组这样的细菌种类，存在于所归类的肠杆菌科 (Enterobacteriaceae) 中 (已用虚线框标出，图 6)。其中1组 (在200株可培养细菌中占据34株，所占比例为17%) 隶属于Enterobacter cloacae (CP010384.1) 和Enterobacter cloacae (CP010377.1)；另外1组 (在200株可培养细菌中占据46株，所占比例为23%) 隶属于Klebsiella pneumoniae (CP009461.1)、Klebsiella pneumoniae (CP010361.1)、Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae (CP009863.1) 和Klebsiella pneumoniae (CP008929.1)。

2.4 可培养细菌的纯培养菌落特征

2种蜜蜂的共有菌种分别只取一个代表菌株同两个种群的其余菌株，经纯培养后对其菌落特征进行了观察。结果如表 1所示。供试菌株在固体培养基上培养24 h后按照革兰氏染色法区别所有菌株。分析发现，12个细菌菌株中有10个菌株呈革兰氏阴性反应，其余2个菌株呈革兰氏阳性反应。经显微镜观察，其中10个菌体均为杆状，2个为球状。几乎全部的分离细菌都可以在37 ℃生长，培养24−48 h后菌落形态明显，但少数菌落需要72 h以后才显示出颜色特征。

2.5 可培养细菌的生理生化鉴定

经ID 32E鉴定系统得到如表 2所示的归属为肠杆菌科的各细菌生理生化特征的判读结果。从表 2中可以看出，9个试验菌株在糖分解、利用试验中多呈阳性反应，可见对碳素化合物均有较好的分解利用能力。在对醇、氮素化合物的分解利用及大分子化合物的分解试验中，不同菌株表现出了明显的差异性。

2.6 可培养细菌的菌种名称

根据供试菌株的16S rRNA基因片段全长测序、菌落形态观察和生理生化特征试验，确定了12株可培养细菌的菌种名称 (表 3)。12株可培养细菌分别是：肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae、阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae、蒙氏肠球菌Enterococcus mundtii、嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila、阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae、路德维希肠杆菌Enterobacter ludwigii、阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae、路德维希肠杆菌Enterobacter ludwigii、阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae、屎肠球菌Enterococcus faecium、阿氏肠杆菌Enterobacter asburiae和阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae。其中肠杆菌属8株、克雷伯氏菌属1株、肠球菌属2株和气单胞菌属1株。

3 讨论

研究通过变性梯度凝胶电泳技术对2种蜜蜂成虫肠道可培养细菌进行了分类鉴定，共得到18种不同的细菌遗传型，其中Amlc为7种，Accc为11种。对不同遗传型的菌株再扩增其16S rRNA基因片段全长、测序及系统发育分析后，主要归为3个科，分别为肠杆菌科 (Enterobacteriaceae)、弧菌科 (Vibrionaceae) 和肠球菌科 (Enterococcaceae)。其中肠杆菌科是肠道可培养细菌中最优势的细菌种类。研究选用变性梯度凝胶电泳对2种蜜蜂的200株可培养细菌进行了初筛，将处于同一迁移位置的条带归为相同的系统发育类型 (phylotypes) 或操作分类单元 (OTUs)^[10]。每种系统发育类型里选取1个代表菌株进行测序，由于处于相同位置的条带仅代表相同菌种，但有可能是不同类型的菌株，后续研究侧重不同类菌种对蜜蜂细菌性病害的拮抗作用，但相同菌种、不同菌株之间对蜜蜂病害的拮抗作用是否有所差别也需要进一步考虑。

对于蜜蜂肠道微生物种类的探索，国外研究者曾采用传统的培养手段进行了初步调查^{[6, 11]}。欧洲意大利蜜蜂已被报道，包含多种肠道共生菌，其中包括约1%类酵母微生物，29%的革兰氏阳性细菌，如芽孢杆菌 (Bacillus)、乳杆菌 (Lactobacillus)、双歧杆菌 (Bifidobacterium)、棒状杆菌 (Corynebacterium)、链球菌 (Streptococcus) 和梭状芽孢杆菌 (Clostridium)，以及70%的革兰氏阴性或可变的革兰氏细菌，如无色杆菌 (Achromobacter)、柠檬酸杆菌 (Citrobacter)、肠杆菌属 (Enterobacter)、欧文氏细菌属 (Erwinia)、大肠埃希氏菌属 (Escherichia)、黄杆菌属 (Flavobacterium)、克雷伯氏菌 (Klebsiella)、变形杆菌 (Proteus) 和假单孢菌 (Pseudomonas)^{[6, 11]}。Gilliam等应用纯培养方法研究了意大利蜜蜂肠道细菌，发现了肠道内细菌种类丰富并存在动态变化，其中，芽孢杆菌属Bacillusspp.、肠杆菌属Enterobacter spp.和革兰氏可变多形性细菌占优势^[12]。本研究同样证实了肠杆菌属Enterobacter spp.为2类蜜蜂肠道的优势菌群，比例高达62%。蜜蜂肠道中普遍存在肠杆菌属的革兰氏阴性菌，包括：阴沟肠杆菌 (E. cloacae)、产气大肠杆菌 (Enterobacter aerogenes) 和肺炎克雷伯菌 (K. pneumoniae)，并且肠杆菌通常出现在14日龄的成蜂肠道中^[12-14]。在成年工蜂和蜂王中，革兰氏可变多形性菌是最常见的肠道微生物^{[13, 15-16]}。本研究经鉴定得到的菌种也主要是阴沟肠杆菌 (E. cloacae) 和肺炎克雷伯菌 (K. pneumoniae)。

研究基于16S rRNA-DGGE方法对中华蜜蜂 (Accc) 和意大利蜜蜂 (Amlc) 2种蜜蜂成虫工蜂的肠道可培养细菌菌群结构进行了调查，总体来看，Accc样本所得OTU总数 (11个) 比Amlc样本所得OTU总数 (7个) 多，但核心菌群的种类大体相似。这与先前采用细菌纯培养方法对欧洲蜜蜂的研究结果^{[5-6, 17-20]}类似，也与采用T-RFLP方法对泰国东、西方蜜蜂^[21]和小蜜蜂^[22]以及欧洲熊蜂^[23]的肠道菌群研究结果相类似。尽管两个蜂种的采样时间、地点和花期都大致相似，但由于不同的采集时间、不同种类的蜜源以及不同大小的蜜蜂对一些花的采集偏好等因素影响，不同蜜蜂种类的食物分区也有所不同^[24]，因此，这可能导致引入不同的细菌到蜂箱中，也可能进入蜜蜂肠道。此外，东方蜜蜂善于采集零星蜜源^[25]，而西方蜜蜂利用大宗蜜源的能力较强，因此，尽管在同一地区同一蜜源采样，由于东西方蜜蜂获取蜜源的习惯存在差异，因而造成采集的食物多样性存在一定差异，因而可能引起两个蜂种肠道菌群的差异。另外，东、西方蜜蜂肠道菌群的多样性较其它昆虫如蚜虫、飞蛾以及甲虫低^[26-28]，这可能与蜜蜂的取食范围较窄有关 (如蜜蜂仅取食花粉和花蜜)。

根据序列相似性大于97%的菌株归为相同的细菌种类，我们找到了2种蜜蜂可培养细菌的共有菌种，再通过菌落形态特征观察和生理生化试验，确定了蜜蜂肠道可培养细菌的菌种名称。利用传统的细菌鉴定方法——形态学观察和生理生化特性分析，以及现代分子生物学方法——16S rRNA基因的PCR-DGGE技术相结合的手段鉴定细菌种类，可以使鉴定准确度提高，使结果更可信。此种方法已广泛应用于多领域^[29-31]，尤其对具有重要利用价值菌株的鉴定^[32-34]。

肠道菌群的平衡在营养、代谢和免疫功能等方面对昆虫的健康起到了重要的作用，并对昆虫健康的改善有着重要意义。从广义上来看，研究蜜蜂微生物系统 (microbial systems) 将有助于我们进一步理解蜜蜂微生态学，并在蜂群管理和疾病预防上具有潜在的应用价值；另外，这一研究的最直接意义将有助于商业养蜂中提高蜜蜂肠道微生物健康和疾病管理水平^[35]。下一步，我们将重点研究2种蜜蜂的肠道细菌，尤其是共有菌株对蜜蜂细菌性以及真菌性病害的拮抗作用。综上所述，本文通过研究蜜蜂成虫工蜂肠道可培养细菌群落结构组成，可为筛选潜在的益生菌奠定基础，进而改良我国蜜蜂的养殖模式，优化饲养管理，提高人工养殖蜂群的健康水平，促进蜂种的生长和发育。另外，在研究清楚肠道可培养细菌菌群结构的基础上，进一步了解肠道可培养细菌菌群与蜜蜂种类的关系，可为更广泛地理解肠道微生物菌群的功能、探索肠道菌群与宿主的共生关系以及宿主肠道内微生物的作用机理提供理论基础。