脂肽 (Lipopeptide，LP) 是假单胞菌和杆菌等微生物合成的生物表面活性剂，可影响细胞生长、运动、生物膜合成等功能，对多种植物和人类病原体如病毒、支原体、锥虫、细菌、真菌和卵菌具有广谱的拮抗作用，具有重要的医药开发潜力^[1-3]。其中，由玫瑰孢链霉菌合成的达托霉素 (Daptomycin) 是第一种商业化的脂肽类抗生素，对革兰氏阳性病原菌包括一些耐药菌具有良好的抗菌作用，可抑制葡萄球菌、肠球菌的生长和繁殖，其疗效与安全性均较好^[4]。

脂肽的结构具有显著的多样性，除氨基酸个数、种类和成环的位置不同外，其脂肪酸链的长度也有差异，一些还带有羟基。根据这些差异可将脂肽分为多种类型，每个类型中因其氨基酸组成的细微差异又分为数个亚型。脂肽中少量为线性脂肽，多数可形成内酯环，称为环脂肽 (Cyclic lipopeptide，CLP)，其分子由脂肪酸连接多肽环构成^{[3, 5]}。研究发现，脂肽合成蛋白一般由多个模块组成，每个模块负责合成脂肽分子中的一个氨基酸，且其序列具有较高的同源性^[2]。基于这种规律，可研究脂肽合成蛋白中不同模块对应的基序 (motif)，通过聚类分析预测脂肽的氨基酸种类^[6-8]。研究表明，脂肽对假单胞菌和杆菌生物膜的形成具有重要影响，但不同类型脂肽的作用效果相差很大；另外，生物表面活性剂可改变物体表面的黏度，影响细胞分裂和运动。在植物相关环境下，微生物合成的表面活性剂可作为叶片表面疏水角质层的润滑剂，不仅可以促进细胞运动，还有利于物质的溶解和扩散^[9]。

绿针假单胞菌 (Pseudomonas chlororaphis) HT66是本实验室从水稻根际分离的生防菌株，其主要代谢产物为吩嗪-1-甲酰胺 (Phenazine-1-carboxamide，PCN)，即一种高效和广谱的抗真菌剂。此外，该菌株可合成铁载体Pyoverdine (Pvd) 和Achromobactin (Acr)、杀虫蛋白FitD (P. fluorescens insecticidal toxin) 和氢氰酸 (HCN) 等产物，具有良好的生物防治潜力^[10]。经生物信息学分析，该菌株基因组中存在一个完整的脂肽合成基因簇 (clpABC)，但该脂肽物质的种类和功能并不清楚。文献调研发现，虽然目前有许多微生物合成脂肽的报道，但至今未见绿针假单胞菌中脂肽化合物的研究；在数株绿针假单胞菌的基因组学研究中，也仅发现菌株HT66具有脂肽合成基因簇^[10]。因此，在绿针假单胞菌中进行脂肽物质鉴定与功能的研究，不仅有助于了解菌株HT66的生物防治机制，还可以拓展人们对绿针假单胞菌中脂肽结构和功能的认识。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒: 实验所用的菌株和质粒见表 1。

1.1.2 培养基及菌株生长条件: LB培养基 (g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10，pH 7.0，固体培养基中含14 g琼脂粉；KB培养基 (g/L)：蛋白胨20.000，甘油18.915，磷酸氢二钾0.514，硫酸镁0.732，pH 7.5。发酵时，分装至250 mL挡板瓶中，装液量为60 mL，设置3组平行实验；1×10⁵ Pa灭菌20 min。抗生素用量 (mg/L)：硫酸卡那霉素 (Kan) 50，氨苄青霉素钠 (Amp) 100。大肠杆菌在37、180 r/min振荡培养；假单胞菌在28、180 r/min振荡培养。

1.1.3 主要试剂及仪器: 核酸分子实验按常规方法操作。PrimeSTAR DNA聚合酶、限制性内切酶和DNA Ligation Kit Ver.2.1，宝生物工程 (大连) 有限公司；2×Taq Master Mix，南京诺唯赞生物科技有限公司；基因组DNA提取采用Genomic DNA Kit，质粒抽提采用Plasmid MiniPrep Kit，电泳凝胶片段回收采用Quick Gel Extraction Kit，酶切产物纯化采用PCR Purification Kit，北京全式金生物技术有限公司。IPTG和X-gal，生工生物工程 (上海) 股份有限公司。超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用仪 (UPLC/QTOF-MS)，Waters ACQUITYTM UPLC & Q-TOF MS Premier。蛋白序列分析和系统发育树构建使用BioEdit 7.2.5。

1.2 脂肽合成蛋白的聚类分析

选取绿针假单胞菌HT66中脂肽合成蛋白序列和其他假单胞菌中已知结构的脂肽合成蛋白序列进行模块分析，构建系统发育树；根据待预测模块序列的同源性和所处位置确定对应的氨基酸及其排列顺序。蛋白序列的确定参照文献[7]。

1.3 脂肽合成基因簇缺失株构建

依据菌株HT66全基因组序列进行引物设计。扩增脂肽合成基因簇clp上游同源臂的引物对为：clp-F1：5′-CGGAATTCAGCATCTTCGCCGCAAA CAG-3′ (EcoR Ⅰ)；clp-R1：5′-CCGGGATGAATGGGTAGTCG-3′。扩增clp下游同源臂的引物对为：clp-F2：5′-ACTACCCATTCATCCCGGCGGGCTATGGATGGGTTCG-3′；clp-R2：5′-CGGATCCTGGAGATCGCCGCGTCTTC-3′ (BamH Ⅰ)。PCR体系和程序参照文献[7]进行。基因组DNA提取、质粒抽提、电泳凝胶片段回收、酶切、产物纯化和连接等均按试剂盒说明书进行操作。采用同源重组的无痕敲除方法对相关序列进行突变株构建，相关方法参照文献[12]。以菌株HT66基因组为模板，使用clp-F1和clp-R1、clp-F2和clp-R2分别扩增脂肽合成基因簇上、下游同源臂。将产物纯化，作为模板，用引物clp-F1和clp-R2扩增获得融合片段。将融合片段和质粒pK18mobsacB酶切并连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，进行蓝白斑筛选和PCR验证，测序正确后，获得重组质粒pK18-clp。抽提质粒，转化大肠杆菌S17感受态细胞，在Kan、Amp双抗培养基中与菌株HT66共培养，获得接合转移的单交换菌株。将菌液稀释，涂布于含10%蔗糖的LB平板上，分别在LB和含Kan的LB平板中进行影印筛选，仅能在LB平板中生长的为双交换菌株。最后，使用clp-F1和clp-R2进行筛选，可扩增出与融合片段条带一致者为菌株HT66的脂肽合成基因缺失突变株HT66Δclp。

1.4 脂肽产物的质谱分析

使用氯仿-甲醇 (2:1，体积比) 溶液抽提脂肽产物，取有机相并用氮气吹干^[13]。粗提物以乙腈溶解，过滤后用UPLC/QTOF-MS检测。色谱柱为Waters CORTECS 1.6 μm (2.1 mm×100 mm)，柱温为45，进样量为1 μL，流速为0.4 mL/min，检测波长为254 nm和210 nm；梯度洗脱条件为：0 min，水95%，乙腈5%；1.5 min，水80%，乙腈20%；3.5 min，水60%，乙腈40%；5 min，水40%，乙腈60%；7 min，水15%，乙腈85%；8−11 min，乙腈100%；11.5−13 min，水95%，乙腈5%。选用正离子化模式，分子量范围为50−2 000。

1.5 生长曲线的绘制和PCN产量的测定

菌株活化后，接种至KB培养基中，初始OD₆₀₀值为0.02，培养并取样，方法见1.1.2，使用分光光度计检测OD₆₀₀值；样品制备后，使用高效液相色谱 (HPLC) 测定PCN产量。HPLC使用的色谱柱为WondaSil-WR C-18反相柱5 μm (4.6 mm×250 mm)。样品制备方法和PCN的HPLC检测条件参照文献[14]。

1.6 生物膜的分析

菌株活化后，在24孔板中静置培养48 h，吸去菌液后，以结晶紫对生物膜进行染色，然后乙醇脱色并用酶标仪检测脱色液的OD₆₀₀值。具体方法参照文献[15]。

1.7 群集运动分析

在运动性检测平板上进行菌株的群集运动实验，相关操作参照文献[16]。

2 结果与分析 2.1 脂肽结构的预测

蛋白序列分析发现，菌株HT66的脂肽合成蛋白含有9个模块，表明合成的脂肽产物由9个氨基酸组成。从NCBI数据库中找到了4株能合成脂肽且其分子结构已鉴定的假单胞菌 (表 2)，共收集脂肽合成基因簇中的39个模块序列及其对应的氨基酸种类，与菌株HT66的脂肽合成基因簇一起建库，构建系统发育树 (图 1)，分析各个模块中的保守序列。

由图 1可知，脂肽分子中相同氨基酸呈现了较好的聚类关系，因此我们推测菌株HT66所产脂肽的氨基酸序列应为L-Leu-D-Glu-D-allo-Thr-D-Val-L-Leu-D-Ser-L-Leu-D-Ser-L-Ile，与文献报道的脂肽化合物Viscosin的氨基酸种类及顺序^{[3, 5, 9]}一致。

2.2 脂肽缺失突变株HT66Δclp的构建

为进一步鉴定菌株HT66脂肽产物的结构，构建了菌株HT66的脂肽合成基因缺失突变株HT66Δclp。在突变株中，可用clp-F1和clp-R2扩增出长约1 kb的clp上下游同源臂融合片段，而在野生株基因组中该对引物间的序列长达33 kb，无法使用PCR扩增出特异性片段，这表明突变株构建成功 (图 2)。

2.3 脂肽的质谱鉴定

将菌株HT66和HT66Δclp分别在KB培养基中发酵，取24 h发酵液抽提脂肽粗提物，以UPLC/QTOF-MS进行分析，结果如图 3所示。当使用芳香环化合物的特征波长254 nm进行检测时，菌株HT66和HT66Δclp的脂肽分析谱图未发现明显差异 (图 3中A1、A2)，说明该脂肽化合物不含芳香族氨基酸。当使用210 nm波长进行检测时，野生型在约7.7 min处有一吸收峰 (图 3中B1)，而菌株HT66Δclp的分析谱图中无该峰 (图 3中B2)，推断该物质为脂肽。此外，从基峰离子色谱图 (BPI) 则可明显发现，野生型在7.7 min处存在一个较高的离子峰 (图 3中C1)，而菌株HT66Δclp则没有该峰 (图 3中C2)，说明其很可能是脂肽离子化后形成的离子峰。

提取该峰的质谱图 (图 3中D) 发现，该物质最大丰度的质荷比 ([M+H]⁺) 为1 126.713 7，而根据数据库预测，该产物的最大丰度质荷比 ([M+H]⁺) 应为1 126.70 (100%)，其次为1 127.70 (64.0%) 和1 128.71 (19.0%)，与文献报道Viscosin的质谱信息相符合^[8](图 3中E)，表明菌株HT66合成的脂肽物质应为Viscosin。

2.4 脂肽对菌株HT66生物学功能的影响

将菌株HT66和HT66Δclp在相同条件下培养，分别测定其生长曲线 (图 4A) 和PCN产量 (图 4B)。可见，脂肽合成基因缺失后，菌株HT66的生长没有明显差异，但稳定期菌体量更高。此外，脂肽缺失后，PCN合成量显著减少，在48 h时约减少22.7%。

为考察脂肽对菌株HT66生物膜形成的影响，以新鲜培养基作为对照，测定菌株HT66和HT66Δclp的生物膜形成能力，结果如图 5所示。相比野生型，敲除脂肽合成基因簇后，菌株HT66生物膜形成量大幅减少，约为野生型的49.3%。

在运动性平板上检测菌株HT66和HT66Δclp的群集运动情况，结果如图 6所示。可见二者菌苔形态类似，均呈现分枝状，并带有晕圈，但脂肽缺失后，运动半径减小，表明菌株HT66群集运动能力明显下降。

3 讨论

本文通过生物信息学手段推测脂肽产物为Viscosin，然后通过无痕敲除构建菌株HT66的脂肽合成基因簇缺失株HT66Δclp，对比突变株与野生株的UPLC/QTOF-MS信息，认为该菌株的脂肽产物为Viscosin。

Viscosin最初由Kochi等在1951年分离于P. viscosa菌株并公布了结构^[18]，该物质具有良好的抗病毒能力，可保护胚卵免受支气管病毒感染，并能抑制小鼠中甲型流感病毒感染^[19]。1971年，Hiramoto等修正了该物质的结构^[20]。Viscosin的结构为FA (β-OH)-L-Leu-D-Glu-D-allo-Thr-D-Val-L-Leu-D-Ser-L-Leu-D-Ser-L-Ile^{[3, 5, 9]}，分子式为C₅₄H₉₅N₉O₁₆，分子量为1 126.38，表面张力为26.5 mN/m，临界胶束浓度 (Critical micell concentration) 为0.15 g/L^[21]。除P. fluorescens BBc6R8外，P. fluorescens SBW25^[22]、A7B^[23]、P. libanensis M9-3^[24]等菌株均可合成该物质。

脂肽不仅是假单胞菌的重要代谢产物，对细菌的代谢和表型也具有调控作用，但是脂肽对假单胞菌生长和吩嗪合成的影响未见报道。因此，我们研究了该产物对菌株HT66生长、PCN合成、生物膜形成和群集运动性的影响。研究发现，脂肽对菌株HT66生长的影响不显著，但脂肽合成基因缺失后，PCN产量显著下降，说明脂肽对假单胞菌次级代谢产物合成具有重要的调控作用，其机理可能在于脂肽可改变产物在培养基中的溶解度，以及改变培养基的表面张力，从而影响细菌代谢。

脂肽对不同假单胞菌生物膜的影响各异^[9]。如P. putida PCL1445、267缺失Putisolvin^{[9, 25]}、Pseudomonas sp. MIS38缺失Arthrofactin^[17]会导致生物膜水平提高，P. protegens Pf-5缺失Orfamide^[7]不会对生物膜形成造成明显影响，而P. fluorescens SS101缺失Massetolide A^{[9, 26]}、P. fluorescens SBW25缺失Viscosin^[8]则会导致生物膜水平下降。生物膜对细菌生存和功能具有重要意义，如在条件致病菌铜绿假单胞菌PAO1中，生物膜与细菌毒性有重要关联，且高强度的生物膜是细菌耐药的主要因素^[27]。敲除菌株HT66的脂肽合成基因后，生物膜量降低，这一结果可以扩充人们对脂肽乃至生物表面活性剂对假单胞菌生物膜形成影响的认知。

脂肽对假单胞菌的运动有促进作用，如P. protegens Pf-5缺失Orfamide^{[7, 28]}、P. putida PCL1445缺失Putisolvin^[25]会导致细菌运动能力下降，P. fluorescens SS101缺失Massetolide A^[26]、P. fluorescens SBW25缺失Viscosin^[8]，Pseudomonas sp. MIS38缺失Arthrofactin^[17]、P. syringae pv. tomato DC3000缺失Syringafactin^[29]则会导致细菌运动能力丧失。这些结果表明，脂肽类生物表面活性剂可改变物体表面黏度，促进菌体运动，对菌株在天然环境中的生存至关重要。在菌株HT66中，脂肽对菌体运动同样具有明显的促进作用。

本研究首次在绿针假单胞菌HT66中鉴定了脂肽产物Viscosin的结构并对其进行了功能验证，对了解菌株HT66的生防功能和研究绿针假单胞菌脂肽产物的合成与调控具有重要意义，同时可丰富我们对脂肽生物学功能的认识。由于Viscosin具有一定的生理和临床研究价值，本研究也为其应用和开发提供了参考。