微生物种间电子传递 (Inter species electron transfer，IET) 是地球表层生态系统中元素循环的核心驱动力之一。在长达近半个世纪之久的传统知识体系里，厌氧产甲烷体系中细菌与产甲烷古菌之间的种间电子传递，自发现以来就一直被认为是通过氢气作为媒介来进行的，随后甲酸也被发现具有类似的功能^[1]。直到2010年，美国麻省大学Amherst分校Derek Lovley教授实验室报道了一种新的种间电子传递模式——微生物种间直接电子传递，该领域的研究进入一个新的阶段。

2012年，Liu等在Lovley教授的指导下提出并证实了细菌与产甲烷古菌之间通过种间直接电子传递产甲烷的新机制，研究表明导电的活性炭颗粒不仅能够促进互营养细菌之间进行直接电子传递，而且也能促进细菌Geobacter metallireducens与产甲烷古菌Methanosarcina barkeri之间的直接电子传递^[2]；2014年，Rotaru等进一步证实了细菌G. metallireducens与产甲烷古菌Methanosaeta harundinacea之间，在不依赖活性炭颗粒等导电材料的条件下，通过直接电子传递还原CO₂产甲烷的机制^[3]。除此之外，产甲烷古菌M. barkeri也具备直接从细菌G. metallireducens获得电子的能力^[4]。本实验室目前已报道第3株产甲烷古菌。Methanosarcina mazei能够与Geobacteraceae共同形成进行DIET所必需的团聚体结构，暗示其中DIET存在的可能性^[5]。

异化铁还原菌Geobacter和Shewanella属于革兰氏阴性菌，是研究DIET的模式菌株，在厌氧环境中广泛存在。革兰氏阴性菌胞外电子传递的研究广泛，主要集中于变形菌门 (Proteobacteria)，如α-变形菌纲的沼泽红假单胞菌 (Rhodopseudomonas palustris)^[6]、β-变形菌纲的铁还原红螺菌 (Rhodoferax ferrireducens)^[7]、γ-变形菌纲的希瓦氏菌 (Shewanella spp.)^[8]、δ-变形菌纲的地杆菌 (Geobacter spp.)^[9]。然而，目前已知能够直接传递电子给产甲烷古菌的细菌仅限于革兰氏阴性菌G. metallireducens，革兰氏阳性菌 (如Clostridium spp.) 与产甲烷菌之间是否能够进行直接电子传递尚不明确。

微生物的胞外电活性表现在能够将代谢底物产生的电子从胞内转移到细胞表面，再通过直接电子传递或电子穿梭体等方式传输给胞外电子受体，该过程中存在胞外电子传递。目前已报道的厚壁菌门丁酸梭菌 (Clostridium butyricum) 和芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 都是具有胞外电活性的革兰氏阳性菌，其中C. butyricum在微生物燃料电池中能够以葡萄糖为底物产生电流，最大电流可达0.22 mA^[10]；B. subtilis也能够通过分泌电子穿梭体与电极进行胞外电子传递，发挥产电作用^[11]。这说明此类具有胞外电子传递能力的革兰氏阳性菌可能存在微生物种间电子传递。

基于前期研究发现界河沉积物中铁还原菌除了Geobacter以外，还包括Clostridium spp.和Bacillus spp.等革兰氏阳性菌^[5]，因此本研究拟采用Hungate厌氧滚管法从沉积物铁还原富集培养中获得产甲烷分离物，进而分析其中革兰氏阳性菌与产甲烷菌之间存在直接电子传递的可能性。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 样品采集: 沉积物样品采集于招远市界河 (N37°05′−N37°33′，E120°08′−E120°38′) 河口流域。界河沿西北方向汇入我国渤海莱州湾，属于典型的滨海河口地区。收集表层沉积物 (0−5 cm)，保存于4，用于后续富集培养的研究。

1.1.2 培养基: 铁还原富集培养采用淡水富集培养基FWE^[12](g/L)：NaHCO₃ 2.500，CaCl₂·2H₂O 0.100，KCl 0.100，NH₄Cl 1.500，NaH₂PO₄ 0.600，NaCl 0.100，MgCl₂·6H₂O 0.100，MgSO₄·7H₂O 0.100，MnCl₂·4H₂O 0.005，Na₂MoO₄·2H₂O 0.001，CH₃COONa 2.700，酵母提取物0.050，调节pH为7.0后添加100 mmol/L的无定形铁 (配制方法参考文献[12])。产甲烷培养基采用DSMZ120，配方参考文献[13]，添加25 mmol/L的乙酸或乙醇为底物。

1.1.3 主要试剂和仪器: 透析袋 (MWCO：8 000−14 000 D，宽度：4.4 cm) 和氨苄青霉素购自索莱宝生物科技有限公司；DNA提取试剂盒FastDNA^TM SPIN kit for soil购自MP Biomedicals公司；TIANGEN纯化试剂盒购自天根生化科技有限公司；Taq DNA聚合酶、限制性内切酶MspⅠ、Taq Ⅰ、pMD18-T载体购自大连宝生物工程有限公司；感受态细胞Trans1-T1购自北京全式金生物技术有限公司；菲啰嗪、HEPES试剂购自BB International Life Sciences公司；引物合成及测序由英潍捷基 (上海) 贸易有限公司完成。气相色谱Agilent 7890A、高效液相色谱Agilent 1260 Infinity购自安捷伦科技有限公司；数据采集系统Model 2700购自美国吉时利仪器公司；660E电化学工作站购自上海辰华仪器有限公司；微生物燃料电池所用的阳离子交换膜Ultrex CMI-7000购自Membranes International公司。

1.2 富集培养

产甲烷分离物 (S6) 的获得：首先将沉积物接种到培养基FWE^[12]中进行铁还原富集培养；富集培养后，采用Hungate厌氧滚管法，挑取产甲烷菌菌落，在产甲烷培养基DSMZ120^[13]中以乙酸为底物进行培养，发现存在多种群落结构；然后将此群落转入25 mmol/L乙醇为底物的产甲烷培养基DSMZ120，构建产甲烷共培养体系。

培养菌群所用的培养基分装至100 mL规格的西林瓶中，每瓶40 mL，采用实验室自制的厌氧气站曝气30 min (80% N₂+20% CO₂)，用硅胶塞密封瓶口，加盖铝盖。将0.15 MPa灭菌后的培养基置于厌氧操作台中，每瓶接种0.5 g沉积物样品，再次密封瓶口，在30黑暗条件下静置培养。培养30 d左右接种10%−20%进行传代培养。Hungate厌氧滚管法：用无菌注射器取对数生长中后期的铁还原富集培养物0.5 mL，接种到半固体培养基DSMZ120中，加入氨苄青霉素至1 g/L抑制杂菌生长；将培养基置于冰上滚管，使其凝固后均匀贴附于管壁，置于37黑暗条件下培养2−4周。待试管壁上长出肉眼可见的菌落后，在厌氧操作台中挑取白色或黄色半透明圆形的产甲烷菌菌落，接种到含有新鲜培养基的试管中，培养2−4周。筛选有甲烷产生的试管，以乙酸为底物进行传代培养，更换乙醇为电子供体获得产甲烷分离物。

共培养体系的建立：产甲烷分离物S6与G. metallireducens共培养称为G-S6。在DSMZ120培养基中以25 mmol/L乙醇为唯一电子供体培养S6和G-S6，设置添加或不添加100 mmol/L无定形铁的两种试验组，比较两者的铁还原能力和产甲烷能力。

1.3 DNA提取及T-RFLP分析

采用试剂盒FastDNA^TM SPIN kit for soil，根据说明书标准流程提取富集物的DNA。参考Zheng等^[6]的方法进行T-RFLP分析，以DNA为模板，细菌引物对为Ba27f/Ba907r和古菌引物对为Ar109f/Ar915r进行PCR^[6]，其中引物Ba27f的5′端和Ar915r的3′端标记6-羧基荧光素 (FAM)。PCR反应条件为：94；94，55，72，25个循环；72。PCR产物经纯化后，古菌用TaqⅠ酶、细菌用Msp Ⅰ酶进行酶切，酶切产物送英潍捷基 (上海) 贸易有限公司完成测序。特异T-RF相对丰度采用每个T-RF峰高值与总T-RFs峰高值的百分数计算，每个样品重复3次。

1.4 克隆文库的构建

以DNA为模版，采用无荧光标记的细菌引物对Ba27f/Ba907r和古菌引物对Ar109f/Ar915r进行PCR^[6]，基因片段切胶纯化后连接在T载体上，转化感受态细胞Trans1-T1培养。随机选取一定数量的克隆子进行菌落PCR。阳性克隆由英潍捷基生物技术公司测序。将测定的目的基因片段序列采用DNAStar 7.0和DNAMAN 8.0进行序列分析，用Blast的方法与基因库中的序列进行比对，所得序列同时用DNAMAN 8.0软件进行模拟酶切分析。将克隆序列及其相似性最高的序列采用Mega 6.0软件Neighbor-joining方法进行系统进化树的构建，并进行Bootstrap分析，重复1 000次。序列数据提交GenBank获取登录号，细菌序列登录号为KU933361−KU933364、KU933366、KU933371、KU933372、KU933374；古菌序列登录号为KT008244、KT008245、KT008259、KT008262。

1.5 MFC的构建及运行

设置H型的双室微生物燃料电池 (Microbial fuel cell，MFC)，中间由阳离子交换膜隔开。阴阳极均采用长方体石墨电极 (3.5 cm×2.5 cm×0.5 cm，投影面积为17.5 cm²)，通过钛导线与外电路相连，添加1 000 Ω的外电阻。组装好的MFC经过0.15 MPa灭菌后，阳极室加入100 mL无菌的DSMZ120 (pH 7.0) 培养基，以乙醇为底物，充气1 h (80% N₂+20% CO₂)；阴极室加入100 mL无菌的Tris-HCl (0.1 mol/L，pH 7.0) 溶液，氧气为电子受体。培养10 d左右阳极更换20%除氧的新鲜培养基并补充底物，保证微生物燃料电池持续运行。实验组 (a) 接种5%的产甲烷分离物S6；实验组 (b) 用透析袋包裹阳极，将S6接种在透析袋外部，透析袋将在物理上阻断微生物和电极的直接接触，防止电极表面形成生物膜；同时设置对照组 (c) 不接种微生物。所有MFCs都在室温黑暗条件下培养。

1.6 电化学数据分析

MFC运行时用数据采集系统采集电压信号，ExcellLINX软件记录每分钟的输出电压，根据欧姆定律计算电流密度[C_den=U/(RA)，C_den (mA/m²) 为电流密度，其中U是电池输出电压 (mV)，R是外阻 (Ω)，A是阳极投影面积 (m²)]。采用循环伏安法CV (Cyclic voltammetry) 测试微生物在MFC中的氧化还原特性，在稳定运行的MFC开路状态下加入参比电极 (Ag/AgCl)，以阳极为工作电极，阴极为对电极，构建三电极体系。用660E电化学工作站以10 mV/s的扫描速度在−0.45−0.35 V的范围内进行扫描。

1.7 检测方法

1.7.1 Fe (Ⅱ) 测定方法: 培养液中Fe (Ⅱ) 含量测定采用Ferrozin试剂显色法^[14]。培养过程中每5 d用无菌注射器取出0.5 mL样品，置于4.5 mL的0.5 mol/L的盐酸中，室温下静置24 h。在转速8 000 r/min下离心5 min，取上清100 μL，加入到1.9 mL的含0.1%菲啰嗪 (Ferrozin) 的200 mmol/L的HEPES缓冲液中，反应5 min后，在562 nm波长下紫外分光光度计测定吸光度。最后根据标准曲线计算Fe (Ⅱ) 浓度。

1.7.2 气相、液相色谱检测: 每5 d用无菌注射器抽取厌氧培养瓶上空的气体，采用配备FID检测器的气相色谱测定甲烷产量。体系中的乙醇、乙酸浓度用高效液相色谱定期检测：取1 mL菌液10 000 r/min离心2 min，用移液枪吸取20 μL上清，加入980 μL无菌水中，稀释50倍。稀释后的液体经0.22 μm孔径滤膜过滤，然后上机检测。

2 结果与分析 2.1 产甲烷分离物S6的获得

沉积物经铁还原富集培养后，采用Hungate厌氧滚管法挑取单菌落，接种于乙醇为电子供体的液体培养基 (DSM120) 中静置培养，发现生长到一定阶段会出现肉眼可见的团聚体。实验室已发表的文章^[5]中描述，将培养物的电子供体由乙酸更换为乙醇时出现团聚体，且团聚体的结构相对紧密。而本研究结果与之有所不同，在乙醇作为电子供体的培养条件下出现的微生物团聚体结构相对松散，而且随着培养时间的延长会发生解聚 (图 1)。经气相色谱仪检测发现此分离物能够产生大量的甲烷气体，我们将获得的这种产甲烷分离物命名为S6。

2.2 S6及共培养G-S6的铁还原及产甲烷能力

在研究产甲烷分离物S6是否存在直接电子传递时，将S6和已知能与产甲烷菌进行直接电子传递的G. metallirenducens共同培养，该体系命名为G-S6 (G代表G. metallirenducens，S6代表产甲烷分离物)。S6和G-S6富集培养30 d的铁还原和产甲烷情况如图 2所示。S6和G-S6都表现出铁还原能力，并且在第10天Fe (Ⅱ) 生成量同时达到最大值，分别为1.190±0.015 mmol和1.470±0.044 mmol。其中S6的铁还原速率为0.115 mmol/d，G-S6的最大铁还原速率为0.181 mmol/d。无菌对照组在非生物作用下培养30 d共产生0.140 mmol左右的Fe (Ⅱ)，说明培养过程中Fe (Ⅲ) 还原是由于微生物的作用。由图 2A可知，G. metallirenducens的加入并没有使Fe (Ⅲ) 还原速率有明显的加快。

在第25天时S6的甲烷量最高达到0.550±0.018 mmol，添加无定形铁的S6甲烷量最大值为0.580±0.004 mmol，产甲烷速率分别为0.074 mmol/d和0.066 mmol/d。添加无定形铁使G-S6的产甲烷启动时间延长，第10-15天产甲烷速率达到最大0.054 mmol/d，最高甲烷量为0.560±0.017 mmol；而不添加无定形铁时，产甲烷速率在第5−10天内最大为0.049 mmol/d，产甲烷量最大值为0.510±0.002 mmol。由图 2B可知，添加G. metallireducens并没有提高产甲烷速率。

乙醇作为底物在10 d内消耗殆尽，添加无定形铁促进G-S6利用乙醇，而不添加无定形铁降低G-S6对乙醇的消耗。乙醇用尽后，Fe (Ⅱ) 不再增加。随着乙醇的消耗产生中间产物乙酸，伴随着乙酸的积累产甲烷速率显著提高，乙酸耗尽后甲烷产量也不再增加。S6培养时最高有0.38 mmol的乙酸积累；G-S6培养时乙酸积累量为0.57 mmol (图 2C、D)。

S6与G. metallireducens共培养后，铁还原能力和产甲烷性能并没有明显增加，说明S6中含有的铁还原微生物与G. metallireducens具有类似的作用，能够以乙醇为唯一电子供体与产甲烷菌进行直接电子传递产甲烷。

2.3 微生物群落多样性

富集分离到S6与共培养G-S6在乙醇底物条件下培养，采用T-RFLP及克隆文库分析其中的微生物群落多样性。S6样品中细菌T-RF片段主要包括210、90、525 bp，分别占47%、29%、24%；共培养G-S6中，525 bp和160 bp分别以49.85%和50.15%的比例在细菌群落中占优势 (图 3A)。通过克隆文库分析，210 bp和525 bp T-RFs代表Clostridiaceae，90 bp T-RF代表Bacteroidaceae。

将克隆序列及其同源序列进行系统发育分析 (图 3B)，525 bp T-RF序列与Clostridium tunisiense相似性最高，达到98.65%；210 bp T-RF序列与Clostridium hathewayi相似性达到91.83%；90 bp T-RF序列与Bacteroides sp. Z4相似性最高达到98.67%；160 bp T-RF为共培养中添加的G. metallireducens。

同样，采用T-RFLP及克隆文库分析古菌的群落多样性。古菌T-RF片段以188 bp和172 bp为主，在S6中分别占41%和59%，在G-S6中分别占63%和37% (图 4A)。188 bp T-RF代表Methanosarcinaceae，172 bp T-R未知。系统进化树分析，188 bp T-RF序列与M. barkeri同源性最高达到98.49%。

综上所述，S6中细菌以Clostridium spp.为主，共培养G-S6中Clostridium spp.和G. metallireducens占优势，古菌都为M. barkeri。

2.4 产甲烷分离物的电活性

通过微生物燃料电池研究S6的电活性，电化学工作站记录输出电压，计算电流密度。MFC实验组和对照组的产电性能如图 5所示，其中实验组a：阳极培养S6；b：阳极包裹透析袋后培养S6；对照组c：非生物阳极。实验组a经过前3 d的稳定期开始启动，此时随着微生物生长在阳极形成生物膜电流密度逐渐增加，第4天时电流密度升高到9.68 mA/m²，第4−8天内产电性能基本稳定，运行8 d之后电流密度下降；实验组b阳极包裹透析袋后微生物无法形成生物膜，S6的产电启动期延长，第6天电流密度达到1.46 mA/m²，远低于实验组a，并且稳定时间很短；非生物阳极对照组c几乎没有电流产生。阳极生物膜的形成促进微生物和电极之间的直接电子传递，透析袋阻碍生物膜形成，但也有微弱电流产生，说明非生物膜的原因如微生物自身分泌的电子穿梭体也能介导电子传递。

MFC周期结束后，添加Ag/AgCl参比电极，对实验组和非生物阳极分别进行循环伏安扫描分析，比较氧化还原反应的强弱。设置10 mV/s的扫速在−0.45−0.35 V的电势窗口下扫描，结果如图 6所示。由循环伏安曲线可知，非生物阳极不存在氧化还原峰，说明氧化还原反应是由微生物作用产生的。实验组a在0 V出现氧化峰，−0.225 V出现还原峰。实验组b在−0.206 V电势下出现还原峰，峰电流小于实验组a，没有明显的氧化峰。说明S6在MFC中可能存在直接电子传递途径，并且能氧化还原性的电子穿梭体。

根据产电性能及循环伏安结果分析，产甲烷分离物S6可能存在直接电子传递途径还原电极产生电流，也暗示其中占优势的Clostridium和M. barkeri之间也可能存在潜在的直接电子传递。

3 讨论

近年来有关种间直接电子传递的研究多集中于革兰氏阴性菌，尤其是以Shewanella和Geobacter为代表的异化铁还原菌，革兰氏阳性菌在种间直接电子传递中的研究尚未见报道。本工作揭示了Clostridium为代表的革兰氏阳性菌在产甲烷分离物中，可能与M. barkeri存在种间直接电子传递。

Rotaru等已报道革兰氏阴性菌G. metallireducens可以与M. harundinacea和M. barkeri通过种间直接电子传递机制还原CO₂产甲烷。本实验室Zheng等从滨海沉积物中富集到Geobacteraceae与M. mazei共存群落，根据富集物形成团聚体推测可能存在直接电子传递^[5]。Shewanella可以通过分泌黄素类^[15-16]电子穿梭体介导直接电子传递。另一种革兰氏阴性菌Klebsiella pneumoniae不仅可以利用外膜细胞色素c进行胞外电子传递^[17]，当电极与微生物用微孔滤膜隔开时，还可以分泌醌类电子穿梭体介导电子传递^[18]。而有关革兰氏阳性菌胞外电子传递的研究较少，由于其细胞壁结构紧密，含有大量不导电的肽聚糖，由糖蛋白S层包裹，脂蛋白较少，这些特征都是革兰氏阳性菌进行胞外电子传递的壁障。近年来具有电极还原活性的革兰氏阳性菌逐渐被发现，Nimje等首次将Bacillus subtilis在MFC中培养3月后获得了稳定高效的产电能力，最高输出电压370 mV^[11]。Wrighton等在MFC阳极分离到一株Thermincola potens，能将电子穿过细胞壁传递到细胞表面，再通过直接接触传递给电极，并且发现c型细胞色素在革兰氏阳性菌的电子传递中起重要作用^[19]。另一种革兰氏阳性菌Carboxydothermus ferrireducens在还原胞外金属时与电子传递相关的c型细胞色素高表达^[20]。

Clostridium属于革兰氏阳性菌，研究发现Clostridium perfringens具有Ⅳ型菌毛介导粘附和运动，其菌毛亚基PilA2与革兰氏阴性菌Pseudomonas aeruginosa结构相似^[21]。菌毛这一结构特性为Clostridium形成生物膜、与其他微生物团聚、分泌蛋白、作为“纳米导线”介导电子传递提供了可能^[22-23]。梭菌含有铁氧还蛋白，能在低氧化还原电位下作为电子载体还原细胞色素c，这也可能是梭菌能够进行胞外电子传递的原因之一^[24]。Park等在废水处理微生物燃料电池中分离得到一株Clostridium butyricum，循环伏安法扫描发现该菌具有电活性^[10]。在许多厌氧产甲烷体系中，都发现Clostridium存在，甚至占主要地位，但人们普遍认为梭菌起到发酵作用^[25-27]，重点关注Geobacter等革兰氏阴性菌与产甲烷菌之间的DIET^[25]，或者梭菌与氢营养产甲烷菌通过种间氢气传递互营产甲烷^[28]，很少有研究者将Clostridium与直接电子传递产甲烷联系起来。我们发现在Clostridium和M. barkeri占优势的产甲烷富集物中，乙醇为唯一电子供体时能够产甲烷，共培养添加G. metallirenducens后铁还原和产甲烷能力并没有明显增加，说明Clostridium与G. metallirenducens类似，在互营产甲烷过程中与M. barkeri可能通过种间直接电子传递产甲烷。微生物紧密接触是发生种间直接电子传递的条件之一，培养过程中团聚体的出现也间接说明可能存在直接电子传递方式^[29]。团聚体短暂形成随后又解聚，可能因为乙醇为底物时产甲烷菌不能生长，需要与其他微生物形成团聚体进行直接电子传递产甲烷；随着微生物的富集培养，可能存在分泌型电子穿梭体或通过其他途径与产甲烷菌进行种间电子传递，产甲烷菌生长不再依赖紧密结合的团聚状态，因此团聚体解聚。

循环伏安法等电化学手段为研究S6是否存在种间直接电子传递提供了依据。S6在MFC中将电子传递给电极，同时发生氧化还原反应，说明其具有电活性。电极外包裹透析袋后无法在电极表面形成生物膜，产电性能和氧化还原反应均减弱。有研究表明在单室MFC阳极用透析袋包裹电活性升高，是由于浮游生物Chattonella marina分泌内生可溶性电子介体促进电子传递^[30]。Deng等采用与本研究透析袋类似的微孔滤膜包裹阳极，革兰氏阴性菌Klebsiella pneumoniae不能在电极上形成生物膜，产电能力下降，但随着电子穿梭体2, 6-二叔丁基苯醌 (2, 6-DTBBQ) 的分泌电活性升高，K. pneumoniae能通过膜结合细胞色素c和电子穿梭体两种形式传递电子^[18]。因此结合其他胞外电子传递研究进行分析，表明S6与电极间存在直接电子传递途径，可能与膜结合物质 (如细胞色素或菌毛) 及自身分泌的可溶性电子穿梭体有关，进一步佐证了在产甲烷分离物中Clostridium和产甲烷菌之间存在种间直接电子传递的可能性。

Clostridium不仅能够进行胞外电子传递，还可能与M. barkeri通过种间直接电子传递互营产甲烷。这一发现将以前限定在革兰氏阴性菌介导直接电子传递的认识推广到革兰氏阳性菌，并采用透析袋等电化学方法研究了产甲烷分离物中Clostridium和M. barkeri存在种间直接电子传递的潜力。虽然这类种间直接电子传递的机制还有待研究，但传统集中于革兰氏阴性菌通过直接电子传递介导互营产甲烷的研究局面将打开。后续研究将致力于从产甲烷分离物中分离Clostridium和产甲烷菌，构建纯菌共培养体系，进一步解析Clostridium和产甲烷菌之间的种间直接电子传递机制。