乳酸菌胞外多糖是一类在来源、结构、功能上具有高度多样性的胞外聚合物，胞外多糖可提高乳酸菌细胞抗逆性、抑制噬菌体感染^[1-2]；在酸奶、奶酪等发酵食品中可改善产品的粘稠度、持水性等感官特性^[3]；在人体健康和生理领域，乳酸菌胞外多糖具有抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、介导细胞粘附等功能^[4-8]。拓展乳酸菌胞外多糖的应用范围，对乳酸菌胞外多糖的持续研究十分重要。以护肤品为代表的个人护理产品可作为一个新的应用方向，在个人护理产品中，减少皮肤中黑色素合成以改善肤色是消费者最关注的目标之一。目前用于个人护理产品的黑色素合成抑制剂多为熊果苷、酚类、曲酸、抗坏血酸等小分子化合物，多糖的研究报道相对较少。银耳多糖^[9]、绿茶多糖^[10]、日本扁柏多糖^[11]被认为可抑制黑色素合成而用于个人护理产品中，贻贝多糖MJPs可抑制B16黑色素瘤细胞中黑色素合成^[12]，分离自海藻的昆布多糖、裙带菜多糖可抑制酪氨酸酶活性，但未报道对黑色素合成的抑制效果^[13]。在乳酸菌胞外多糖中，仅报道过一种来自Lactococcuslactis subsp. cremoiris SBT0495菌株的磷酸化胞外多糖可抑制B16细胞中黑色素合成^[14]。筛选可抑制黑色素合成的乳酸菌胞外多糖，有利于加深对乳酸菌胞外多糖的认识和新型皮肤护理成分的开发，提高实用化水平。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 菌株和细胞: Lactobacillus bulgaricus、L. casei、L. rhamnosus、L. acidophilus、Streptococcus thermophilus共89株，均为徐州生物工程职业技术学院实验室保存；Bifidobacterium lactis B19、B. longum BL21菌株由江苏紫石微康生物技术公司惠赠。小鼠黑色素瘤B16细胞株 (下称B16细胞) 由上海比金生物科技有限公司惠赠。

1.1.2 主要试剂和仪器: CCK-8试剂盒、蘑菇酪氨酸酶 (500 U/mg) 和多巴 (L-DOPA)，上海宝曼生物科技有限公司；蛋白胨、酵母浸粉，北京奥博星生物技术有限公司；葡聚糖凝胶Sephadex G-100、纤维素DEAE-52、DMEM低糖培养液和新生牛血清 (标准级)，上海研生生化试剂有限公司；MRS肉汤培养基，青岛海博生物技术有限公司；其余试剂为市售分析纯或生物试剂。1100 HPLC System，美国Agilent公司；Nicolet 6700 FT-IR红外光谱仪，美国Thermo Fisher Scientific公司；DHSPlateSmart型96孔板离心机，北京鼎昊源科技有限公司。

1.1.3 培养基: MRS平板为MRS肉汤培养基中补充琼脂1.5% (质量比)。脱脂乳液体培养基：脱脂乳粉15%，蛋白胨0.5%，酵母浸粉0.5% (质量比)，pH自然，0.067 MPa灭菌15 min，迅速冷却后使用。B16细胞培养液：含5% (体积比) 新生牛血清的DMEM低糖培养液。

1.2 产胞外多糖菌株的筛选

待测菌株划线接种至MRS平板活化后接种至MRS肉汤培养基，37 ℃静置培养24 h后为种子液，以3% (体积比) 接种至脱脂乳液体培养基，37 ℃静置培养24 h，用玻璃棒搅碎凝乳至均匀，观察凝乳状态并选择凝乳有拉丝的菌株。

1.3 胞外多糖的制备、纯化与结构分析

1.3.1 胞外多糖的制备: 种子液以3% (体积比) 接种至MRS液体培养基，37 ℃静置培养24 h，培养液经离心除菌体、浓缩、Sevage法除蛋白、乙醇沉淀、真空冷冻干燥获得胞外多糖粗提物^[15]。苯酚-硫酸法测量样品总糖含量^[16]。

1.3.2 胞外多糖的纯化: 胞外多糖粗提物以10 g/L溶于蒸馏水，上DEAE-52柱 (2.6 cm×50 cm)，依次使用0、0.1、0.3和0.5 mol/L NaCl梯度洗脱，每管收集10 mL。苯酚-硫酸法跟踪多糖分布，各主峰收集液合并冻干后测量对B16细胞黑色素合成的抑制效果。将活性峰部分以10 g/L溶于蒸馏水，上Sephadex G-100柱 (1.6 cm×100 cm)，0.2 mol/L NaCl溶液洗脱，每管收集10 mL，检测同上，活性峰收集液合并冻干后得结构和性质研究用样品。

1.3.3 胞外多糖的结构分析: 使用PMP (1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮) 衍生化-HPLC方法测定单糖组成^[17]，以葡萄糖、甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖共10种单糖为标样。溴化钾压片后测量红外光谱 (FT-IR)。

1.4 B16细胞黑色素形成率与活力测定

B16细胞培养环境为5% CO₂气体环境下37 ℃静置培养。取生长良好的B16细胞，弃去培养液，用PBS溶液清洗2次，0.25%胰酶消化2−3 min后吸去上液，加入培养液吹打，调节细胞浓度为5×10⁴−1×10⁵个/mL，96孔板中每孔加入100 μL，培养12 h至细胞贴壁。黑色素形成率测定：更换为含3 g/L胞外多糖粗品的培养液，以不含胞外多糖的培养液为对照，继续培养56 h后吸去培养液，用0.25%胰酶消化后1 500 r/min离心5 min弃上清，每孔加入含10% (体积比) 二甲亚砜的1 mol/L NaOH溶液200 μL，65 ℃水浴1 h，490 nm下测吸光值A (n=5)。黑色素产率 (%)=试验组A₄₉₀/对照组A₄₉₀×100。细胞活力测定：更换为含1−5 g/L胞外多糖的培养液，分别培养24、48、72、96 h后每孔加入CCK-8溶液10 μL，继续孵育2 h后测450 nm下吸光值A(n=5)。以不含胞外多糖的培养液为对照，以无细胞培养基为空白。细胞活力 (%)=(试验组A₄₅₀−空白A₄₅₀)/(对照组A₄₅₀−空白A₄₅₀)×100。

1.5 胞外多糖的酪氨酸酶抑制性和抗氧化性测定

蘑菇酪氨酸酶、多巴分别溶于磷酸盐缓冲液 (0.05 mol/L、pH 6.8) 配制为500 U/mL酪氨酸酶液、7.6 mmol/L多巴溶液。在700 μL磷酸盐缓冲液中依次加入50 μL酶液、100 μL待测液、150 μL多巴溶液，混匀后25 ℃水浴20 min，立即测量475 nm下吸光值。待测液中，以磷酸盐缓冲液为空白，含2.5 g/L α-熊果苷的磷酸盐缓冲液为阳性对照，胞外多糖以10−50 g/L浓度溶于磷酸盐缓冲液中，反应体系中的终浓度为熊果苷0.25 g/L，胞外多糖为1−5 g/L，每种样品3个重复。酪氨酸酶活性抑制率 (%)=(空白A₄₇₅−试验组A₄₇₅)/空白A₄₇₅×100。

测量胞外多糖的羟基自由基 (·OH) 清除率、超氧阴离子自由基 (·O₂⁻) 清除率^[18]，胞外多糖在反应体系中浓度为1−5 g/L，以不同浓度维生素C为阳性对照。

2 结果与分析 2.1 抑制黑色素合成的胞外多糖筛选

91个乳酸菌菌株在含15% (质量比) 脱脂乳粉的培养基中发酵，12个菌株的凝乳在搅拌均匀后有明显拉丝外观 (图 1)，将其在MRS液体培养基中培养并提取制备胞外多糖粗品，以3 g/L浓度加入B16细胞培养液，培养56 h后测量黑色素形成率 (表 1)，与空白对照组相比，L. rhamnosus HLAB122菌株产生的胞外多糖粗品可使B16细胞的黑色素产率降低至47.8%，镜检可见B16细胞中黑色素颗粒明显减少 (图 2)；苯酚-硫酸法测得其总糖含量为92.43%，证实为多糖。

2.2 L. rhamnosus HLAB122胞外多糖的纯化及分子结构

使用DEAE-52离子交换柱进行梯度洗脱，在0.3 mol/L NaCl洗脱下得一主峰 (图 3A)，多糖回收后处理B16细胞表明该峰为活性峰。继续使用Sephadex G-100柱处理得到单一峰 (图 3B)，收集浓缩冻干后获得纯化多糖 (下称LR122EPS)，在3 g/L浓度下B16细胞的黑色素形成率为44.9%±6.7%。

使用PMP衍生化-HPLC方法鉴定单糖组成，LR122EPS由鼠李糖、葡萄糖、半乳糖组成，摩尔比为1׃5.44׃5.37 (图 3D)。在LR122EPS的红外谱图中 (图 3E)，3 423 cm⁻¹的−OH伸缩振动吸收峰和2 900−3 000 cm⁻¹的C−H的吸收峰为糖类的特征峰；856.97 cm⁻¹处有一吸收峰，但与典型的830 cm⁻¹(α-糖苷键)、890 cm⁻¹(β-糖苷键) 有偏离，尚不能确认糖苷键类型；1 038−1 120 cm⁻¹的3个峰提示吡喃糖苷的存在。

2.3 LR122EPS对B16细胞黑色素合成的抑制及机制初探

LR122EPS浓度与B16细胞黑色素合成呈负相关 (图 4A)，5 g/L的LR122EPS可使B16细胞的黑色素形成率降低至32.7%，但多糖浓度达到4 g/L后降低幅度趋缓；B16细胞使用1−5 g/L LR122EPS处理24−96 h，细胞活力无变化 (图 4B)，提示其具有良好的安全性。对于作用机制，以α-熊果苷、维生素C分别作为抑制酪氨酸酶活、抗氧化的阳性对照，1−5 g/L的LR122EPS对酪氨酸酶活性没有明显的抑制作用，对·OH和·O₂⁻的清除能力微弱 (表 2)，提示LR122EPS可能通过抑制酪氨酸酶活性和抗氧化之外的作用机制来抑制黑色素的合成。

3 讨论

乳酸菌胞外多糖的生理功能是目前研究的热点，主要集中在免疫调节、抗肿瘤等方向，但受限于药品开发所需的功效、性价比、投入需求等多方面因素的制约，鲜见基于乳酸菌胞外多糖的医药产品获得市场层面的实际应用，因此拓展新的应用领域对于乳酸菌胞外多糖研究的实用化十分重要。以护肤品为代表的个人护理产品是一个新方向，其技术基础与生物医药类似而进入门槛较低，更有利于乳酸菌胞外多糖研究的实用化。对人体皮肤外观的

研究表明，皮肤的色泽和色度特点是影响表观年龄的重要因素^[19]，以东亚国家为代表的东方审美观更看重肤色。影响肤色的最主要因素是表皮中黑色素颗粒的形态和数量，黑色素颗粒由表皮基底层中的黑色素细胞合成并分泌，其主要成分是酪氨酸经酪氨酸酶系多步催化聚合而成的黑色素^[20]，减少表皮中黑色素的合成可使肤色在观感上更为白皙。能够抑制黑色素合成的乳酸菌胞外多糖将有良好的应用前景。

筛选获得产胞外多糖的乳酸菌菌株是研究乳酸菌胞外多糖结构和功能的基础，由于菌株特性和产多糖条件的多样性，尚未有准确便捷的初筛方法，已报道的筛选方法包括观察菌落外观^[21]、钌红平板法^[22]、观察凝乳质构^[23]等。观察凝乳质构方法的理论基础为：乳酸菌在发酵过程中产生的胞外多糖分散在酪蛋白因pH降低而形成的网络结构中，搅拌使酪蛋白网络结构破坏，乳清及溶解在其中的胞外多糖形成连续相，胞外多糖的高分子特性使其具有拉丝外观^[24-25]。使用该方法筛选到12个乳酸菌菌株，在小鼠黑色素瘤B16细胞模型上，L. rhamnosus HLAB122产生的胞外多糖对黑色素形成的抑制效果最大，3 g/L时黑色素产率为空白对照的47.8%。

对L. rhamnosus HLAB122产生的胞外多糖使用DEAE-52离子交换柱和Sephadex G-100柱进行处理，得到纯化的胞外多糖LR122EPS。其单糖组成为鼠李糖、葡萄糖、半乳糖，摩尔比为1׃5.44׃5.37，与已知组成的乳酸菌胞外多糖不同^[3]，是一种未见报道的单糖组成模式；其红外光谱仅能确认为含有吡喃糖苷的多糖。从单糖组成和红外光谱得到的信息有限，不能更多地阐明LR122EPS的结构。

对LR122EPS的进一步研究表明其具有良好的安全性，5 g/L浓度下培养96 h对B16细胞活力无影响。来自Lactococcus lactis subsp. cremoiris SBT0495的胞外多糖^[14]，在B16细胞模型中，0.5%−1.0%多糖处理组的黑色素产率约为空白对照的80%−55%，但细胞活力同时下降约12%−35%。LR122EPS在功效和安全性上均优于该胞外多糖，具有良好的应用前景。

细胞中黑色素的合成包括多个步骤，可针对的靶点较多，因此抑制黑色素合成的活性成分在作用机制上具有高度多样性，例如氢醌对黑色素细胞具有细胞毒作用，曲酸通过螯合Cu²⁺抑制酪氨酸酶活性，熊果苷等含酚羟基的化合物通过竞争性结合抑制酪氨酸酶活性，抗坏血酸、半胱氨酸等通过抗氧化性抑制黑色素合成等；已知作用机制的活性成分多为小分子化合物，高分子多糖抑制黑色素合成的研究少见报道。银耳胞外多糖可抑制酪氨酸酶活性^[9]，绿茶多糖和日本扁柏多糖的作用机制未知^[10-11]。分离自贻贝蒸煮液的多糖MJPs具有强烈的抗氧化性和免疫调节活性，可抑制B16细胞中黑色素合成且无细胞毒性^[12]。分离自海藻的昆布多糖、裙带菜多糖可抑制酪氨酸酶活性^[13]。LR122EPS在1−5 g/L浓度下对B16细胞活力无影响，表明无细胞毒作用；在体外测试中对酪氨酸酶活性无明显抑制作用，对·OH和·O₂⁻自由基的清除能力微弱；其作用机制尚待进一步研究。