2017, Vol. 44扩展功能
文章信息
- 马丽霞, 彭琦, LereclusDidier, 张杰, 郭淑元, 宋福平
- MA Li-Xia, PENG Qi, Lereclus Didier, ZHANG Jie, GUO Shu-Yuan, SONG Fu-Ping
- 苏云金芽胞杆菌LM1212质粒缺失对细胞分化的影响
- Effect of plasmid curing on cell differentiation of Bacillus thuringiensis strain LM1212
- 微生物学通报, 2017, 44(3): 574-582
- Microbiology China, 2017, 44(3): 574-582
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.160697
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文章历史
- 收稿日期: 2016-09-28
- 接受日期: 2016-12-06
- 优先数字出版日期(www.cnki.net): 2016-12-19
2. 植物病虫害生物学国家重点实验室 中国农业科学院植物保护研究所 北京 100193;
3. INRA, UMR1319 Micalis, La Minière, Guyancourt 78280, France
2. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China;
3. INRA, UMR1319 Micalis, La Minière, Guyancourt 78280, France
苏云金芽胞杆菌 (Bacillus thuringiensis，Bt) 是一种革兰氏阳性产胞菌。大多数Bt菌株能在母细胞形成芽胞的同时产生一个或多个伴胞晶体，伴胞晶体由具杀虫活性的Cry或Cyt蛋白组成。由于Bt晶体蛋白有特异杀虫活性，对人畜无害，目前已成为应用最广泛的微生物杀虫剂[1]。
研究发现存在一类较特殊的Bt菌株，具有晶体细胞和芽胞细胞的分化现象[2-3]。我们前期也发现了一株具类似分化现象的Bt菌株LM1212，它的cry基因只在非芽胞细胞中特异性转录，与传统Bt的cry基因在芽胞细胞中转录明显不同[4-5]。有研究在群体水平表明Bt在侵染昆虫过程中经历的3个连续的途径 (Virulence，necrotrophism，sporulation) 中存在分化现象，在生物被膜的生长过程中至少存在5种细胞亚群 (Virulent、virulent/necrotrophic、necrotrophic、necrotrophic/sporulating和An undened physiological stage)，转录因子PlcR、NprR和SigE在细胞内被连续激活，表明在生物被膜形成过程中，这些转录因子的活性是相互关联并存在于不同细胞分化亚群中的[6]。但是目前Bt晶体细胞分化的机制仍不清楚。模式微生物枯草芽胞杆菌 (B. subtilis，Bs) 的分化机制研究较为深入，由多个双组分信号系统控制着不同细胞亚群的分化，可以分化为多种功能不同的细胞亚群，在不同的环境中通过分工发挥重要作用；而这些细胞亚群的分化机制是由复杂的调控因子网络来控制[7-8]。
由于cry基因定位于Bt的大质粒上[9]，LM1212菌株中cry基因的转录只在非芽胞细胞转录，因此我们推测晶体细胞分化可能与LM1212大质粒上未知调控因子有关，本研究旨在通过质粒缺失探索内源质粒在LM1212菌株细胞分化中的作用，结果发现质粒缺失对筛选到的两株质粒缺失株细胞分化产生了影响，这一发现为筛选控制LM1212细胞分化的转录因子奠定了基础，同时为构建高产晶体的Bt工程菌株提供了遗传材料。
1 材料与方法 1.1 菌株和质粒研究中所用菌株和质粒见表 1。
| 菌株和质粒 Strains and plasmids |
描述 Description |
来源 Resource |
| LM1212 | Wild-type strain | [4] |
| LM (p35'Z) | LM1212 strain carrying p35'Z | [4] |
| LM (p35'Z)-W | LM (p35'Z) white clone by curing of the plasmid | This study |
| LM (p35'Z)-DB | LM (p35'Z) dark blue clone by curing of the plasmid | This study |
| p35'Z | pHT304-18Z carrying the lacZ gene under the control of the Pcry35-like | [4] |
菌种活化、保藏采用液体LB (Luria-Bertani) 培养基 (g/L)：蛋白胨 (Tryptone) 10.0，酵母粉 (Yeast extract) 5.0，NaCl 10.0，pH 7.0。
突变株筛选采用HCO固体培养基 (HCO液体培养基[10]+1.3%琼脂)。
HCO液体培养基 (g/L)：Casein hydrolysate (vitamin-free) 7.0，KH2PO4 6.8，MgSO4·7H2O 0.12，MnSO4·4H2O 0.002 2，ZnSO4·7H2O 0.014，Fe2(SO4)3 0.020，CaCl2·4H2O 0.18，glucose 3.0，pH 7.2，1×105 Pa灭菌20 min。
芽胞形成率分析及细胞形态观察采用SSM培养基[11](g/L)：营养肉汤 (Nutrient broth) 8.0，KCl 1.0，MgSO4 1.2，NaOH 0.4，1×105 Pa灭菌20 min，加Ca (NO3)2 1.64，MnCl2 0.013，FeSO40.004 (过滤除菌)。
红霉素 (Erm) 和X-gal终浓度分别为5 mg/L和100 mg/L。
1.3 主要试剂和仪器2×Taq DNA聚合酶Mix，北京博迈德生物技术公司；引物，上海生工生物工程有限公司。
PCR仪，型号Master cycler Gradient AG5331，德国Eppendorf公司；核酸电泳仪，型号DYY-5，北京六一仪器厂；脉冲场凝胶电泳仪，型号CHEF-DRⅢ，美国Bio-Rad公司；蛋白电泳仪，型号Mini protein Ⅲ，美国Bio-Rad公司；激光共聚焦显微镜，型号Leica TCS SL，德国Leica Microsystems Wetzlar公司；正置BX61研究级显微镜，型号BX61，日本奥林巴斯公司。
1.4 实验方法 1.4.1 高温缺失质粒: 将过夜活化的LM (p35'Z) 菌株在不含抗生素的LB液体培养基中39培养至OD600=2.0−2.2，按1%接种量转接4次后稀释涂布于含抗生素和100 mg/L X-gal的HCO平板上，30培养2 d后观察。 1.4.2 脉冲场凝胶电泳分析突变株质粒谱: LM (p35'Z)-W菌株、LM (p35'Z)-DB菌株及LM (p35'Z) 菌株的质粒使用德国QIAGEN Plasmid Maxi Kit试剂盒提取，方法见试剂盒说明书。将提取好的质粒进行电泳分析。首先在电泳槽内倒入0.5×TBE缓冲液，盖上盖子，打开冷凝泵进行预冷至温度降为14，小心地把胶放入预冷的电泳槽，按顺序依次将DNA marker及菌株质粒样品点入胶孔，设置电泳参数为夹角120°，14，电压梯度6 V/cm，电泳时间10 h。电泳结束后，关机。EB染色，拍照并记录实验结果。
1.4.3 PCR鉴定引物设计: 根据LM1212菌株cry基因序列设计引物 (LM1212基因组序列NCBI accession No.为AYPV00000000) (表 2)，PCR鉴定突变株。| 基因名 Symbol |
上游引物 Forward primer (5′→3′) |
下游引物 Reverse primer (5′→3′) |
| cry41Ca1 | TTGAGCCAAGATGGTTCGAGT | TAGCTCCATCATCGGCAATTC |
| cry74Aa1 | GCGACAGTAGGCATAGAAAC | ACCTTTGAAACGAGCGATAT |
| cry45Ba1 | GGCGTTGAGAATATCGAGTTAG | CCGGTTGCTTGATGATGAGGAGG |
| cry32Wa1 | GGTCAATCTGTTTGGGAAAGG | GCATACCCCATTCGTTTCCA |
| cry32Va1 | GAATACGAGCGATCACCCTAGGTA | GACCATTGCGGTAGAGCAGGA |
| cry35-like2 | AGACCGCTTGAACCTGGATTT | CAAAGCATTCGATACAGTAGCCAC |
| cry35-like | TAGAGTCTAGCTGGCCAATT | CTATCAGGATCGGATGGAT |
分别选取LM (p35'Z)-W菌株、LM (p35'Z)-DB菌株及LM (p35'Z) 菌株T14时期显微镜3个不同视野的细胞进行统计分析；每个视野选取总细胞数为100个，记录芽胞细胞个数为n1，晶体细胞个数为n2。每100个细胞芽胞细胞比例=n1/100；晶体细胞比例=n2/100。3个不同视野的结果取平均值并绘制柱状图。
1.4.5 质粒缺失株芽胞形成率分析: 分别挑取LM (p35'Z)-W菌株、LM (p35'Z)-DB菌株及LM (p35'Z) 菌株的单菌落活化后，1%接种量转接于50 mL SSM液体培养基中，30、220 r/min培养至T1；从50 mL菌液中取1 mL，梯度稀释后取100 μL涂于LB固体平板，计算T1时期的总细胞数；将剩余菌液继续培养至芽胞完全释放，从中取1 mL菌液置于玻璃试管中，65温浴30 min杀死营养体；从中取1 mL处理的菌液梯度稀释后取100 μL涂于LB固体平板，计算芽胞萌发数；芽胞形成率计算公式：芽胞形成率=芽胞的萌发数/T1的总细胞数 (每个样品重复3次)。 1.4.6 质粒缺失株晶体蛋白表达分析: 挑取LM (p35'Z)-W菌株、LM (p35'Z)-DB菌株及LM (p35'Z) 菌株的单克隆接种于5 mL液体LB培养基中，30、220 r/min培养8−10 h；按1%接种量转接至相同体积 (300 mL) 的SSM培养基中；待晶体完全释放后，4、8 000 r/min离心6 min收集所有沉淀物，用ddH2O洗涤2−3次后加适量ddH2O悬浮，用冷冻干燥机将沉淀物冻干 (48 h)，对所有冻干粉进行称重，LM (p35'Z)-W菌株0.112 0 g，LM (p35'Z)-DB菌株0.240 0 g，LM (p35'Z) 菌株0.181 7 g；加ddH2O稀释至相同浓度 (9 mg/L)；取相同上样量进行SDS-PAGE分析。进一步选取相应的条带进行LC-MS/MS (Q-TOF) 鉴定，所得质谱数据与本地Bt菌株蛋白数据库及在线数据库进行比对。 2 结果与分析 2.1 质粒缺失株的筛选LM (p35'Z) 菌株由本实验室保藏，携带有LM1212 cry35-like基因的启动子指导的lacZ基因，在含有X-gal的HCO平板上菌落呈蓝色 (图 1A)。
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| 图 1 突变菌株的筛选 Figure 1 Selection of mutants 注：深蓝色克隆用粗箭头表示，白色克隆用细箭头表示. A：30条件下在含X-gal的HCO平板上的LM (p35'Z) 菌株. B、C：39条件下在含X-gal的HCO平板上的LM (p35'Z) 菌株. D：重复3次后在含X-gal的HCO平板上的深蓝色和白色克隆表型. Note: Dark blue clone are indicated by arrowheads and white clone are indicated by arrows. A: The colony of LM (p35'Z) strain on HCO plate (containing X-gal) when cultured at 30 'Z) strain on HCO plate (containing X-gal) when cultured at 39 |
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高温培养后发现有个别菌落的p35'-lacZ表达出现差异，菌落颜色表现为白色 (图 1B) 或深蓝色 (图 1C)；反复重复上述步骤3次，突变菌株表型稳定 (图 1D)。说明高温质粒的缺失影响了cry35-like启动子的活性。将菌落显白色的菌株命名为LM (p35'Z)-W，菌落显深蓝色菌株命名为LM (p35'Z)-DB。
2.2 突变株质粒谱分析对LM (p35'Z) 菌株、LM (p35'Z)-DB菌株和LM (p35'Z)-W菌株提取质粒后进行脉冲场凝胶电泳分析，结果显示LM (p35'Z) 菌株可检测到5个条带 (图 2中LM)，从上至下依次命名为1、2、3、4、5。结果显示条带1在LM (p35'Z)-DB菌株和LM (p35'Z)-W菌株中大小发生了明显变化，比原条带变小，说明这条带所代表的质粒可能在两株突变体中发生了不同片段的缺失；条带3代表的质粒在LM (p35'Z)-W菌株中未检测到 (图 2中W)；条带5根据其大小，推测其代表Deng等构建的p35'Z质粒[4]，在LM (p35'Z)-DB菌株和LM (p35'Z)-W菌株中大小没有变化。以上结果说明两株突变体确实发生质粒的不同程度的缺失和大小的变化，而这些变化可能是引起两株突变体表型变化的原因。具体的结果还需要测序验证。
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| 图 2 突变菌株的质粒谱分析 Figure 2 Analysis of plasmids pattern in mutants 注：SM：超螺旋DNA ladder marker；M：DNA ladder marker；LM：LM (p35'Z)；W：LM (p35'Z)-W；DB：LM (p35'Z)-DB；*：琼脂糖电泳检测缺失的质粒；−：琼脂糖电泳检测部分缺失的质粒. Note: SM: Supercoiled DNA ladder marker; M: DNA ladder marker; LM: LM (p35'Z); W: LM (p35'Z)-W; DB: LM (p35'Z)-DB; *: the curing plasmids on agarose gel; −: part of the plasmids were curing. |
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分别挑取LM (p35'Z)-W菌株和LM (p35'Z)-DB菌株培养，利用根据LM1212菌株基因组序列设计的7对cry基因引物 (表 1) 进行PCR检测。结果显示LM (p35'Z)-W菌株可检测到cry32Wa1、cry32Va1、cry74Aa1和cry45Ba1 (图 3泳道1、2、3、7)，而检测不到cry41Ca1、cry35-like和cry35-like2基因 (图 3泳道4、5、6)；LM (p35'Z)-DB菌株可检测到cry41Ca1、cry74Aa1和cry45Ba1 (图 3泳道8、9、13)，而检测不到cry32Wa1、cry32Va1、cry35-like和cry35-like2基因 (图 3泳道10、11、12、14)；说明这两株菌缺失了不同的cry基因。
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| 图 3 突变菌株的cry基因鉴定 Figure 3 The identification of cry gene in mutants Note: M: Marker; 1, 8, 15: cry74Aa1; 2, 9, 16: cry45Ba1; 3, 10, 17: cry32Wa1; 4, 11, 18: cry35-like2; 5, 12, 19: cry35-like; 6, 13, 20: cry41Ca1; 7, 14, 21: cry32Va1. |
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目前已公布的所有Bt基因组序列中cry基因均位于大质粒上[12-15]，而两株突变株具有不同的cry基因缺失，结合突变株的质粒谱分析，推测LM (p35'Z) 菌株的cry基因位于图 2中条带1所代表的大质粒上，其中LM (p35'Z)-W菌株缺失条带1所代表的大质粒上的cry41Ca1、cry35-like和cry35-like2基因所在片段，LM (p35'Z)-DB菌株缺失条带1所代表的大质粒上的cry32Wa1、cry32Va1、cry35-like和cry35-like2基因所在片段。共同缺失cry35-like和cry35-like2基因所在片段。具体情况还需进一步测序验证。
2.4 质粒缺失株的细胞亚群观察及统计分析LM (p35'Z) 菌株在T5时期前芽胞已经形成，未形成Cry晶体蛋白 (图 4C)，在T14时期芽胞和Cry晶体蛋白都已形成 (图 4F)；通过对LM (p35'Z)-DB菌株、LM (p35'Z)-W菌株和野生型LM (p35'Z) 菌株T5、T14时期的细胞进行观察，发现与野生型菌株LM (p35'Z) (图 4C，4F) 相比，在LM (p35'Z)-DB中形成更多晶体产生细胞 (图 4B，4E)，在LM (p35'Z)-W中形成较少晶体产生细胞 (图 4A，4D)。
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| 图 4 菌株的形态观察 Figure 4 Observation of morphological features in mutants 注：光学显微镜放大倍数 (1 000×)；芽胞形成细胞 (具有不对称隔膜的细胞，前芽胞及芽胞) 用粗箭头表示，晶体产生细胞用细箭头表示；细胞在含红霉素的SSM培养基中培养；细胞膜用FM®-4-64进行染色. Note: Optical microscope (1 000×); Spore-formers (cell with asymmetric septum, prespore or spore) are indicated by arrows and crystal-producers are indicated by arrow heads; Cells were cultured in SSM medium with erythromycin; The cell walls were stained with FM®-4-64. |
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通过对突变株T14时期显微镜视野中的芽胞和晶体细胞所占比例分别进行计数统计分析，结果显示，与野生型LM (p35'Z) 菌株相比，LM (p35'Z)-W菌株的晶体细胞比例降低，芽胞细胞所占比例提高 (图 5)；而LM (p35'Z)-DB菌株的晶体细胞比例提高，芽胞细胞所占比例降低 (图 5)。
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| 图 5 LM (p35'Z)-DB菌株和LM (p35'Z)-W菌株芽胞和晶体细胞所占比例 Figure 5 The percentage of spore-formers and crystal cells in LM (p35'Z)-W and LM (p35'Z)-DB strains |
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说明LM (p35'Z)-DB菌株和LM (p35'Z)-W菌株晶体产生细胞和芽胞形成细胞比例发生了变化；质粒缺失影响了LM1212菌株芽胞细胞和晶体细胞比例。
2.5 质粒缺失株的芽胞形成率分析分析了LM (p35'Z)-DB菌株和LM (p35'Z)-W菌株的芽胞形成率，LM (p35'Z) 菌株作为对照；发现在LM (p35'Z)-DB菌株的芽胞形成率很低，LM (p35'Z)-W菌株的芽胞形成率略低于LM (p35'Z) (图 6)。进一步说明在LM (p35'Z)-DB菌株中晶体细胞比例提高，在LM (p35'Z)-W菌株中晶体细胞形成减少。说明质粒缺失影响了LM1212菌株芽胞细胞和晶体细胞比例。
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| 图 6 LM (p35'Z)-DB菌株和LM (p35'Z)-W菌株芽胞形成率分析 Figure 6 Analysis of sporulation efficiency in LM (p35'Z)-W and LM (p35'Z)-DB strains |
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通过对LM (p35'Z)-DB菌株和LM (p35'Z)-W菌株及野生型菌株LM (p35'Z) 的晶体蛋白表达量进行SDS-PAGE分析，发现与野生型菌株相比，LM (p35'Z)-DB菌株晶体蛋白表达量增多，LM (p35'Z)-W菌株晶体蛋白表达量减少 (图 7)。
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| 图 7 质粒缺失对突变株蛋白表达量的影响 Figure 7 Effect of plasmid curing on protein expression 注：M：Marker；LM：LM (p35'Z)；W：LM (p35'Z)-W；DB：LM (p35'Z)-DB；1：Cry32Va1；2：Cry41Ca1；3：Cry32Wa1；4：Cry69Aa-like；5：NT32-like；6：Cry35-like+Cry35-like2；7：Cry74Aa1；8：Cry45Ba1；−：野生型菌株表达的蛋白水平 (对照)；*：蛋白表达量减少；+：蛋白表达量增加. Note: M: Marker; LM: LM (p35'Z); W: LM (p35'Z)-W; DB: LM (p35'Z)-DB; 1: Cry32Va1; 2: Cry41Ca1; 3: Cry32Wa1; 4: Cry69Aa-like; 5: NT32-like; 6: Cry35-like+Cry35-like2; 7: Cry74Aa1; 8: Cry45Ba1; −: the protein expression of wild strain (control); *: the protein whose expression is reduced; +: the protein whose expression is increased. |
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LC-MS/MS (Q-TOF) 鉴定结果检测到了之前报道过的LM1212菌株的晶体蛋白组成成分，包括7种Cry蛋白及一种NT32-like蛋白[4]，Cry蛋白分别为Cry32Val、Cry41Ca1、Cry32Wa1、Cry35-like2、Cry35-like、Cry74Aa1和Cry45Ba1；此外，还检测到一种新的Cry69Aa-like蛋白；其中LM (p35'Z)-DB菌株缺失Cry32Wa1、Cry32Va1、Cry35-like、Cry35-like2蛋白，Cry74Aa1、Cry41Ca1、Cry69Aa-like及NT32-like蛋白表达量提高，Cry45Ba1蛋白表达量很少或检测不到；LM (p35'Z)-W菌株缺失Cry41Ca1、Cry35-like、Cry35-like2蛋白，Cry32Val、Cry32Wa1、Cry74Aa1、Cry69Aa-like及NT32-like蛋白表达量很少或检测不到 (图 7)；说明质粒缺失影响了LM1212 Cry蛋白的表达。
3 讨论通过高温突变，结合蓝白斑筛选得到两株cry35-like启动子活性发生变化的突变株，脉冲场凝胶电泳分析突变株质粒谱及基因鉴定发现分别具有不同的质粒基因片段及cry基因缺失。目前报道的Bt菌株中cry基因均定位于内源大质粒上，基因组上未发现有cry基因[12-15]。因此我们推测LM1212菌株中的cry基因也应该位于大质粒上，而本研究所获得的两株突变株代表了不同的质粒基因缺失情况。进一步的工作需要完成这些菌株质粒序列的测定，以确定缺失的质粒基因序列。
本研究中质粒缺失影响了晶体细胞的比例，对LM1212菌株的细胞分化产生了影响。质粒编码的基因可以对细菌的多种功能产生影响，如质粒介导的多粘菌素抗性基因编码的多粘菌素可治疗对碳青霉烯类抗生素耐药菌引起的感染[16]；来源于溶血素 (ehxA) 亚型的产志贺氏毒素的大肠杆菌的ehxA亚型质粒，编码与大肠杆菌有关的多种毒力因子[17]；来源于Bs 3610菌株的pBS32质粒编码的一种σ因子同源蛋白ZpdN对质粒应对DNA损伤是必需的[18]。此外，也有研究表明解淀粉芽胞杆菌B3菌株中发现的来源于质粒的RapQ-PhrQ系统可控制Bs OKB105菌株中芽胞和感受态细胞的形成及胞外活性肽的产生，影响分化[19]。但是，关于Bt质粒缺失对细菌分化的影响，本研究是首次报道，同时也说明影响晶体细胞分化的转录因子极可能定位于质粒上。
本研究发现质粒缺失突变株LM (p35'Z)-DB产生了非常少的芽胞，而晶体细胞比例明显增加。传统Bt菌株都在形成芽胞的同时在同一个母细胞内产生晶体蛋白，cry基因在芽胞细胞内转录[20]；而LM1212菌株晶体蛋白与芽胞独立产生于不同细胞内，LM1212菌株的cry基因只在非芽胞细胞中特异性转录，与传统Bt的cry基因转录明显不同，受新的调控机制控制[4]，具体的调控机制有待进一步探究。本研究中质粒缺失株LM (p35'Z)-DB菌株具有很好的应用潜力及研究价值，细胞亚群基本为晶体产生细胞，对于构建一种全新的无芽胞Cry蛋白大量表达体系提供了宝贵的遗传材料，为新一代Bt工程菌的构建开辟了遗传改良的新途径。
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