2017, Vol. 44扩展功能
文章信息
- 胡凯弟, 柴先杜, 陈树平, 邓维琴, 周康, 刘书亮
- HU Kai-di, CHAI Xian-du, CHEN Shu-ping, DENG Wei-qin, ZHOU Kang, LIU Shu-liang
- 米曲霉M-4降解己烯雌酚的条件优化
- Optimization of diethylstilbestrol degradation by Aspergillus oryzae M-4
- 微生物学通报, 2017, 44(3): 525-532
- Microbiology China, 2017, 44(3): 525-532
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.160235
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文章历史
- 收稿日期: 2016-03-23
- 接受日期: 2016-05-30
- 优先数字出版日期(www.cnki.net): 2016-06-08
2. 四川农业大学 食品加工与安全研究所 四川 雅安 625014
2. Research Institute of Food Processing and Security, Sichuan Agricultural University, Ya'an, Sichuan 625014, China
己烯雌酚 (Diethylstilbestrol，DES) 又名乙菧酚，是一种人工合成的非甾体类雌激素，于1938年被制造出来；由于具有与天然雌素酮、雌二醇等同样的生物特性且成本低廉，被广泛用于临床上保胎、避孕、内分泌失调治疗以及畜牧业中促进牲畜生长、催情等[1-3]。研究发现DES同大多数环境雌激素 (Environmental estrogens，EEs) 一样，具有生殖毒性和神经毒性[4-5]，会导致生物体肥胖[6]、内分泌失调[7]，甚至诱发流产、乳腺癌、前列腺癌、生殖畸形等恶性病症[1, 8]，许多国家已禁止使用。但是环境中仍有大量DES残留[9]，并会通过食物链传播而形成生物富集[10]，如在肉[11-12]、奶[13]、蛋[14]等动物源食品中均检出DES，情况不容乐观。如何消除环境中的DES已成为亟需解决的问题。
目前消除DES或EEs的方法有氧化降解法、吸附法和生物降解法[15-16]。生物降解由于其高效、廉价、绿色、简便等优点而受到广泛关注。米曲霉 (Aspergillus oryzae) M-4是一株可降解DES的丝状真菌，其在MM培养基中培养5 d对25 mg/L的DES降解率为53.38%[17]。本试验采用Plackett-Burman设计确定影响M-4降解DES的主要因素，利用响应面分析法优化其降解条件，旨在为更好地利用该菌株进行生物修复应用提供数据参考。
1 材料与方法 1.1 菌株及培养基 1.1.1 菌株: 米曲霉 (Aspergillus oryzae) M-4，由四川农业大学食品学院微生物实验室从酱油曲中分离鉴定并保存[18]。 1.1.2 培养基: 基础无机盐培养基 (MM，g/L)：(NH4)2SO4 1.5，K2HPO4 1.5，KH2PO4 0.5，NaCl 0.5，MgSO4 0.2，Tween 80 2.0，超纯水溶解并定容至1.0 L，pH 7.5，作为初始培养基。葡萄糖马铃薯琼脂培养基 (PDA，g/L)：新鲜去皮马铃薯200.0，葡萄糖20.0，Tween 80 2.0，琼脂20.0，蒸馏水定容至1.0 L，pH 7.0。
孢子洗脱液：Tween 80 0.2 g，琼脂0.01 g，蒸馏水100 mL；
以上培养基和洗脱液均1×105 Pa灭菌15 min。
1.2 主要试剂和仪器己烯雌酚 (DES，纯度为99.5%)，德国Dr. Ehrenstorfer公司；甲醇 (HPLC)，瑞典Oceanpak公司。
DES母液配制：准确称取适量DES，用无水乙醇溶解并定容，配制成5 g/L母液备用。
LC-10A2010C HT型液相色谱仪，LC-Solution工作站，日本Shimadzu公司；Milli-Q超纯水仪，美国Millipore公司；AS10200A超声波清洗器，天津奥特赛恩斯公司；Sorvall ST 16R冷冻离心机，美国Thermo Fisher Scientific公司。
1.3 方法 1.3.1 培养液的制备: 取菌株M-4划线于PDA斜面，28 ℃培养72 h进行活化。挑取活化好的菌株连续两次划线于含DES的PDA斜面 (DES质量浓度：50 mg/L) 进行驯化 (28 ℃，72 h)；用5 mL孢子洗脱液洗下菌体并调整孢子浓度为108 cfu/mL，制成种子液。将种子液按5% (体积比) 接种于DES浓度为100 mg/L的MM培养基中，28 ℃、120 r/min振荡培养72 h。
1.3.2 DES的提取及测定: 取整瓶培养液加入等体积甲醇，超声 (40 kHz，300 W) 辅助提取30 min，摇匀后取2 mL至刻度试管，甲醇定容至10 mL；取1.5 mL离心 (12 000 r/min，15 min)；吸取上清过0.45 μm有机相滤膜，弃去初滤液，取续滤液供HPLC分析用[17]。HPLC检测条件[17]：色谱柱为Sepax GP-C18柱 (150 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流动相为甲醇:超纯水=70:30 (体积比)，流速1.0 mL/min；柱温25 ℃；进样量10 μL；紫外检测器波长：242 nm。
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C0为0 h培养液中DES质量浓度 (mg/L)；C为3 d培养液中DES残留质量浓度 (mg/L)。
1.3.3 培养基组分单因素优化: (1) 最适氮源：在初始培养基中将 (NH4)2SO4分别替换成1% (质量比) 的蛋白胨、胰蛋白胨、NH4NO3进行最适氮源的筛选[19]。采用1.3.2方法测定DES残留量，计算DES的最大降解率，选择最适氮源进行下一步试验。每组试验重复3次，取平均值，下同。(2) 最适碳源：在初始培养基中将 (NH4)2SO4替换为最适氮源后，将初始培养基中DES减少为原来的50% (100 mg/L减少为50 mg/L，下同)，添加0.5% (质量比) 淀粉、葡萄糖，进行最适外加碳源筛选，以未添加作对照[20]。采用1.3.2方法测定DES残留量，计算DES的最大降解率，选择最适碳源进行下一步试验。
(3) 最适无机盐：将初始培养基中 (NH4)2SO4替换为最适氮源并添加最适碳源后，分别添加0.05% (质量比) CaCl2、MnCl2、MgSO4进行最适无机盐筛选[21]，同时以初始培养基 (DES质量浓度50 mg/L) 为对照，考察培养基组分优化效果。采用1.3.2方法测定DES残留量，计算DES的最大降解率，根据降解率分析得出最适无机盐，并将初始培养基中DES降解率作为初始降解率。
1.3.4 Plackett-Burman设计筛选影响米曲霉M-4对DES降解的显著影响因素: 采用Plackett-Burman设计，以最少的试验次数快速筛选影响菌株M-4降解DES的显著影响因素。运用Minitab软件进行数据处理，对各因素进行t检验，通过比较各因素的P值，选择置信度高的因素作为显著影响因素[22]。 1.3.5 响应面优化发酵条件: 利用最陡爬坡试验设计快速逼近最优区域，确定响应面设计的中心点。根据Box-Bohnken中心组合设计原理，采用Design-Expert V8.05软件对数据进行统计和分析，进而确定各显著影响因素的最优水平[23]。 2 结果与分析 2.1 确定降解DES培养基组分单因素最适氮源。在初始培养基中将 (NH4)2SO4替换成1% (质量比) 的不同氮源，结果如图 1所示。由图 1可知，相比于初始培养基中的 (NH4)2SO4，供试菌株更倾向于利用有机氮源[24]，当替换为无机氮源NH4NO3时米曲霉M-4对DES降解能力略有下降。使用蛋白胨时菌株降解率最高，可能是培养体系更为丰富，菌丝生长更好，进而DES降解能力提高，因此选择蛋白胨为最适氮源进行下一步试验。
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| 图 1 不同氮源对米曲霉M-4降解DES的影响 Figure 1 Effects of different nitrogen sources on the degradation of DES by Aspergillus oryzae M-4 |
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最适碳源。根据试验分析可知，DES在培养基中不仅作为底物，也可作为碳源和能源物质。因此，在初始培养基中将氮源替换成1% (质量比) 的蛋白胨后将DES减半，同时分别添加其他碳源物质0.1% (质量比)，考察外加碳源对发酵条件的影响。结果如图 2所示，相比于对照组，在培养体系中添加葡萄糖时DES降解率有所提高，添加淀粉时略下降，这与李建龙等[25]的结果相类似；因此确定葡萄糖为最适外加碳源。
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| 图 2 不同碳源对米曲霉M-4降解DES的影响 Figure 2 Effects of different carbon sources on the degradation of DES by Aspergillus oryzae M-4 |
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最适无机盐。在初始培养基中将替换成最适氮碳源蛋白胨1% (质量比)、葡萄糖0.1% (质量比) 后，分别添加无机盐0.05% (质量比)，结果见图 3。可以看出，Ca2+和Mg2+对菌株降解DES均有一定的促进作用；而Mn2+相反；添加CaCl2时DES降解率最高，为83.44%，因此选择CaCl2作为最适无机盐；同时该降解率远高于初始降解率 (图 3中Control) 60.98%，表明培养基组分优化效果明显。
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| 图 3 不同无机盐对米曲霉M-4降解DES的影响 Figure 3 Effects of different inorganic salts on the degradation of DES by Aspergillus oryzae M-4 |
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根据试验结果，对可能影响菌株M-4降解DES的7个因素 (培养基中DES、蛋白胨、葡萄糖、CaCl2的含量及培养基初始pH值、摇床转速、种龄) 进行快速筛选。以M-4对DES的降解率为响应值 (Y)，各因素分别取两水平，选用N=12的Plackett-Burman设计，并设计5个空白作为误差分析项，各水平因素的效应值和显著性分析结果见表 1。可以看出，培养基中DES、蛋白胨及CaCl2含量3个因素对降解率影响显著 (p < 0.05)，选择这3个因素做后续试验。
| 因素Factors | 水平Levels | 效应Effects | 显著性检验Test of significance | ||
| Low (+1) | High (-1) | t value | P value | ||
| DES (mg/L) | 50.00 | 60.00 | -0.020 00 | -1.49 | 0.007** |
| 蛋白胨Peptone (%) | 1.00 | 1.20 | 1.126 00 | 1.64 | 0.003** |
| 葡萄糖Glucose (%) | 0.50 | 0.60 | -1.030 00 | -0.79 | 0.169 |
| CaCl2 (%) | 0.05 | 0.06 | -17.230 00 | -1.26 | 0.022* |
| 摇床转速Shaker speed (r/min) | 120.00 | 140.00 | 0.000 27 | 0.17 | 0.943 |
| 种龄Inoculum age (h) | 72.00 | 96.00 | 0.067 10 | 0.48 | 0.373 |
| 初始pH Initial pH | 7.00 | 7.50 | 0.113 00 | 0.52 | 0.454 |
| 注：**：极显著，p < 0.01；*：显著，p < 0.05. Note: **: highly significant, p < 0.01; *: significant, p < 0.05. |
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| 组号 Group No. |
DES (mg/L) |
蛋白胨 Peptone (%) |
CaCl2 (%) |
降解率 Degradation rate (%) |
| 1 | 50 | 1.20 | 0.050 | 74.59 |
| 2 | 45 | 1.25 | 0.045 | 85.54 |
| 3 | 40 | 1.30 | 0.040 | 81.53 |
| 4 | 35 | 1.35 | 0.035 | 80.35 |
| 5 | 30 | 1.40 | 0.030 | 71.94 |
| 因素 Factors |
符号代码 Symbol code |
水平Levels | ||
| -1 | 0 | 1 | ||
| DES (mg/L) | X1 | 40.000 | 45.000 | 50.000 |
| 蛋白胨Peptone (%) | X2 | 1.100 | 1.250 | 1.400 |
| CaCl2 (%) | X3 | 0.040 | 0.045 | 0.050 |
| 试验号 Run order |
X1 | X2 | X3 | 降解率 Degradation rate (%) |
||||
| 1 | -1 | -1 | 0 | 56.19 | ||||
| 2 | -1 | 0 | 1 | 72.70 | ||||
| 3 | -1 | 0 | -1 | 78.37 | ||||
| 4 | -1 | 1 | 0 | 72.96 | ||||
| 5 | 0 | 0 | 0 | 89.56 | ||||
| 6 | 0 | 0 | 0 | 85.16 | ||||
| 7 | 0 | -1 | 1 | 55.06 | ||||
| 8 | 0 | 0 | 0 | 83.34 | ||||
| 9 | 0 | 1 | -1 | 54.31 | ||||
| 10 | 1 | -1 | 0 | 38.17 | ||||
| 11 | 1 | 0 | -1 | 62.44 | ||||
| 12 | 1 | 0 | 1 | 66.89 | ||||
| 13 | 1 | 1 | 0 | 61.16 | ||||
| 14 | 0 | -1 | -1 | 58.12 | ||||
| 15 | 0 | 1 | 1 | 87.71 | ||||
利用Design-Expert V8.05对表 4中试验数据进行多元回归拟合，得到X1、X2和X3的三元二次回归方程如下，分析结果见表 5。
| 变异来源 Sources of variation |
平方和 Sum of squares |
自由度 Degree of freedom |
均方 Mean square |
F值 F value |
P值 P value |
| 模型Model | 2 929.71 | 9 | 325.52 | 9.69 | 0.011 1* |
| X1 | 332.30 | 1 | 332.30 | 9.89 | 0.025 5* |
| X2 | 588.24 | 1 | 588.24 | 17.50 | 0.008 6** |
| X3 | 106.00 | 1 | 106.00 | 3.15 | 0.135 9 |
| X1X2 | 9.67 | 1 | 9.67 | 0.29 | 0.614 6 |
| X1X3 | 25.60 | 1 | 25.60 | 0.76 | 0.422 7 |
| X2X3 | 332.33 | 1 | 332.33 | 9.89 | 0.025 5* |
| X12 | 471.47 | 1 | 471.47 | 14.03 | 0.013 4* |
| X22 | 1 143.73 | 1 | 1 143.73 | 34.03 | 0.002 1** |
| X32 | 78.81 | 1 | 78.81 | 2.35 | 0.186 2 |
| 残差Residual | 168.02 | 5 | 33.60 | ||
| 失拟项Lack of fit | 147.57 | 3 | 49.19 | 4.81 | 0.176 9 |
| 纯误差Pure error | 20.45 | 2 | 10.23 | ||
| 总和Cor total | 3 097.73 | 14 | |||
| R2=0.945 8 | Radj2=0.848 1 | ||||
| 注：**：极显著，P < 0.01；*：显著，P < 0.05. Note: **: Highly significant, P < 0.01; *: Significant, P < 0.05. |
|||||
Y=86.02-6.45X1+ 8.57X2+ 3.64X3+ 1.56X1X2+ 2.53X1X3+ 9.11X2X3-11.30X12-17.60X22-4.62X32。
由表 5可知，该二次模型显著 (p < 0.05)，且失拟项不显著 (p > 0.05)；经计算该模型决定系数R2为0.945 8，说明该回归方程拟合程度较好；校正决定系数Radj2为0.848 1，说明84.81%的变异能由该模型解释。拟合方程一次项X1对降解率影响显著 (P < 0.05)，X2极显著 (P < 0.01)；二次项X12对降解率影响显著 (P < 0.05)，X22极显著 (P < 0.01)，说明DES和蛋白胨含量均对降解率影响显著且后者较前者影响程度大。此外交互项X2X3对降解率影响显著 (P < 0.05)，X1X2和X1X3均不显著，如图 4-6所示。
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| 图 4 DES和蛋白胨含量对降解率的响应面分析 Figure 4 Response surface plots for the effects of DES and peptone content on degradation rate |
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| 图 5 DES和CaCl2含量对降解率的响应面分析 Figure 5 Response surface plots for the effects of DES and CaCl2 content on degradation rate |
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| 图 6 蛋白胨和CaCl2含量对降解率的响应面分析 Figure 6 Response surface plots for the effects of peptone and CaCl2 content on degradation rate |
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米曲霉在食品工业中发挥着不可替代的作用[26]，也可在畜牧养殖中作为饲料添加剂[27]。已见报道的DES降解菌来源于被污染地区，且均为细菌[28-29]，分离自食品并可降解DES的益生真菌还鲜见报道，米曲霉M-4的来源和安全性使其可以应用于食品环境。适当地改变培养体系中氮源成分或浓度，有助于提高微生物对异生物质的降解能力[30]。本试验中菌株M-4更倾向于有机氮源，这与周波等[24]的报道相一致。Polymenakou等[31]在苯酚降解菌的培养基中使用外加碳源时发现，苯酚降解率下降明显，推测是外加碳源与底物发生竞争抑制性作用的结果。有学者发现在可利用碳源浓度低时，外加生长基质并不抑制反而会加速微生物对异生物质的降解[20]，本试验结果也是如此。通常逐因子法优化发酵条件存在工作量大、耗时长等不足之处，后期结合正交试验也未能有效利用实验数据。本试验先采用单因素试验筛选最佳氮源、碳源和无机盐；其次通过Plackett-Burman设计结合最陡爬坡法，以较少的试验次数从较多因素中快速筛选影响菌株M-4降解DES的关键因素；最后利用Box-Behnken响应面优化了DES的降解条件，达到了快速、有效的目的，为M-4的实际应用提供了数据参考。
经过优化后培养基配方为：蛋白胨1.3%，CaCl2 0.045%，葡萄糖0.5%，K2HPO4 0.15%，KH2PO4 0.05%，NaCl 0.05%，Tween 80 0.2%，DES质量浓度44 mg/L。最佳培养条件为：初始pH 7.5，种龄72 h，转速140 r/min，培养温度28 ℃，培养时间72 h。在此条件下菌株M-4对DES降解率为83.89%，比优化前 (初始降解率60.98%) 提高1.38倍，经SPSS V22软件分析，差异极显著 (p < 0.01)。
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