2017, Vol. 44扩展功能
文章信息
- 田雨顺, 罗鹏, 刘秋婷, 胡超群
- TIAN Yu-Shun, LUO Peng, LIU Qiu-Ting, HU Chao-qun
- 细菌重组系统及其应用研究进展
- Progress on bacterial recombination systems and their application
- 微生物学通报, 2017, 44(2): 473-482
- Microbiology China, 2017, 44(2): 473-482
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.160196
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文章历史
- 收稿日期: 2016-03-07
- 接受日期: 2016-05-18
- 优先数字出版日期(www.cnki.net): 2016-06-08
2. 中国科学院大学生命科学学院 北京 101408
2. College of life sciences,University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 101408,China
基因重组是生物利用重组酶将不同的基因重新组合在一起产生新遗传型个体的方式，它广泛存在于原核生物中，具有维护生物遗传多样性、促进生物进化等重要意义。随着分子生物学、基因组学和结构生物学的发展，多种重组酶不断被发掘，其结构和重组机制也逐渐得到清晰的阐述，为发现和改造重组酶、探索新的基因重组模式提供了广泛的思路，并为利用这些重组机制，开展新颖的细胞遗传学操作工具打下基础。目前，细菌基因重组主要分为同源重组(Homologous recombination)、位点特异性重组(Site-specific recombination)和转座重组(Transposition recombination) 3种类型，它在细菌遗传、变异过程中发挥巨大作用。本文主要介绍了细菌重组系统重组酶的种类、作用机制，并对其应用策略进行了简要阐述。
1 重组酶及相关重组机制 1.1 RecA同源重组系统及相关酶RecA重组系统是细菌内源性同源重组系统，它由RecA和相关的辅助蛋白组成。在行使重组功能过程中，RecA的蛋白以右手螺旋的形式结合单链DNA (ssDNA)片段[1-2]，形成DNA-蛋白纤维结构，这种结构协助RecA蛋白在双链DNA (dsDNA)中寻找单链DNA同源片段，一旦发现同源序列，两同源片段便形成Holliday Junction结构，伴随着ATP的水解作用而发生同源重组[3]。
在RecA重组系统中，不同的辅助蛋白以不同的方式促进RecA蛋白介导DNA发生重组反应。目前被报道的RecA重组系统中重要的辅助蛋白有RecBCD、RecFOR、AddAB和DprA。RecBCD蛋白分子量较大，是一个由RecB、RecC和RecD组成的复合体，具有解旋酶活性和ATP依赖的核酸外切酶活性[4-5]。RecBCD与受损双链DNA上的切口结合，沿DNA链移动，并切割核苷酸形成3′突出末端结构，随后识别Chi位点(5′-GCTGGTGG-3′)[4]，并在Chi位点停顿约5 s以减慢移动速率[4-6]。继而由RecA蛋白介导单链DAN-RecA复合物结合到双链DNA上，形成Holliday Junction结构，从而发生同源重组。作为RecBCD的功能等价物RecFOR和AddAB也在RecA同源重组过程中发挥重要作用。RecFOR蛋白是一个由RecF、RecO和RecR组成的复合体，主要参与ssDNA的修复过程，它移除结合在ssDNA上的SSB (ssDNA-Binding proteins)从而协助RecA结合在ssDNA上[1, 7] (图 1)。AddAB又称RexAB[8-9]，存在于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中[4, 6, 10-11]，是由AddA和AddB组成的复合物，功能与RecBCD类似。Saikrishnan等在2012年获得AddAB蛋白晶体结构以后[12]，AddAB蛋白的功能与结构的关系得到了清晰的阐述[4]。在辅助RecA介导DNA发生同源重组的过程中，AddAB蛋白发挥的作用与RecBCD蛋白相同。AddAB蛋白在遇到Chi位点前，以较高的速率解旋双链DNA，并沿着DNA链移动；遇到Chi位点后发生停顿。与RecBCD蛋白识别的Chi位点序列相比，AddAB蛋白识别的Chi位点序列较短，仅有5个碱基(5′-AGCGG-3′)，且AddAB蛋白识别Chi位点的频率仅有RecBCD的30%，甚至更低。目前关于DprA蛋白的相关报道较少，它被发现在肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)中，可装载RecA蛋白到裸露的ssDNA或SSB包裹的ssDNA上[9]。
在大肠杆菌RecA重组系统中，除了上述辅助蛋白外，RuvAB和RuvC蛋白在催化分支迁移和降解Holliday Junction结构过程中也起到非常重要的作用[2, 7-8]。此外，在枯草芽孢杆菌中，RecU蛋白替换大肠杆菌中的RuvC蛋白发挥降解Holliday junction结构的功能[8]。
1.2 噬菌体及其他细菌同源重组酶组合元件Red同源重组系统是最先由Murphy报道，该系统由λ噬菌体的3个基因exo、bet和gam组成，分别编码Exo、Beta和Gam蛋白，主要用于双链DNA同源重组[13]。Exo蛋白单亚基分子量为 24 kD，具有双链核酸外切酶活性，可结合在双链DNA (dsDNA)末端，沿双链DNA的5′端向3′端降解DNA，产生3′突出端[14]。晶体学研究发现，Exo蛋白核酸外切酶是由3个亚基组成的环形聚合体，具有一个漏斗形的中心通道，在通道一端可容纳双链DNA，而在另一端可容纳单链DNA[2]。相比而言，Exo蛋白对于单链DNA的降解能力较弱。Beta蛋白单亚基分子量为29 kD[15]，是一种单链退火蛋白，在Red同源重组过程中起着决定性作用。在溶液中，Beta蛋白自发地形成环状结构，紧密地结合在单链DNA 3′突出端，介导互补DNA的配对和退火，同时也防止DNA被DNase I等核酸酶降解[2, 15]。此时，Beta蛋白只需结合35 bp的同源单核苷酸链即可。Gam蛋白是Exo和Beta蛋白的功能辅助蛋白，可与RecBCD核酸外切酶和SbcCD核酸内切酶结合，分别形成RecBCD-Gam和SbcCD-Gam复合物，进而抑制RecBCD和SbcCD的活性，从而防止线性DNA被降解[2, 16-17]。
在发生λRed重组过程中，根据宿主个体内有无RecA，将重组分为2种方式，即链入侵(SI)和单链退火(SSA)[2, 15] (图 2)。当宿主细胞内缺失RecA时，重组以SSA方式发生；而当宿主细胞内存在RecA时，重组主要以SI方式发生。
Zhang等在1998年报道了一种大肠杆菌隐蔽型噬菌体Rac噬菌体通过RecE (140 kD)和RecT (33 kD) 蛋白介导的同源重组系统[18]。由于λRed同源重组系统与RecE/T重组系统相似，因此二者合称为Red/ET重组系统，其中λRed同源重组系统中的Exo蛋白与RecE蛋白的功能相同，Beta蛋白与RecT蛋白功能相同。RecE和Exo可分别促进RecT和Beta与DNA的结合[19]。与λRed同源重组系统相比，RecE/T重组系统缺少Gam蛋白[20]，从分子结构角度来说，RecE蛋白是环形四聚体，而Exo是环形三聚体[21]。与RecA系统相比，在单链退火过程中，RecA需要ATP降解产生的能量，而Beta蛋白和RecT则不需要ATP的能量供给[15]。
另外，来自不同噬菌体和细菌的RecE和RecT的类似物在不同细菌同源重组中起着非常重要的作用。2007年van Kessel等在名为Che9c的分枝杆菌噬菌体内发现了重组蛋白RecE和RecT的同系物，分别是gp60和gp61[22-23]。gp60和gp61的功能与RecE和RecT功能类似，即gp60具有核酸外切酶活性，gp61 为单链DNA退火蛋白，介导DNA发生同源重组[23]。
从上述可以看出，同源重组酶由核酸外切酶和退火蛋白两个基本元件和其他辅助功能蛋白构成。目前，已在多种细菌中发现不同同源重组元件，并且其中某些元件已被应用于细菌遗传操作的重组系统中(表 1)[24-35]。
| 细菌 Bacteria | 分类 Classification | 元件 Element | |
| 5′→3′ Exonuclease | ssDNA annealing protein | ||
| Escherichia coli | G- | Exo (phage λ) | Beta (phage λ) |
| RecE (phage Rac) | RecT (phage Rac) | ||
| Salmonella enterica | G- | Exo (phage λ) | Beta phage λ) |
| Yersinia pseudotuberculosis | G- | Exo (phage λ) | Beta (phage λ) |
| Shigella | G- | Exo (phage λ) | Beta (phage λ) |
| Agrobacterium tumefaciens | G- | Exo (phage λ) | Beta (phage λ) |
| Vibrio cholerae | G- | Exo (SXT/R39) | Beta (SXT /R39)) |
| Mycobacterium tuberculosis | G+ | Gp60 (phage Che9c) | Gp61 (phage Che9c) |
| Mycobacterium smegmatis | G+ | Gp60 (phage Che9c) | Gp61 (phage Che9c) |
| Mycobacterium avium | G+ | MAV_0830 (M. avium) | MAV_0829 (M. avium) |
| Pseudomonas syringae | G- | RecEPsy (P. syringae) | RecTPsy (P. syringae) |
| Bacillus subtilis | G+ | Gp34.1 (phage SPP1) | Gp35 (phage SPP1) |
| Listeria monocytogenes | G+ | Orf47 (phage A118) | Orf48 (phage A118) |
| Photorhabdus luminescens | G- | Plu2936 (P. luminescens) | Plu2935 (P. luminescens) |
| Xenorhabdus stockiae | G- | Plu2936 (P. luminescens) | Plu2935 (P. luminescens) |
| Legionella pneumophila | G- | OrfB (L. pneumophila) | OrfC (L. pneumophila) |
| Enterococcus faecalis | G+ | EF2131 (E. faecalis) | EF2132 (E. faecalis) |
| Staphylococcus aureus | G+ | - | Gp20 (phage phiNM3) |
| Lactococcus lactis | G+ | - | Orf245 (phage ul36.2) |
| Lactococcus lactis | G+ | - | RecT1 (L. reuteri) |
| Lactococcus reuteri | G+ | - | RecT1 (L. reuteri) |
| Clostridium acetobutylicum | G+ | - | Cpf0939 (C. perfringens) |
| 注：G+：革兰氏阳性菌；G-：革兰氏阴性菌. Note: G+: Gram-positive bacteria; G-: Gram-negative bacteria. | |||
位点特异性重组是重组酶识别特定DNA位点形成联会复合体，进而发生DNA链的切割和交换，实现靶位点之间的整合、切离或倒位的DNA序列重组反应[36-38]。在这一反应过程中，由位于重组酶催化活性中心的酪氨酸或丝氨酸向DNA磷酸骨架发起进攻，引起DNA链断裂。根据重组酶催化活性中心的2种氨基酸，位点特异性重组酶被划分为两大家族，即酪氨酸重组酶家族(tyrosine recombinases)和丝氨酸重组酶家族(serine recombinases)。两大家族重组酶种类繁多，分别来源于不同细菌、真菌，具有整合、解离、转座、切离和倒位等生物学作用(表 2)。
| 重组酶 Recombinases | 生物学功能 Biological functions | |
| 酪氨酸家族 | Tyrosine recombinases | |
| λ Int | 噬菌体λ与宿主基因组的切离与整合 | |
| Int I | 整合子中基因盒的切离与整合 | |
| L5 Int | 噬菌体L5与宿主基因的切离与整合 | |
| P22 Int | 噬菌体P22与宿主基因的切离与整合 | |
| Cre | P1噬菌体二聚体质粒的解离 | |
| XerC/D、XerS、XerH | 原核生物基因组二聚体的解离 | |
| Int of Tn916/Tn1545 | 环状转座子的切离与整合 | |
| TnpI (Tn4430,Tn5401) | 转座子共合体的解离 | |
| TnpA (Tn554) | 与TnpB、TnpC协同控制转座子的切离与整合 | |
| FimB,FimE | 大肠杆菌纤毛相转变 | |
| Flp | 酵母2μ质粒的倒位 | |
| 丝氨酸家族 | Serine recombinases | |
| TnpR (γδ/Tn3) | 复合型转座子中共合体的解离 | |
| Sin | 葡萄球菌二聚体质粒的消除 | |
| ParA of RP4 | RP4质粒二聚体的切离 | |
| Hin | 沙门氏菌鞭毛的相转变 | |
| Gin/Cin | 噬菌体Mu和P2尾蛋白基因的倒位 | |
| Int of φC31/φBT1/TG1/R4 | 链霉菌噬菌体的切离与整合 | |
| Int of Bxb1/φRv1 | 分枝杆菌噬菌体的切离与整合 | |
| TnpX of Tn4451 | 转座子Tn4451的切离与整合 |
酪氨酸重组酶家族也称λ整合酶家族(λ Integrase family)，广泛存在于原核生物中。从氨基酸水平上看，该家族序列保守性低。但从催化结构域角度来说，该家族的结构域非常保守[37-38]。酪氨酸重组酶一般由2个结构域组成，一个是 N-端DNA结合域，它可联系酶内部核心区；另 一个是C-端区域，它结合DNA并提供全部的催化基团，这2个区域形成一个C-夹结构包裹DNA，进而催化DNA发生重组[38]。
对于酪氨酸重组酶催化过程，目前已经从分子结构和生物化学研究中得到了清楚的阐 释[36-37, 39-40](图 3)。首先，DNA与重组酶形成 DNA-蛋白复合物；随后，重组酶催化活性中心的酪氨酸残基攻击核酸骨架，形成单链断裂切口，产生5′-OH和一个与DNA共价连接的3′磷酸酪氨酸。此时，DNA骨架中的磷酸二酯键断裂产生的能量被转移到磷酸酪氨酸中的共价连接中间体中，由此可以看出，该重组过程不需要额外的能量参与[36-37]。然后，游离的5′-OH攻击配对底物DNA的3′-磷酸酪氨酸，进而形成Holliday Junction结构，经异构化(Isomerization)，再次进行DNA链断裂、连接，最终解离Holliday连接而形成重组产物。
丝氨酸重组酶家族也称解离/倒位家族(resolvase/invertase family)[36, 38]。该家族更为庞大，其蛋白质大小从180个氨基酸到近800个氨基酸不等，但相对于酪氨酸重组酶，丝氨酸重组酶有较为保守的催化结构域[36-37]。根据重组酶蛋白分子量的大小和功能差异，丝氨酸重组酶家族又被分为2个亚族：包括Hin、Gin、TnR等小型丝氨酸重组酶和包括phiC31、Bxb1等大型丝氨酸重组酶[36-37, 41]。在丝氨酸重组酶催化反应过程中，先由DNA与重组酶形成复合物，然后重组酶结构域中的丝氨酸攻击DNA磷酸骨架致使DNA形成切口，切口处形成3′-OH的双链断裂末端和一个与DNA共价连接的5′-磷酸丝氨酸，经联会复合物翻转，双链DNA重新连接，形成重组产物[36-38]。
目前，关于丝氨酸重组酶的催化反应机制已有大量研究。最具有突破性的进展是2013年Rutherford等报道了丝氨酸整合酶-DNA复合物的结构[42]，从而更清晰地阐述了整合酶的作用机制及重组反应过程(图 4)[43]。
酪氨酸重组酶和丝氨酸重组酶催化发生的重组过程存在很多不同点：(1) 酪氨酸重组酶催化2个连续的DNA链交换过程，4条DNA单链并不同时断裂，而丝氨酸重组酶催化过程要求2条DNA双链同时断裂。(2) 亲核氨基酸残基攻击磷酸骨架后，酪氨酸重组酶产生3′磷酸酪氨酸和5′-OH，而丝氨酸重组酶则产生5′磷酸丝氨酸和3′-OH。(3) 在联会复合体中，酪氨酸重组酶催化的DNA链交换位点位于催化域内部，而丝氨酸重组酶催化反应中，交换位点被催化域分开位于外部，这是2个家族最显著的差别[36, 38]。
2 重组酶应用策略目前，在细菌基因工程操作中，重组酶一般被用于染色体或质粒DNA片段的敲除或外源DNA片段的插入过程。基于细菌RecA重组系统的同源重组技术是最先被广泛应用的策略[2, 13-14]。在这种策略中，靶DNA片段的同源片段被克隆在自杀载体上，形成自杀质粒，该质粒通过接合作用从供体菌转移到受体菌中，由于自杀质粒不能在受体菌复制，只能通过RecA重组系统介导的第一次重组整合在受体菌的染色体或质粒上才能维持存在，在这个过程中导致外源DNA片段的插入。自杀质粒往往带有反向选择标记，在反向选择压力下，发生第二次重组，质粒脱离染色体，形成靶DNA片段的缺失[44]。基于RecA重组系统的重组策略在实际应用中也有不少局限性，如：RecBCD具有核酸外切酶活性，可降解线性DNA，因此打靶基因片段需整合于质粒载体上才可进行同源重组[44]；打靶片段需较长的同源臂，重组率 低[13, 45-46]；当前常用的反向选择标记如sacB和ccdB基因不能广泛使用[47]；接合转移的效率低，且要求受体菌具有可供筛选的抗性标记[47-48]。2005年，Demarre等[48]开发了生长缺陷型供体菌及自杀质粒，提高了RecA重组系统中第一次重组整合的效率，并解决了重组技术对受体菌抗性依赖的问题。在此基础上，Luo等[49]开发了新的反向选择标记vm480基因，其表达产物对于革兰氏阴性细菌具有广泛的毒性，并构建了受IPTG或阿拉伯糖诱导的自杀载体，大大提高了重组效率及重组技术的通用性。
同源重组与位点特异性重组结合是当今细菌遗传操作技术中最流行的应用方法。2000年，Datsenko等[45]利用λ噬菌体Red重组系统发展了操作更便捷的细菌染色体基因一步失活技术，成为大肠杆菌及邻近种细菌基因替换或敲除的标准技术。其操作流程为：将一段两侧含有FRT特异位点的抗性基因通过λRed重组酶重组替换靶基因，然后将靶细菌引入辅助质粒，表达Flp重组酶切除抗性基因以达到敲除靶基因的目的。2008年，Herring等[50]和Kolisnychenko等[51]在Datsenko等重组方法基础上开发了另一种基于λRed重组系统的方法——Gene gorging。Gene gorging与前者最明显的区别在于利用I-Sce I归巢内切酶代替辅助质粒上的Flp重组酶，避免了切除抗性基因后仍然留下一个FRT位点(疤痕)的问题。2008年Yu等[52]则进一步改进了Gene gorging法，采用单个质粒代替双质粒系统，单个质粒上带有2个独立的启动子，一个为阿拉伯糖启动子，诱导λRed重组酶表达；另一个为鼠李糖启动子，诱导I-SceI归巢内切酶表达，切割染色体DNA，实现重组。尽管如此，λRed同源重组技术目前仅能在大肠杆菌以及少量邻近细菌中实现[52]，严重制约了该技术的广泛适用性。2009年，Yamamoto等[53]首次将λRed重组质粒pKD46引入霍乱弧菌，完成了霍乱弧菌多个基因的替换，实现了λRed重组技术在与大肠杆菌亲缘关系远的细菌中的应用。他们发现λRed重组系统在霍乱弧菌中的重组效率低，所需的同源臂片段长。此外，他们的成功并不能在更多的细菌物种中复制，笔者试图将pKD46以及衍生质粒pSIM5采用同样方法引入多种弧菌中均不能实现基因重组(未发表)。
除上述将同源重组酶与位点特异性重组酶结合外，将不同位点特异性重组酶结合应用也可实现基因组DNA的插入或敲除[54](图 5)。由此可以看出，不同重组酶间的组合可改变其应用策略，优化应用方法，从而扩展细菌重组系统在细菌遗传操作中的应用能力。
尽管细菌重组系统在基因工程操作中得到广泛应用，但仍存在很多不足。如重组过程中，由于假位点的存在，脱靶导致基因重组异常仍是 一个有待解决的问题。应用位点特异性重组往往会留下一段“疤痕”，如loxp或FRT等，这样的疤痕可能会影响其他基因的表达或产生极性效 应[55-56]。而引用I-Sce I归巢内切酶的无痕λRed方法操作程序复杂，实验周期长，并且重组效率有待进一步提高[46, 50, 52]。在λRed同源重组与转座重组后，染色体会发生DNA分子内的重排现象，导致基因组不稳定[8, 16, 57]。解决上述问题需要经过长期的实验探索来完善基因工程操作方法。
随着细菌重组系统研究的深入，微生物中新的重组系统被不断发现，它们为细菌遗传操作技术的创新提供了基础。如，继XerC/D双组分重组酶发现后，XerS和XerH等单组分重组酶先后被发现[58-59]，它们分别识别difH和difSL位点，解离基因组二聚体。而细菌整合性接合元件家族SXT/R391中存在类似λRed重组系统的基因bet和exo[35, 60]，SXT/R391在弧菌中广泛存在，且实验证实SXT/R391宿主范围广泛[35, 60-61]，提示SXT/R391元件中的Beta/Exo重组系统很可能具有高的重组活性，并且其功能发挥很可能不受宿主菌胞内环境差异的影响。λRed重组系统技术应用的局限性表明迫切需要对此技术进行革新，以扩大其适用对象范围。目前我们对λRed重组质粒进行系列改造的工作正在进行当中，其中包括以SXT/R391元件的Beta/Exo替换λRed重组质粒中的同源基因。
另外，由于不同重组酶对相同细菌的生长产生不同影响，如λRed同源重组系统在鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)体内的表达将减缓细菌的生长速率，而RecE/T同源重组酶却对其生长无影响[20]；并且具有类似重组功能的酶在相同细菌中表达效率存在差异，如λRed和RecE/T重组酶在分枝杆菌(Mycobaterium)中表达效率不如gp60/61重组酶[62]。为此，人工改造重组酶或重组酶基因使其在不同细菌中高效表达也显得十分必要，目前已经有成功的案例，如在链霉菌和分枝杆菌的遗传操作中，人工改造flp基因可提高细菌基因重组效率[53, 56, 63-64]；此外，2012年，Fu等[65]发现全长RecE/T重组酶比λRed和被截短的RecE/T重组酶催化基因重组效率高。
作为细菌遗传操作技术的核心，细菌重组系统在探索基因功能、合成新的次级代谢产物等实验中发挥着巨大作用。随着研究的不断深入，细菌重组系统将会被更广泛地应用在不同生物体中，推动功能基因组学的发展。
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