2017, Vol. 44扩展功能
文章信息
- 陈静, 李斌, 曾庆宾, 罗定棋, 王昌全, 陈强, 刘松青, 辜运富
- CHEN Jing, LI Bin, ZENG Qing-Bin, LUO Ding-Qi, WANG Chang-Quan, CHEN Qiang, LIU Song-Qing, GU Yun-Fu
- 攀枝花地区烤烟可培养内生固氮菌的多样性
- Diversity of culturable endophytic diazotrophic bacteria in flue-cured tobacco in Panzhihua
- 微生物学通报, 2017, 44(2): 428-437
- Microbiology China, 2017, 44(2): 428-437
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.160086
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文章历史
- 收稿日期: 2016-01-25
- 接受日期: 2016-05-23
- 优先数字出版日期(www.cnki.net): 2016-06-08
2. 中国烟草总公司四川省公司 四川 成都 610017;
3. 四川省烟草公司攀枝花市公司 四川 攀枝花 617026;
4. 四川省烟草公司泸州市烟草公司 四川 泸州 646000;
5. 成都师范学院化学与生命科学学院 四川 成都 611130
2. China National Tobacco Corporation, Sichuan Company, Chengdu, Sichuan 610017, China;
3. Panzhihua Branch, Sichuan Tobacco Company, Panzhihua, Sichuan 617026, China;
4. Luzhou Branch, Sichuan Tobacco Company, Luzhou, Sichuan 646000, China;
5. College of Chemistry and Life Science, Chengdu Normal University, Chengdu, Sichuan 611130, China
植物内生菌是指生活史中某一阶段生活在植物组织内，对植物没有明显病害症状的一类微生物，包括内生细菌、内生真菌和内生放线菌[1]。有研究表明，植物内生菌和其宿主之间存在着相互依存或互惠的关系[2]。宿主植物产生的光合产物可为内生菌提供营养，而内生菌产生的促生抗菌活性物质能够促进植物生长、发育，提高植物抗逆性。内生菌产生丰富多样的次生代谢产物，具有多种生物活性，在农业和医药业具有重要的应用潜力。植物内生固氮菌是一类能定殖在植物内部，并与植物宿主联合固氮，对植物基本无害的微生物[3-4]。内生固氮菌占据着植物组织内有利于营养供应和微环境适宜的生态位，避免了化合态氮的抑制及土著微生物的竞争，较根外环境更有利于形成高效固氮体系，进而促进作物的生长及产量的提高[5-7]。
有关烤烟内生菌研究，主要集中于烤烟和白肋烟内生真菌和内生细菌功能鉴定方面[8]。王万能等通过筛选分离到的烤烟内生细菌，获得了对烟草黑胫病有很好防效的菌株，在温室控病实验中发现，这些内生菌不仅具有较广的抗菌谱，而且表现出较好的烤烟促生长特点[9]。陈微等对旺长期烤烟中K326内生细菌多样性进行了研究，分离获得193株内生细菌，鉴定出微杆菌属(Microbacterium)等34个不同的属，其中有20株菌具有淀粉酶活力、19株菌有蛋白酶活力、27株 菌具有木聚酶活力[10]。奚家勤等以烤烟品种中K326为材料分离内生细菌，并以烟草黑胫病菌(Phytophthora parasitica var. nicotianae)为靶标病原真菌，筛选出168株拮抗菌，对黑胫病菌的抑制率在12.54%-50.14%之间，这些内生细菌包括芽孢杆菌属(Bacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas) 3个属[11]。上述研究显示，烤烟内生菌种群多样，具有潜在应用价值，是 一个重要的微生物资源库。但迄今为止，关于烤烟内生固氮菌的研究尚未见相关报道。
本研究通过纯培养手段和分子生物学手段(BOX-PCR)对烤烟内生固氮菌进行了分离及遗传多样性分析，以期揭示烤烟烟叶内生固氮菌的多样性特征，为丰富固氮微生物菌种资源库和开发利用烤烟内生固氮菌提供基础理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料1.1.1 采样点简介： 攀枝花市位于101°08′- 102°15′E、26°05′-27°21′N，中国西南川滇交界部，金沙江与雅砻江汇合处。年均气温20 ℃，降水充沛且多为夜雨，日照充足，全年无霜期300 d以上，具有利于优质烤烟生长的良好气候和生态环境。攀枝花是四川省优质烤烟产区之一，主要集中分布在仁和区和米易县。本次样品取自米易县云峰乡(101°57′0.64′′E、26°57′4.70′′N)、新山乡(102°09′57.26′′E、26°50′28.11′′N)、草场乡(102°07′9.94′′E、26°55′0.52′′N)和仁和区(101°44′13.49′′E、26°30′4.57′′N)。取样地点为植烟时间10年以上，且烟草质量、产量都较高的种植区。
1.1.2 供试材料及采样方法： 于2014年7月中旬，以云87为供试材料，在旺长期进行采样。在田间按“五点法”采集长势相近的烤烟植株下层叶片，每点10株，每株5叶，共50片叶，记录采样时烤烟的农艺性状。将叶片装入没有拆封的保鲜袋中，贴上标签并封口，置于4 ℃保温箱中迅速带回实验室。
1.1.3 培养基： 内生固氮菌分离用Ashby培养 基[12]、溶钾能力测定用溶钾筛选培养基[13]、溶磷能力测定用溶磷筛选培养基[14]。
1.1.4 主要试剂和仪器： 2×Taq PCR Master Mix，天根生化科技(北京)有限公司；硅藻土，美国Promega公司；各种引物，上海生工生物工程股份有限公司；Thermo ScientificTM TRACETM 1300气相色谱仪，美国Thermo fisher公司；UV-2100紫外可见光光度计，美国Unicoh公司；T100 PCR仪，美国Bio-rad公司。
1.2 菌株分离选取烤烟叶片各5 g进行表面消毒，方法参考王泽等[15]的报道。研磨后将研磨液涂于Ashby培养基平板上，以最后一遍的洗涤水作对照，以检测表面消毒是否彻底。28 ℃倒置培养3-4 d，根据菌落大小、形态和色泽等表观特征挑取单菌落并进行划线纯化。
1.3 固氮酶活性测定固氮酶活性测定采用乙炔还原法[16]。将纯化后的内生固氮菌接种于10 mL Ashby半固体培养基的血清瓶中，重复3次，28 ℃培养48 h，在无菌条件下将血清小瓶盖换成橡胶塞，用无菌注射器抽出10%的气体，然后给每瓶注入2 mL C2H2，继续培养24 h。从各培养瓶中取反应气体10 μL，注入气相色谱仪中，测定C2H2和C2H4含量。以接种但未注入C2H2的血清小瓶作为对照。按下列公式计算固氮酶活性N=(hx×c×V)/(hs×常数×t)。式中，hx为样品峰值，hs为标准C2H4峰值，c为标准C2H4浓度(mol/L)，V为小瓶体积(mL)，常数为标准C2H4在测试时的体积(mL)，t为培养时间(h)，N为C2H4浓度，即固氮酶活，单位：μmol·(C2H4)/(h·mL)。
1.4 溶磷溶钾特性测定为评价分离菌株的应用潜力，采用培养基溶解圈法[13-14]测定菌株的溶磷溶钾特性。将分离菌株点接于筛选培养基上，28 ℃培养7 d，观察接种菌株周围有无透明溶解圈形成。测定溶解圈直径，计算HD/CD值(其中HD为溶解圈直径，CD为菌落直径)来表征溶磷溶钾能力。每个菌株重复4次。
1.5 分泌吲哚乙酸(IAA)特性测定采用Salkowski比色法[17]测定分离菌株分泌IAA能力。取培养到对数期的菌液50 μL于含 0.5 g/L色氨酸的牛肉膏液体培养基中，重复3次，28 ℃、140 r/min培养到对数期(36 h)，每支试管取50 μL菌液于洗净白瓷板中，加入100 μL Salkowski显色剂，25 ℃下避光30 min，如出现粉红色，表明产生IAA。
定量测定上述分泌吲哚乙酸分离菌株的IAA产量。8 000 r/min离心5 min获得培养物上清液 2 mL，加入4 mL Salkowsi显色剂，25 ℃下避光30 min后，530 nm下比色测定其吸光度OD值，重复3次。以空白培养基作对照，并以IAA的标准样品对应的光密度做标准曲线，计算IAA的产 量(mg/L)=(OD值-固定值B)/系数K。
1.6 DNA提取及BOX-PCR分析将菌株活化后接种于Ashby培养基，28 ℃培养2 d，挑取单菌落采用硅藻土提取DNA[18]，然后用1%琼脂糖凝胶检测，-20 ℃保存。选取BOX引物(5′-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3′)进行PCR扩增[19]。PCR反应体系：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，引物(10 μmol/L) 0.5 μL，模板DNA (10 mg/L) 1 μL，加ddH2O补齐至25 μL。PCR反应条件：95 ℃ 4 min；95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，65 ℃ 8 min，共35个循环；65 ℃ 16 min。扩增产物以2 000 bp DNA ladder作分子量标准，在80 V电压下经1.0%琼脂糖凝胶电泳60 min，用凝胶成像系统拍照检测。将BOX-PCR图谱中同一位置有带的记为“1”，无条带的记为“0”。采用软件NTSYSpc 2.1中的平均连锁聚类法(UPGMA)进行聚类分析并获得树状图谱。
1.7 16S rRNA基因测序及系统发育树构建基于菌落特征、溶磷溶钾能力和IAA产量以及BOX-PCR遗传分型综合结果，选取代表菌株以引物1492r [5′-TACGG(C/T)TACCTTGTTACGACT T-3′]和25f (5′-AACTKAAGAGTTTGATCCTGGC TC-3′)进行分离菌株16S rRNA基因片段的扩增[20]。PCR反应体系：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，引物(10 μmol/L)各0.5 μL，模板DNA (10 mg/L) 1 μL，加ddH2O补齐至50 μL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，共35个循环；72 ℃ 10 min。扩增产物送上海生工生物工程股份有限公司测序。将所得序列上传到NCBI网站进行比对，利用ClustalX软件进行多序列比对[21]，用MEGA 5.0软件采用邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树。序列信息查询号为：KU298550-KU298565。
2 结果与分析 2.1 烤烟旺长期农艺性状攀枝花不同地区烤烟旺长期农艺性状见表 1。除云峰烤烟各指标值相对较大外，其他地区烤烟农艺性状间的差异不大。云峰烤烟的株高、叶面积系数、节距和茎围都比其他地区的烤烟植株要高，颜色表现正常；而仁和烤烟植株在株高、叶片数、叶面积系数和茎围等指标方面小于其他地区的烤烟植株，叶色为黄绿色，长势表现弱于其他地区烤烟植株。
| 采样点 Sampling point | 株高 Plant height (cm) | 叶片数 Number of leaves | 叶面积系数 Leaf area index | 节距 Pitch (cm) | 茎围 Stem diameter (cm) | 叶色 Leaf colour |
| 草场 Caochang | 78.4 | 18 | 2.00 | 4.38 | 6.37 | 浅绿 |
| 新山 Xinshan | 79.2 | 18 | 1.89 | 4.47 | 6.21 | 绿 |
| 云峰 Yunfeng | 85.7 | 18 | 2.51 | 5.29 | 7.10 | 绿 |
| 仁和 Renhe | 69.7 | 15 | 1.55 | 4.49 | 5.67 | 黄绿 |
从攀枝花4个地区烤烟叶片中分离得到的内生固氮菌数量差异较大，其中从草场云烟87烟叶分离的固氮菌最多，为31株；其次从云峰烟叶分离到23株固氮菌，新山分离到6株；仁和烟叶分离的固氮菌最少，为2株。
2.3 固氮酶活性经测定，62株内生固氮菌中有20株菌株的固氮酶活高于0.8 μmol/(h·mL)，介于0.8-2.12 μmol/(h·mL)之间，表现出明显的固氮酶活力(表 2)，其它42株菌未检测出明显固氮酶活性。20株内生固氮菌中分离自草场烟叶的有9株，云峰的6株，新山3株，仁和2株。具有明显固氮酶活的菌株中，酶活最高的是分离自米易云峰的YF13菌株，而最低的为分离自新山的XS3菌株。
| 菌株编号 Strain code | 固氮酶活性 Nitrogenase activity (μmol/(h·mL)) | 分离源 Isolation resource |
| CC2 | 1.35 | 草场 |
| CC3 | 1.29 | 草场 |
| CC9 | 1.60 | 草场 |
| CC12 | 0.97 | 草场 |
| CC13 | 1.43 | 草场 |
| CC19 | 1.24 | 草场 |
| CC1 | 1.53 | 草场 |
| CC2 | 1.21 | 草场 |
| RH7 | 2.03 | 仁和 |
| CC4 | 0.83 | 草场 |
| RH9 | 1.93 | 仁和 |
| XS1 | 1.25 | 新山 |
| XS3 | 0.82 | 新山 |
| XS5 | 1.92 | 新山 |
| YF13 | 2.12 | 云峰 |
| YF1 | 1.67 | 云峰 |
| YF2 | 0.95 | 云峰 |
| YF7 | 1.30 | 云峰 |
| YF9 | 1.49 | 云峰 |
| YF22 | 1.47 | 云峰 |
菌株产IAA、溶磷溶钾特性指标结果(表 3)表明：62株分离菌株中，有8株能产IAA，占分离菌株的12.9%；4株有溶磷能力，占分离菌株的6.5%；3株有溶钾能力，占分离菌株的4.8%。其中CC23、RH9和XS5都同时具有溶钾和溶磷的效果，这3个菌株的溶钾溶磷的功能相对较突出。
| 菌株编号 Strain code | HD/CD | IAA产量 Indole-3-acetic acid (IAA) production (mg/L) | |
| 溶钾特性 Potassium solubilizing activities | 溶磷特性 Phosphate solubilizing activities | ||
| YF22 (KU298554) | Nd | Nd | 0.194 |
| CC3 (KU298555) | Nd | Nd | 2.314 |
| CC9 (KU298556) | Nd | Nd | 3.940 |
| YF4 (KU298558) | Nd | Nd | 2.597 |
| YF13 (KU298561) | Nd | Nd | 0.459 |
| CC4 (KU298565) | Nd | Nd | 0.283 |
| CC23 (KU298551) | 2.50 | 2.50 | Nd |
| RF9 (KU298552) | 3.50 | 2.50 | Nd |
| YF9 (KU298560) | Nd | Nd | 0.371 |
| XS5 (KU298564) | 2.50 | 2.50 | Nd |
| CC19 (KU298550) | Nd | Nd | 1.643 |
| XS3 (KU298553) | Nd | 0.75 | Nd |
| 注：Nd：未测定；HD：溶解圈直径；CD：菌落直径. Note: Nd: Not detected; HD: dissolution circle diameter; CD: colony diameter. | |||
为认识烤烟叶片内生固氮菌的遗传多样性，以BOX引物对供试固氮菌基因组进行PCR扩增，遗传图谱类型见表 4，62株菌被分成16种不同的遗传图谱类型。
| 种/属 Species/genus | 代表菌株 Representative strain (accession No.) | 谱带类型(菌株数量) rDNA type (strain number) | 16S rRNA基因比对分析 16S rRNA gene BLAST analysis | |
| 近缘菌株 Nearest type strain (accession No.) | 相似性 Similarity (%) | |||
| Bacillaceae | YF22 (KU298554) | 1 (5) | Bacillus megaterium (KC311342) | 99 |
| CC3 (KU298555) | 16 (1) | Bacillus aryabhattai (KJ009467) | 100 | |
| CC9 (KU298556) | 13 (1) | Bacillus megaterium (KC311342) | 99 | |
| CC13 (KU298557) | 12 (5) | Bacillus sp. (HM567010) | 99 | |
| YF4 (KU298558) | 9 (1) | Bacillus sp. (LC065158) | 94 | |
| YF7 (KU298559) | 14 (1) | Bacillus aryabhattai (KJ009464) | 99 | |
| YF13 (KU298561) | 10 (2) | Bacillus sp. (JX575605) | 99 | |
| CC12 (KU298563) | 3 (1) | Bacillus aryabhattai (KF208489) | 99 | |
| XS5 (KU298564) | 5 (1) | Bacillus sp. (KC466112) | 99 | |
| CC4 (KU298565) | 11 (1) | Bacillus megaterium (KR150755) | 99 | |
| Pantoea | CC23 (KU298551) | 4 (2) | Pantoea sp. (KP704412) | 99 |
| RH9 (KU298552) | 6 (1) | Pantoea ananatis (KF254658) | 99 | |
| YF9 (KU298560) | 7 (1) | Pantoea sp. (KF202777) | 91 | |
| Curtobacterium | CC19 (KU298550) | 15 (1) | Curtobacterium sp. (KR906477) | 99 |
| XS3 (KU298553) | 2 (36) | Curtobacterium luteum (JX437941) | 99 | |
| CC24 (KU298562) | 8 (2) | Curtobacterium sp. (KR906477) | 99 | |
| 注：图谱类型根据BOX-PCR扩增条带片段来划分. Note: rDNA types were defined based upon the amplification fragment of BOX-PCR. | ||||
基于BOX遗传图谱，对16株代表菌株进行16S rRNA基因片段测序，片段长度约1 500 bp。通过Blast比对分析，按照匹配度最高的原则，鉴定菌株系统发育特征。其中谱带类型2的菌株数量最多，显示出它们的优势性。CC3与Bacillus 中的Bacillus aryabhattai (KJ009467)相似性为100%。YF9与Pantoea中的Pantoea sp. (KF202777)相似性为91% (表 4)，YF4与Bacillus中的Bacillus sp. (LC065158)相似性为94%，其余菌株与匹配菌株的相似度均为99%。
利用ClustalX软件进行多序列比对，用MEGA 5.0软件构建系统发育树。系统发育分析结果(图 1)表明，代表菌株分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。革兰氏阳性菌有Bacillus 和Curtobacterium 2个属，共13株菌，其中Bacillus是烤烟烟叶内生固氮菌的优势菌属，占代表菌株的62.5%。而革兰氏阴性菌只有Pantoea一个属，3株菌，占代表菌株的18.8%。
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| 图 1 内生固氮菌代表菌株16S rRNA 基因序列的系统发育分析 Figure 1 Phylogenetic analysis of 16S rRNA gene sequences of representative strains of the endophytic diazotrophs 注：左下端标尺表示碱基置换频率，括号中的序号表示序列查询号. Note: The scale of lower left means substitution frequency, numbers in brackets means query number of sequence information. |
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烤烟是茄科(Solanaceae)烟草属(Nicotiana)一年生或多年生草本植物。它是我国经济作物中一项重要的农产品，是卷烟生产的主要原料，也是我国出口的大宗农产品之一[22]。有研究表明，烤烟内生菌具有促进烤烟生长、防治病虫害的作用，具有潜在应用价值[23-25]。
内生固氮菌能够为宿主植物提供氮源、产生植物激素类物质、促进内根际的生理变化及溶磷等生态学作用[26-29]。罗菲等[30]以东乡野生稻(Oryza rufipogon)为材料，探究其根际可培养细菌多样性及其植物促生活性，结果表明东乡野生稻根际蕴含着丰富的固氮、溶磷和产IAA等生物活性细菌，其中溶磷菌以芽孢杆菌属(Bacillus)、泛菌属(Pantoea)和鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)为主，产IAA菌以泛菌属为主。周怡等[31]对大豆内生芽孢杆菌的分离和促生菌株的筛选及鉴定进行了研究，分离到的40株内生芽孢杆菌大部分表现出促进大豆发芽生长的能力，其中SNl0E1菌株使豆芽长度增长41%，百株鲜重增长28%。通过表型测定、生理生化及16S rRNA基因序列分析，确定SN10El菌株为巨大芽孢杆菌(Bacillus megatherium)。谭志远等[32]从普通野生稻(Oryza rufipogon)中分离到37株内生固氮菌，并测定固氮酶活性，其值分布在0.93 µmol C2H4/(h·mL)至42.52 µmol C2H4/(h·mL)之间。本实验分离到的内生固氮菌表现出了明显的溶磷溶钾特性和产IAA能力及固氮酶活，分离菌株中有2株泛菌、1株芽孢杆菌显示出溶钾活性；2株泛菌、1株短小杆菌属和1株芽孢杆菌显示出溶磷活性；8株菌产IAA；大部分菌株的固氮酶活较低，固氮酶酶活最高的菌株是RH7和YF13，固氮酶活分别为2.03 μmol/(h·mL)和 2.12 μmol/(h·mL)。同时，内生固氮菌分离数最多的烟株在农艺性状方面也表现最佳，显示烤烟内生固氮菌在烤烟生产上存在潜在应用价值。
关于烤烟内生菌研究，裴洲洋[33]以河南省主栽烤烟品种的根、茎、叶为试验材料，对9个烤烟品种的内生真菌多样性及变化规律进行了研究，共获得977个菌株，其中943株产孢，分属于 15个属，准确鉴定到种的有23种，其中链格孢菌属(Alternaria)和毛壳属(Chaetomium)是烟草内生真菌的优势属。云南省烟草农业科学研究院相关研究人员以云南省主栽烤烟品种的根、茎、叶为试验材料，系统地完成了烟草内生菌资源收集、分离、鉴定和多样性特征研究，共分离、鉴定和保藏烟草内生细菌1 393株，分属芽孢杆菌属(Bacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)和假单胞菌属(Pseudomonas)等30多个属，51个种[34]。黄晓辉等对4个烟草品种进行了内生菌的分离计数、初步分类与拮抗筛选研究，结果表明烟草中有大量的内生细菌存在，而且以革兰氏阴性菌为主[35]。与前人研究相似，本试验分离到的内生固氮菌属于Bacillus、Pantoea、Curtobacterium等3个属，其中Bacillus为优势菌属，为革兰氏阳性细菌。
综上，本文对烤烟烟叶进行了可培养内生固氮菌多样性及固氮酶活性、溶磷溶钾、促生功能分析。分离菌株分属于芽孢杆菌属(Bacillus)、泛菌属(Pantoea)、短小杆菌属(Curtobacterium)等3个属，以芽孢杆菌属(Bacillus)内生固氮菌为优势种，表现出潜在应用价值。
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