2017, Vol. 44扩展功能
文章信息
- 黄莹娜, 熊小毛, 胡远亮, 梁运祥, 赵述淼
- HUANG Ying-Na, XIONG Xiao-Mao, HU Yuan-Liang, LIANG Yun-Xiang, ZHAO Shu-Miao
- 基于PCR-DGGE 和高通量测序分析白云边酒窖泥细菌群落结构与多样性
- Bacterial community and diversity in pit mud of Baiyunbian liquor analyzed by PCR-DGGE and high-throughput sequencing
- 微生物学通报, 2017, 44(2): 375-383
- Microbiology China, 2017, 44(2): 375-383
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.160080
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文章历史
- 收稿日期: 2016-01-21
- 接受日期: 2016-05-30
- 优先数字出版日期(www.cnki.net): 2016-10-09
2. 湖北白云边酒业股份有限公司 湖北 松滋 434200;
3. 湖北师范大学生命科学学院 湖北 黄石 435002
2. Baiyunbian Company Limited of Hubei Province, Songzi, Hubei 434200, China;
3. College of Life Science Hubei Normal University, Huangshi, Hubei 435002, China
白云边酒作为兼香型白酒的典型代表，创造性结合酱香型白酒高温制曲、高温堆积和浓香型白酒混蒸续渣、泥窖发酵工艺，酒体风味兼具酱香型白酒的幽雅细腻和浓香型白酒的绵甜甘冽，酱浓协调，别具风格[1]。白云边酒采用泥底砖窖发酵，窖泥细菌的代谢产物为酒体风味物质的形成提供了重要前体。研究窖泥细菌群落结构组成，探究不同窖龄窖泥的细菌群落结构差异，对揭示参与形成白酒浓酱兼香型风味的功能菌，指导白酒生产，具有重要意义。
近年来，已陆续有研究人员利用PCR-DGGE[2-5]和基因克隆[6]等分子生物学技术对白酒酒醅和窖泥的微生物群落结构进行了深入研究。DGGE和基因克隆技术简单高效，但检测限低，具有较大局限性，更适合反映窖泥细菌群落的优势种群，尚不能全面系统地揭示窖泥细菌群落结构和多样性[7]。高通量测序能产出大量数据，对样品基因进行细致分析，是解析复杂环境中微生物物种组成和相对丰度的重要工具[8-9]，已被广泛应用于土壤[10-11]、湿地[12]、海洋[13]和沼气[14-15]等样品微生物群落研究。运用高通量测序技术解析窖泥细菌群落结构也陆续见报。本研究结合PCR-DGGE、基因克隆和高通量测序技术，系统研究2年和23年窖泥细菌群落结构和多样性，以期在分子水平上为揭示白云边酒浓酱兼香型风味形成机制提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料1.1.1 窖泥：样品采集自白云边2年新窖(望月酿造基地)和23年老窖(老厂区)，采用5点取样法，取池底对角线上的4个顶点及中部交叉点，共5个点的窖泥各100 g，混合均匀后于-20 ℃保存。
1.1.2 主要试剂和仪器：Taq DNA聚合酶，北京全式金生物技术有限公司；TEMED，上海生工生物工程技术服务有限公司；去离子甲酰胺，德国APPLICHEM公司；MagExtractor (PCR & Gel Clean Up)试剂盒，东洋纺(上海)生物科技有限公司；Gel Extraction Kit，美国OMEGA公司；pMD18-T载体，日本TaKaRa公司。40%甲叉双丙烯酰胺、Mycycle PCR仪、Dcode DGGE电泳仪，美国Bio-Rad公司；ST 16R高速冷冻离心机、ND-2000超微量分光光度计，美国Thermo公司。
1.1.3 引物：16S rRNA基因V3区引物P2 (5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)、P3 (5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和GC-P3 (GC序列为5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG-3′)，由上海英俊生物技术公司合成。
1.3 方法1.2.1 窖泥总DNA提取及纯化：用CTAB法提取2年和23年窖泥中微生物基因组DNA，-20 ℃保存。
1.2.2 16S rRNA基因V3 区 PCR 扩增：PCR反应体系(50.0 μL)：5 U/μL Taq酶0.5 μL，10xbuffer 5.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4.0 μL，10 μmol/L P2/GC-P3引物各1.0 μL，100 ng/μL模板DNA 1.0 μL，灭菌双蒸水37.5 μL。PCR条件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，MagExtractor (PCR & Gel Clean Up)试剂盒纯化后，用超微量分光光度计测定DNA浓度。
1.2.3 PCR产物 DGGE 检测：采用浓度为8%聚丙烯酰胺凝胶，变性梯度46%-54% (100%变性剂为 7 mol/L尿素和40%去离子甲酰胺)，PCR纯化产物上样量400 ng，凝胶于60 ℃、0.5xTAE电泳液中20 V电泳10 min后，80 V电泳828 min，银染，拍照。最后采用Quantity One分析软件完成match匹配，读取图谱上条带的光密度值Trace Int，输入Bio-Dap软件计算多样性指数。
1.2.4 DGGE主条带基因克隆测序：用无菌手术刀片将可见条带切胶回收，胶条用灭菌去离子水清洗后，捣碎于25 μL灭菌去离子水中，4 ℃静置 16 h，取3 μL上清液，用P2/P3引物进行PCR扩增，扩增程序同1.2.2，35个循环。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶条带用Gel Extraction Kit回收。取4.5 μL回收产物连接至pMD18-T载体，转入100 μL大肠杆菌DH5α感受态细胞，于900 μL LB液体培养基中37 ℃复苏培养1 h，5 000 r/min离心1 min后去掉900 μL上清，余下液体混匀后涂布于加有100 mg/L氨苄青霉素的LB培养基，37 ℃培养12 h，用灭菌的牙签随机挑选克隆子，用P2/P3引物做菌落PCR，阳性克隆子由铂尚生物技术(上海)有限公司测序，测序结果通过NCBI GenBank数据库比对。
1.2.5 窖泥总D NA 高通量测序：窖泥总DNA通过MagExtractor (PCR & Gel Clean Up)试剂盒纯化后，由上海锐翌生物科技有限公司，通过Illumina平台(Miseq)进行高通量测序。
1.2.6 OTU聚类分析：通过QIIME平台去除原始序列中的低质量序列，根据标签序列分开来自不同样品的序列，利用Usearch软件在0.97相似度下进行聚类，对聚类后的序列进行嵌合体过滤后，得到用于物种分类的OTU (Operational taxonomic units)[16]。
1.2.7 物种注释和丰度分析：使用Qiime软件从OTU中分别提取一条tag序列作为代表序列，使用RDP方法，与已知物种16S数据库(GreenGenes，http://greengenes.lbl.gov)比对，对每个OTU进行物种分类、归类后，根据每个OTU中序列的条数，得到OTU丰度表，并进行后续分析[17]。
1.2.8 Alpha多样性分析：利用QIIME软件计算样品的Alpha多样性值，做出相应的稀释曲线[18]。
2 结果与分析 2.1 细菌 DGGE 图谱分析及主条带基因克隆测序采用CTAB法提取窖泥微生物基因组DNA，大小约23 kb。利用引物P2/GC-P3对2、23年窖泥总DNA进行16S rRNA基因V3区PCR扩增，扩增得到大小为250 bp的目的片段，用该产物进行DGGE电泳分析，结果显示2年和23年窖泥的条带分布情况存在较大差异(图 1)。
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| 图 1 窖泥细菌 16S rRNA 基因 V3 区 DGGE 图谱 Figure 1 DGGE of V3 regions of the bacterial 16S rRNA genes from pit mud samples 注：A：2年窖泥；B：23年窖泥. Note: A: Pit mud at 2 years; B: Pit mud at 23 years. |
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图谱经过Quantity One和Bio-Dap软件分析，计算多样性指数，结果表明：2年窖泥物种丰度高于23年窖泥，分别为32、28；2年窖泥的Shannon’s多样性指数H′为3.40，高于23年窖泥的H′ (3.29)；2年窖泥的Simpson’s多样性指数(1/D)高于23年窖泥，分别为28.149、25.786，这一结果与H′一致；对于优势度指数Berger-Parker index (d)，2年窖泥与23年窖泥相差不大，分别是0.060、0.055。这些结果表明，2年窖泥的细菌群落结构多样性高于23年窖泥(表 1)。
| Index | 2-year | 23-year |
| Species richness (S) | 32 | 28 |
| Shannon’s index (H′) | 3.40 | 3.29 |
| Simpson’s index (1/D) | 28.149 | 25.786 |
| Berger-Parker index (d) | 0.060 | 0.055 |
将DGGE胶图的20条主条带切胶回收，各条带阳性克隆子测序比对结果显示：2年窖泥细菌优势菌群为香味菌属(Myroides sp.)、黄杆菌属(Flavobacterium sp.)、乳杆菌属(Lactobacillus sp.)、醋杆菌属(Acetobacter sp.)、豪氏变形杆菌(Proteus hauseri)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterrium sp.)、梭菌属(Clostridium sp.)和不动杆菌属(Acinetobacter sp.)，23年窖泥中细菌优势菌群包括假交替单胞 菌属(Pseudoalteromonas sp.)、酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)、豪氏变形杆菌(Proteus hauseri)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterrium sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、摩根氏菌属(Morganella sp.)和普通变形杆菌(Proteus vulgaris)，其中豪氏变形杆菌(Proteus hauseri)和鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterrium sp.)为二者共有优势菌属；在2、23年窖泥中丰度相差较大的为1、2、4、9、14、17号条带对应菌群，即香味菌属(Myroides sp.)、黄杆菌属(Flavobacterium sp.)、乳杆菌属(Lactobacillus sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)和普通变形杆菌(Proteus vulgaris)；3、11、19号条带对应的不动杆菌属(Acinetobacter sp.)和醋杆菌属(Acetobacter sp.)只在2年窖泥中检出，而5、7、15号条带对应的假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas sp.)、酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)和摩根氏菌属(Morganella sp.)只在23年窖泥中检出(表 2)。
| 条带编号 Band No, |
相似菌属 Closest genera |
中文名称 Chinese name |
相似度 Similarity (%) |
序列登录号 Accession No. |
| 1 | Myroides sp. | 香味菌属 | 100 | KP789061.1 |
| 2 | Flavobacterium sp. | 黄杆菌属 | 100 | HQ446525.1 |
| 3 | Acinetobacter sp. | 不动杆菌属 | 100 | AB860302.1 |
| 4 | Myroides sp. | 香味菌属 | 100 | KF506840.1 |
| 5 | Pseudoalteromonas sp. | 假交替单胞菌属 | 94 | JX287300.1 |
| 6 | Nitrospina sp. | 硝化刺菌属 | 90 | JX645704.1 |
| 7 | Clostridium tyrobutyricum | 酪丁酸梭菌 | 100 | KF611979.1 |
| 8 | Lactobacillus acetotolerans | 耐乳酸杆菌 | 99 | NR_044699.2 |
| 9 | Lactobacillus sp. | 乳杆菌属 | 100 | KP012266.1 |
| 10 | Corynebacterium sp. | 棒状杆菌属 | 99 | KF502438.1 |
| 11 | Acetobacter sp. | 醋杆菌属 | 100 | KM005161.1 |
| 12 | Proteus hauseri | 豪氏变形杆菌 | 100 | KM406467.1 |
| 13 | Sphingobacterrium sp. | 鞘氨醇杆菌属 | 100 | HQ663897.1 |
| 14 | Bacillus sp. | 芽孢杆菌属 | 100 | HM566888.1 |
| 15 | Morganella sp. | 摩根氏菌属 | 100 | KJ831422.1 |
| 16 | Myroides sp. | 香味菌属 | 99 | KC906253.2 |
| 17 | Proteus vulgaris | 普通变形杆菌 | 100 | KT794006.1 |
| 18 | Clostridium sp. | 梭菌属 | 98 | DQ196622.2 |
| 19 | Acinetobacter sp. | 不动杆菌属 | 100 | KJ831540.1 |
| 20 | Bacillus sp. | 芽孢杆菌属 | 99 | KC589184.1 |
数据统计如表 3所示，分别从2、23年窖泥样品中读取14 212、19 698条序列，最终被利用上的有效序列数分别为9 356和11 945，序列平均长度为419 bp，OTU的数量分别是136和112，Chao 1指数分别为135.71和114.28，测序深度指数Coverage分别为95.6%和96.4%，Chao 1和Coverage指数表明测序深度已基本覆盖到样品中所有物种，能反映样品中绝大多数细菌的多样性。另外，样品Shannon指数(5.29、4.86)和PD whole tree指数(8.32、6.36)均表现为2年窖泥高于23年窖泥，说明相比23年窖泥，2年窖泥细菌群落有更高的物种均匀度和群落多样性，此结果与DGGE检测一致。
| Sample name |
Amplicon type |
Clean read |
Average length |
Mapped reads |
OTUs | Chao 1 | Shannon | PD whole tree | Coverage (%) |
| 2-year | 16S | 14 212 | 419 | 9 356 | 136 | 135.71 | 5.29 | 8.32 | 95.6 |
| 23-year | 16S | 19 698 | 419 | 11 945 | 112 | 114.28 | 4.86 | 6.36 | 96.4 |
| 注：Clean read：质控后，样品中总的高质量数tag数量；Average length：高质量tag平均长度；Mapped reads：最终被利用上的序列数；Otus：每个样品的otu数量. | |||||||||
| Note: Clean read: The number of reads after quality control; Average length: The average length of clean reads; Mapped reads: The number of reads be used to clustering analysis; OTUs: The number of OTU in sample. | |||||||||
在门水平上，窖泥细菌由变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinobacteria)组成。其中，变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)在2年和23年窖泥中丰度相差不大，分别为39.2%、41.1%和26.8%、26.7%，拟杆菌门(Bacteroidetes，32.2%、20.5%)较多存在于2年窖泥，而放线菌门(Actinobacteria，1.8%、11.8%)在23年窖泥中丰度更高(图 2A)。
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| 图 2 不同窖泥样品门 (A) 、科 (b) 水平细菌丰度比例 Figure 2 Relative abundance of bacterial 16S rRNA genes from pit mud samples at the phylum level (A) and family level (B) identified with a modified 16S rRNA gene database |
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科水平上统计结果如图 2B所示，2、23年窖泥中丰度前10的细菌分别占总体的78.9%、81.8%。两种窖泥共有优势菌科为黄杆菌科(Flavobacteriaceae，21.3%、3.0%)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae，12.1%、14.7%)、鞘脂杆菌科(Sphingobacteriaceae，6.9%、16.9%)、梭菌科(Clostridiaceae，4.2%、2.4%)、产碱杆菌科(Alcaligenaceae，3.4%、4.4%)和布鲁氏菌科(Brucellaceae，2.8%、4.7%)。在2年窖泥中占优势而在23年窖泥中丰度偏低的细菌菌科为莫拉氏菌科(Moraxellaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)和黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)；在23年窖泥中占优势而在 2年窖泥中丰度偏低的细菌菌科为棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)和葡萄球菌科(Staphylococcaceae) (表 4)。
| Taxon name | 2-year (%) | 23-year (%) |
| Flavobacteriaceae | 21.3 | 3.0 |
| Enterobacteriaceae | 12.1 | 14.7 |
| Moraxellaceae | 9.7 | 1.0 |
| Lachnospiraceae | 7.6 | 1.6 |
| Lactobacillaceae | 7.1 | 1.8 |
| Sphingobacteriaceae | 6.9 | 16.9 |
| Clostridiaceae | 4.2 | 2.4 |
| Xanthomonadaceae | 3.8 | 0.0 |
| Alcaligenaceae | 3.4 | 4.4 |
| Brucellaceae | 2.8 | 4.7 |
| Acetobacteraceae | 2.5 | 15.3 |
| Corynebacteriaceae | 1.4 | 9.6 |
| Bacillaceae | 0.6 | 7.7 |
| Staphylococcaceae | 0.0 | 3.1 |
属水平检测结果如表 5所示，2年窖泥优势菌属为香味菌属(Myroides)、不动杆菌属(Acinetobacter)、梭菌属(Clostridium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、肠杆菌属(Enterobacter)、Woh lfahrtiimonas和变形杆菌属(Proteus)等，菌属相对丰度大于1%的占总体74.1%；23年窖泥优势菌属为鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、醋杆菌属(Acetobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、摩根氏菌属(Morganella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、梭菌属(Clostridium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)等，菌属相对丰度大于1%的占总体87.0%。其中，2年窖泥特有优势菌属为Dysgonomonas、Fluviicola、变形杆菌属(Proteus)和Wohlfahrtiimo nas，23年窖泥特有优势菌属为葡萄球菌属(Staphylococcus)、Hazenella、魏斯氏菌属(Weissella)、葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)和摩根氏菌属(Morganella)。两种窖泥共有优势菌属(≥1.0%)为棒状杆菌属(Corynebacterium)、香味菌属(Myroides)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、梭菌属(Clostridium)、醋杆菌属(Acetobacter)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、肠杆菌属(Enterobacter)和不动杆菌属(Acinetobacter)。属水平物种中有20种为2年窖泥特有，9种为23年窖泥特有，二者共有的为55种(图 3)。两种窖泥菌属检出情况与DGGE结果基本一致。
| Taxon name | 2-year (%) | 23-year (%) |
| Corynebacterium | 1.4 | 9.6 |
| Dysgonomonas | 2.1 | 0.0 |
| Fluviicola | 1.0 | 0.0 |
| Myroides | 19.8 | 2.0 |
| Sphingobacterium | 6.4 | 16.7 |
| Bacillus | 0.6 | 7.7 |
| Oceanobacillus | 0.2 | 1.2 |
| Staphylococcus | 0.0 | 3.1 |
| Hazenella | 0.0 | 1.2 |
| Lactobacillus | 7.1 | 1.6 |
| Weissella | 0.0 | 2.3 |
| Clostridium | 9.2 | 3.4 |
| Ochrobactrum | 0.9 | 4.2 |
| Acetobacter | 2.5 | 13.0 |
| Gluconacetobacter | 0.0 | 2.2 |
| Advenella | 0.1 | 1.7 |
| Alcaligenes | 2.7 | 2.0 |
| Comamonas | 1.2 | 0.2 |
| Enterobacter | 3.9 | 2.4 |
| Morganella | 0.1 | 8.9 |
| Proteus | 3.5 | 0.0 |
| Providencia | 0.4 | 1.6 |
| Serratia | 0.3 | 1.2 |
| Acinetobacter | 9.7 | 1.0 |
| Wohlfahrtiimonas | 3.6 | 0.0 |
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| 图 3 不同窖泥样品细菌属水平 Venn 图 Figure 3 Venn diagram of bacteria from different pit mud samples |
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相对丰度在2年和23年窖泥间波动较大的菌属为香味菌属(Myroides，19.8%、2.0%)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium，6.4%、16.7%)、醋杆菌属(Acetobacter，2.5%、13.0%)、不动杆菌属(Acinetobacter，9.7%、1.0%)、棒状杆菌属(Corynebacterium，1.4%、9.6%)、梭菌属(Clostridium，9.2%、3.4%)、摩根氏菌属(Morganella，0.1%、8.9%)、芽孢杆菌属(Bacillus，0.6%、7.7%)、乳杆菌属(Lactobacillus，7.1%、1.6%)和苍白杆菌属(Ochrobactrum，0.9%、4.2%) (图 4)。此结果也与DGGE结果基本一致。
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| 图 4 窖泥样品间丰度波动前 10 的细菌菌属 Figure 4 Top 10 fluctuations in the composition of bacteria between the pit mud samples |
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经DGGE、克隆文库和高通量测序分析，得出棒状杆菌属(Corynebacterium)、香味菌属(Myroides)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、梭菌属(Clostridium)、醋杆菌属(Acetobacter)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、肠杆菌属(Enterobacter)和不动杆菌属(Acinetobacter)为白云边窖泥绝对优势菌属。此外，发现白云边2年窖泥的细菌群落多样性高于23窖泥，与陶勇等[7]报道窖泥微生物多样性在1-25年间随窖龄增加而升高，在25年以后保持相对稳定有所不同。究其原因，可能是白云边2年窖泥还保留部分原土壤的细菌菌群，而经过23年驯化的窖泥，在细菌菌群动态更替过程中，选择了更适应窖池酿酒环境的功能菌群，导致23年窖泥相对驯化成熟的细菌群落多样性相较2年窖泥反而偏低。
研究发现部分菌属相对丰度在2、23年窖泥中差异较大，其中鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、醋杆菌属(Acetobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、摩根氏菌属(Morganella)、芽孢杆菌属(Bacillus)和苍白杆菌属(Ochrobactrum)在 2种窖泥中均有检出，但在23年窖泥中的相对丰度高于2年窖泥，葡萄球菌属(Staphylococcus)、Hazenella、魏斯氏菌属(Weissella)和葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)为23年窖泥特有，在2年窖泥中未检出，推测这些菌属在白云边窖泥老熟过程中发挥了积极作用。此外，醋杆菌属(Acetobacter)、魏斯氏菌属(Weissella)和葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)作为产酸菌，可产生乙酸和葡糖酸，酸类物质在白酒中的比例对口感影响较大，据此推测它们和白云边酒香味形成有关。
在浓香型白酒窖泥研究中，叶光斌等[6]、王明跃等[19]、Guo等[20]研究发现拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)为优势菌门；陶勇等[7, 21]利用焦磷酸测序在浓香型白酒窖泥中检测到乳杆菌属(Lactobacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)和理研菌属(Petrimonas)为优势菌属；施思等[2]、Ding等[22]通过DGGE检测发现梭菌属(Clostridium)是浓香型白酒窖泥的优势菌属；Liang等[23]证明浓香型白酒窖泥优势菌门包括厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)和互养菌门(Synergistetes)，梭菌属(Clostridium)、乳杆菌属(Lactobacillus)和芽孢杆菌属(Bacillus)为优势菌属。在酱香型窖泥研究中，王莉等[24]证明梭菌科(Clostridiaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)和热厌氧杆菌科(Thermoanaerobacteriaceae)为优势菌科；黄治国等[25]、张倩等[26]均认为芽孢杆菌属(Bacillus)在酱香型白酒酿造中起重要作用。与前人研究结果相比，本研究在浓酱兼香型白酒窖泥中检出的优势菌门——变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(B acteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)，均为浓香型白酒窖泥优势菌门；部分优势菌属——乳杆菌属(Lactobacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)和梭菌属(Clostridium)，在浓香型和酱香型白酒窖泥中均有检出，这3个菌属在3种香型白酒窖泥中均占优势，因此推测乳杆菌属(Lactobacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)和梭菌属(Clostridium)是白酒酿造的重要菌属。综合分析以上结果，浓酱兼香型白酒窖泥兼具部分浓香型和酱香型白酒窖泥的优势菌群，另有部分浓、酱香型白酒窖泥优势菌群在浓酱兼香型白酒窖泥中未发现，除因为不同酒厂窖泥菌群必然存在一定差异外，表明白云边酒浓酱兼香型独特酒香不是依靠两种香型白酒窖泥的功能菌简单累加混合发酵形成，应有特定菌群参与影响浓、酱两种香型风味物质融合及浓酱兼香型独特风味物质形成。棒状杆菌属(Corynebacterium)、香味菌属(Myroides)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、醋杆菌属(Acetobacter)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、肠杆菌属(Enterobac ter)和不动杆菌属(Acinetobacter)在浓香型和酱香型白酒窖泥中鲜有报道，它们作为白云边窖泥特有优势菌属，可能对白云边酒独特浓酱兼香型酒香形成有重要贡献。
在窖泥细菌群落结构研究中，DGGE与高通量测序检测结果基本一致。两种检测方法各有优势，DGGE检测结果显示直观、操作方便，但DGGE无法检测基因组中DNA含量少于1.5%的种群[12]，所以它反映的是样品中的优势菌群，部分低丰度菌种未能检出，而高通量测序能提供更多关于低丰度细菌类群的信息，能更全面系统地反映窖泥细菌群落组成。
本研究对白云边两种窖龄窖泥的细菌群落组成进行探究和比较，揭示了可能在白云边酒酿造中起关键作用的菌群，在分子水平上为研究白云边酒浓酱兼香型独特风味形成机理提供依据。今后可通过纯培养从窖泥中获得相关菌株，研究其生理特性，以期揭示白云边窖泥的具体功能菌，进一步为白云边酒生产和酒质改善提供理论依据。
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