2017, Vol. 44扩展功能
文章信息
- 余永红, 段园园, 董会娟, 马建荣, 王海洪
- YU Yong-Hong, DUAN Yuan-Yuan, DONG Hui-Juan, MA Jian-Rong, WANG Hai-Hong
- 茄科雷尔氏菌脂酰-CoA 合成酶的功能鉴定
- Identification and function research of the fatty acyl-CoA synthetase in Ralstonia solanacearum
- 微生物学通报, 2017, 44(2): 366-374
- Microbiology China, 2017, 44(2): 366-374
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.160688
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文章历史
- 收稿日期: 2016-09-26
- 接受日期: 2016-11-24
- 优先数字出版日期(www.cnki.net): 2016-12-05
2. 河南省三门峡市卢氏县第一高级中学 河南 三门峡 472200;
3. 华南农业大学生命科学学院 广东省农业生物蛋白质功能与调控重点实验室 广东 广州 510642)
2. The First Senior High School of Lushi County, Sanmenxia, He′nan 472200, China;
3. College of Life Sciences, South China Agricultural University/Guangdong Provincial Key Laboratory of Protein Function and Regulation in Agricultural Organisms, Guangzhou, Guangdong 510642, China
脂肪酸氧化分解产生能量是生物体主要能量来源之一，其中主要的氧化形式是β-氧化。外源及内源性的脂肪酸进入β-氧化前必须进行活化，生成脂酰辅酶A (CoA)[1]。脂酰-CoA合成酶(Fatty acyl-CoA sythetase，FACS)在CoA和ATP存在的情况下催化游离脂肪酸合成脂酰-CoA，反应分两步进行，首先FACS催化游离脂肪酸与ATP结合生成脂酰-AMP，然后催化脂酰-AMP与CoA结合生成脂酰-CoA[2]。在细菌细胞内，长链脂酰-CoA可参与磷脂的合成，或直接进入氧化分解过程，产生的乙酰-CoA和NADH，进入三羧酸循环和电子传递链，供应机体所需的大量能量[3]。
在大肠杆菌(Escherichia coli)中，fadD基因编码唯一的脂酰-CoA合成酶，将跨膜转运的外源脂肪酸活化生成脂酰-CoA[4]。铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)基因组中含有6个fadD同源基因fadD1-fadD6，都能互补大肠杆菌fadD突变株，参与不同链长脂肪酸的氧化分解，但不同FabD的底物专一性不同，其中FabD4在脂肪酸氧化分解中起关键作用[5-6]。恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)基因组编码两个脂酰-CoA合成酶FadD1和FadD2，其中FadD1在脂肪酸代谢中起主要作用，而FadD2只有在FadD1失活时才表现功能[7]。苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti) FadD还参与菌体的运动性、生物被膜的形成以及植物根部定殖等过程[8]。
茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)又名青枯菌，一种常见的农作物致病菌，引起细菌性青枯病[9]。茄科雷尔氏菌寄主范围极为广泛，可侵染54个科的450余种植物，其中马铃薯、番茄、烟草等茄科作物受害最为严重，在世界范围引起重大经济损失[9-10]。茄科雷尔氏菌引起植株萎蔫的致病机制十分复杂，其脂肪酸代谢途径为群体感应信号分子等致病相关因子的合成提供前体。因此，研究脂肪酸代谢途径将有助于寻找新的抗菌药物靶点，为抵抗植物青枯病害提供新的思路[11-12]。为此，本课题组采用异体遗传互补、体外酶学分析和基因突变等手段 ，研究了茄科雷尔氏菌GMI1000中脂酰-CoA合成酶RsFadD在脂肪酸代谢等方面的功能。
1 材料与方法 1.1 材料1.1.1 菌株、质粒和培养基：研究所用到的大肠杆菌菌株有BW25113 (野生型)、S17-1、DH-5α、BL21(DE3)、fadD突变株JW1794和茄科雷尔氏菌GMI1000。使用的质粒有pSRK-Km[13]、pBAD24M、pET-28b和pK18mobsacB，其他载体均为上述质粒的衍生质粒(具体构建过程见下文)，具体细菌菌株和质粒见表 1。BG (g/L：细菌酪蛋白10.0，酵母提取物1.0，水解酪蛋白酸1.0，葡萄糖5.0)用作培养茄科雷尔氏菌的丰富培养基，M9 (g/L：Na2HPO4 6.0，KH2PO4 3.0，NaCl 0.5，NH4Cl 0.1，CaCl2 0.007 5，MgSO4 0.12，水解酪蛋白酸1.0)作为检测茄科雷尔氏菌脂肪酸合成缺陷菌株的基础培养基，脂肪酸添加浓度为0.2% (质量体积比)，同时添加1% (质量体积比)聚氧乙烯醚(Brij-58)作为助溶剂。抗生素的使用浓度如下：30 mg/mL氯霉素(Cm)、100 mg/L氨苄青霉素(Amp)、30 mg/L卡那霉素(Km)。诱导剂L-阿拉伯糖(Ara)使用浓度为0.02%，异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)使用浓度为1 mmol/L。
| 菌株及质粒 Strains or plasmids | 特征 Characteristics | 来源 Source |
| E. coli strains | ||
| BL21(DE3) | ompT hsdS B (rB- mB-) (DE3) | Lab collection |
| DH-5α | φ80d lacZΔM15 endA1recA1hsdR17(rK-,mK+) | Lab collection |
| S17-1 | TcrSmr,recA,thi,pro,hsdR-M+RP4::2-Tc::Mu: Km::Tn7,λpir | Lab collection |
| BW25113 | Wild type strain of E. coli K-12 | Lab collection |
| JW1794 | BW25113 fadD::Km,fadR- | Lab collection |
| JW-HB1 | JW1794 complemented with pDY03 | This study |
| JW-HB2 | JW1794 complemented with pDY04 | This study |
| JW-HB3 | JW1794 complemented with pBAD24M | This study |
| R. solanacearum strains | ||
| GMI1000 | Wide type | Lab collection |
| RsYH1 | Cmr,Kmr,pDY07 in GMI1000 | This study |
| RsYH2 | Cmr,GM1000 ∆fadD | This study |
| RsYH3 | Cmr,Kmr,GM1000 ∆fadD/pDY08 | This study |
| Plasmids | ||
| pMD19 | Ampr,T-vector | TaKaRa |
| pBAD24M | Ampr,expression vector | Lab collection |
| pET-28b | Kmr,expression vector | Lab collection |
| pK18mobsacB | Kmr,conjugation vector | Lab collection |
| pSRK-Km | Kmr,broad-host-range expression vector containing lac promoter and lacIq,lacZα+ | [13] |
| pDY01 | Ampr,E. coli fadD gene in T-vector | Lab collection |
| pDY02 | Ampr,R. solanacearum fadD gene in T-vector | This study |
| pDY03 | Ampr,EcfadD in pBAD24M | This study |
| pDY04 | Ampr,RsfadD in pBAD24M | This study |
| pDY05 | Kmr,EcfadD in pET-28b | This study |
| pDY06 | Kmr,RsfadD in pET-28b | This study |
| pDY07 | Kmr,RsfadD in-fame deletion fragment inserted to pK18mobscaB between EcoR I/Hind III sites | This study |
| pDY08 | Kmr,RsfadD in pSRK-Km | This study |
1.1.2 主要试剂和仪器：限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Taq和Pfu DNA聚合酶、Marker DL2000、标准蛋白质、T-载体克隆、质粒提取和DNA凝胶回收等试剂盒均购自大连TaKaRa公司；氯霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、IPTG、阿拉伯糖、蔗糖、各种脂肪酸等试剂购自Sigma公司；PCR扩增引物的合成以及核酸序列测定由生物工程(上海)股份有限公司完成。恒温摇床、恒温培养箱、超净工作台，上海智城分析仪器制造有限公司；PCR仪、电泳仪，北京东胜创新生物科技有限公司；分光光度计、气相色谱质谱联用仪，日本岛津公司。
1.2 DNA 重组技术分别以大肠杆菌BW25113和茄科雷尔氏菌GMI1000基因组为模板，以表 2中所列引物PCR分别扩增获得大肠杆菌fadD (EcfadD)和茄科雷尔氏菌fadD (RsfadD)基因。扩增产物纯化后分别连入pMD19-T载体，通过测序验证获得质粒pDY01(EcfadD)和pDY02(RsfadD)。而后用Nde I和Hind Ⅲ双酶切后回收基因片段，分别克隆到表达载体pBAD24M上，获得互补质粒pDY03(EcfadD)、pDY04(RsfadD)；克隆到pET-28b上获得pDY05(EcfadD)、pDY06(RsfadD)。RsfadD还克隆到pSRK-Km载体上获得pDY08。
| 引物名称 Primer name |
序列 Primer sequence (5′→3′) |
长度 Size (bp) |
| RsfadD Nde I | AGGCATATGGAGAAACCGTGGCTGAAGCACTA | 32 |
| RsfadD Hind III | CCCAAGCTTTTGCCTTACGCGCGCTTCTTCA | 30 |
| EcfadD Nde I | AGGCATATGAAGGTTTGGCTTAACCG | 25 |
| EcfadD Hind III | AATAAGCTTTCAGGCTTTATTGTCCACTTTG | 30 |
| RsfadD P1 EcoR I | TAGGAATTCATGGAGAAACCGTGGCTGAA | 29 |
| RsfadD P2 | CCTGCGGACGCGTGGCCACGACGATGTGCT | 30 |
| RsfadD P3 | CTGGGCCAGCGGTCCGCAGGTCATGGCCGG | 30 |
| RsfadD P4 Hind III | ACTAAGCTTACGCGCGCTTCTTCATCG | 26 |
| RsfadD check up | TGTCTGGTGACGCGTGCC | 18 |
| RsfadD check down | ATCGACATTCGCCAGGAGA | 19 |
| 注：引物中下划线序列为引入的酶切位点. | ||
| Note: The underlined sequences are the introduced restriction sites. | ||
以茄科雷尔氏菌GMI1000基因组DNA为模板，分别PCR扩增RsfadD基因上下游约500 bp片段，回收后通过融合PCR技术将各自上下游片段融合，获得RsfadD (UpDn)，经EcoR I和Hind III酶切后连接到pK18mobsacB上，获得质粒pDY07。
将pDY07分别转化大肠杆菌S17-1后，与茄科雷尔氏菌GMI1000在BG平板上30 ℃共培养48 h，然后用1 mL BG培养基将培养物悬浮，稀释到10-2后涂布于含有Cm、Km的BG平板，30 ℃培养48-72 h获得单菌落。选取单菌落培养后提取总DNA，用引物RsfadD P1和P4进行PCR检测，获得一次重组菌株RsYH1。进一步将一次重组菌株在添加BG (Cm)中培养36 h后，涂布于含有Cm和10%蔗糖的BGS平板，PCR筛选出RsfadD被敲除的二次重组菌株RsYH2。
1.4 蛋白质的表达与分离纯化将表达质粒pDY05(EcfadD)和pDY06(RsfadD)分别转化大肠杆菌BL21(DE3)后，FadD蛋白表达与分离纯化参照文献[14-15]进行。同时参照文献[16-17]中的方法，分别分离纯化大肠杆菌丙二酸单酰CoA:ACP转移酶(FabD)、3-酮脂酰ACP还原酶(FabG)、3-羟基脂酰ACP脱水酶/异构酶(FabA)、烯脂酰ACP还原酶(FabI)、哈氏弧菌脂酰ACP合成酶(AasS)和大肠杆菌holo-ACP蛋白，以及茄科雷尔氏菌Rsp1094，并且体外合成己酰ACP、辛酰ACP、癸酰ACP以及月桂酰ACP。
1.5 脂酰 -CoA 合成酶体外功能检测与催化活性测定体外检测FadD是否具有脂酰-CoA合成酶活性参照文献[15]。具体做法如下：反应体系50 μL，含有0.1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0)，50 μmol/L NADH，50 μmol/L NADPH，1 mmol/L β-巯基乙醇，100 μmol/L丙二酸单酰-CoA，1 mmol/L CoA，50 μmol/L Holo-ACP，25 mmol/L MgCl2，25 mmol/L ATP，100 μmol/L不同链长脂肪酸，大肠杆菌FabD、FabG、FabA、FabI各0.1 μg，反应在添加不同来源的0.1 μg FadD后37 ℃保温1 h，用分离胶浓度为17.5%，且含有2.5 mol/L尿素的非变性蛋白质凝胶电泳进行分析。
脂酰-CoA合成酶活性测定参照文献[5]进行，检测反应体系中辅酶A (CoA-SH)的减少量。反应体系为0.15 mol/L Tris-HCl (pH 7.2)，1 mmol/L辅酶A (CoA)，10 mmol/L MgCl2，2 mmol/L EDTA，0.1% Triton X-100，1 mmol/L脂肪酸，1 μg FadD，37 ℃孵育。每20 s取75 μL反应体系加入到600 μL 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸) (DTNB，0.4 mmol/L)溶液中，测定412 nm处吸光值。
2 结果与分析 2.1 生物信息学分析脂酰-CoA合成酶(FACS)催化脂肪酸的羧基连上辅酶A (CoA)，形成脂酰-CoA (图 1A)，是脂肪酸利用的关键步骤。茄科雷尔氏菌GMI1000基因组已完成测序[18]。利用大肠杆菌脂酰-CoA合成酶(EcFadD)序列同源比对GMI1000基因组，结果发现RSc2857 (命名为RsfadD)为大肠杆菌fadD的同源基因，注释为脂酰-CoA合成酶，处于功能未知的基因簇中。RsFadD含有569个氨基酸残基，与EcFadD的序列相似性为72%，一致性为57%。EcFadD含有两个高度保守的序列元件，ATP/AMP识别位点和脂肪酸结合位点[19]。进一步序列分析发现RsFadD也含有这两个保守元件，仅有个别氨基酸差异(图 1B、1C)。根据生物学信息学分析结果，推测RsfadD编码脂酰-CoA合成酶，在脂肪酸代谢过程中具有重要作用。为验证这一观点，本课题组对其进行了以下研究。
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| 图 1 脂酰 -CoA 合成酶催化反应以及 RsFadD 保守元件比对 Figure 1 FACS catalyzed reaction and alignment of RsFadD conserved motifs 注：A：脂酰-CoA合成酶催化的反应；B：ATP/AMP识别位点序列比对；C：脂肪酸结合位点序列比对. Note: A: FACS catalyzed reaction; B: Alignment of ATP/AMP signature motif; C: Alignment of fatty acid binding motif. |
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大肠杆菌JW1794是野生菌BW25113中fadD的插入失活突变株，该菌株在基础培养基中需添加油酸才能恢复生长[20]。为验证RsfadD的功能，将其克隆到受阿拉伯糖诱导的表达载体pBAD24M上，获得质粒pDY04(RsfadD)。将pDY03(EcfadD)和pDY04(RsfadD)转化大肠杆菌JW1794，并检测转化子在添加油酸的基础培养 基上的生长情况，结果如图 2所示。大肠杆菌JW1794以及空载体pBAD24M转化子都不能生长，pDY03(EcfadD)的转化子能正常生长，而pDY04(RsfadD)的转化子也能生长，但生长弱于野生菌。以上结果说明RsfadD基因编码产物具有脂酰-CoA合成酶活性，能互补大肠杆菌fadD的突变。
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| 图 2 RsfadD 基因互补大肠杆菌 fadD 突变株 JW1794 Figure 2 Complementation of E. coli fadD mutant JW1794 with RsfadD |
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为进一步研究RsFadD在体外的生物学功能，将RsfadD克隆到pET-28b上，获得表达质粒pDY06(RsfadD)。将pDY06转化大肠杆菌BL(DE3)后，在37 ℃诱导蛋白质表达，结果显示RsFadD能可溶性表达(结果未列)。采用Ni-NTA亲和层析，纯化获得N端融合有His-tag标签的RsFadD。经SDS-PAGE检测为单一条带，分子量为63.3 kD。与推测的分子量相符，表明纯化成功(图 3A)。
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| 图 3 RsFadD 对不同链长脂肪酸的酶活性分析 Figure 3 Enzymatic characterization of RsFadD with fatty acids of different chain length 注：A：RsFadD纯化；B：RsFadD催化产物电泳分析. 1、3、5、7分别为己脂酰ACP (C6:0-ACP)、辛脂酰ACP (C8:0-ACP)、癸脂酰ACP (C10:0-ACP)、月桂酰ACP (C12:0-ACP)，2、4、6分别以正己酸(C6:0)、正辛酸(C8:0)、正癸酸(C10:0)为底物催化生成的产物；C：测定RsFadD对不同链长脂肪酸催化活性. Note: A: RsFadD purification. M: Protein marker,1: RsFadD; B: Electrophoretic analysis of products catalyzed by RsFadD. The migration positions of hexanoyl-ACP (C6:0-ACP),octanoyl-ACP (C8:0-ACP),capryl-ACP (C10:0-ACP) and lauryl-ACP (C12:0-ACP) are shown in lane 1,3,5,7 respectively; C: Activity determination of RsFadD with fatty acids of different chain length. |
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大肠杆菌FadD (EcFadD)能以中长链脂肪酸和辅酶A (CoA)为底物，催化生成脂酰-CoA。为检测RsFadD是否有具有类似功能，本课题组首先以不同链长的脂肪酸为底物，添加RsFadD合成脂酰-CoA，但产物不容易检测。茄科雷尔氏菌中FabW(RSp0194)为一种新型的3-酮脂酰ACP合成酶III，能催化不同链长的脂酰-CoA和丙二酸单酰ACP (Malonyl-ACP)聚合，合成3-酮脂酰ACP，可进一步被3-酮脂酰ACP还原酶(FabG)、3-酮脂酰ACP脱水异构酶(FabA)、烯脂酰ACP还原酶(FabI)催化生成延长两个碳原子的脂酰ACP[16]。利用该策略，我们以合成的脂酰-CoA为底物，体外重建脂肪酸合成体系(图 3B)。由图 3可见，RsFadD能以正辛酸(C8:0)为底物合成辛脂酰-CoA (C8:0-CoA)，进一步被RsFabW/G/A/I催化延伸生成癸脂酰ACP (C10:0-ACP) (lane 4)。与此类似，RsFadD催化生成癸脂酰-CoA (C10:0-CoA)，而后被催化延伸生成月桂酰ACP (C12:0-ACP) (lane 6)；RsFadD也能催化生成己脂酰-CoA (C6:0-CoA)，进一步催化延伸生成辛脂酰ACP (C8:0-ACP)，但由于RsFabW能继续催化辛脂酰ACP与丙二酸单酰ACP缩合，最终生成癸脂酰ACP (C10:0-ACP) (lane 2)。以上结果再次证明，RsFadD具有脂酰-CoA活性。
本课题组进一步利用分光光度法测定了RsFadD对不同链长脂肪酸的催化活性，结果如图 3 C所示。与EcFadD类似，RsFadD对中长链脂肪酸(C6:0-C16:0)都具有活性，且活性随着链长的增加而升高，对肉豆蔻酸(C14:0)活性最高，而后对棕榈酸(C16:0)的催化活性稍有下降。但RsFadD对不同链长脂肪酸(C6:0-C16:0)的催化活性较低，约为EcFadD催化活性的50%。
2.4 茄科雷尔氏菌 RsfadD基因突变菌株的构建以上异体遗传互补、体外酶学分析都证明了茄科雷尔氏菌fadD编码脂酰-CoA合成酶。为进一步在细胞内研究RsfadD的生理功能，我们按照图 4A的策略构建RsfadD敲除突变株。首先构建了含有RsfadD上下游序列的自杀性载体pDY07,转化大肠杆菌S17-1后，通过接合作用导入茄科雷尔氏菌GMI1000，在BG (Cm和Km)平板筛选获得一次重组菌株RsYH1。将RsYH1培养后涂布于含有10%蔗糖的BG (Cm)平板，筛选出对Km敏感的备选菌株，用引物RsfadDCheck Up和Check Down (表 1)进行PCR检测，筛选到只扩增出约1.0 kb特异条带的菌株，并对其基因组fadD上下游区域进行测序(图 4B、4C)。结果显示染色体上fadD被成功敲除，获得基因敲除突变株RsYH2。进一步将RsfadD表达质粒pDY08导入突变株RsYH2，获得回补菌株RsYH3。
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| 图 4 RsfadD 敲除突变株 RsYH2 的构建 Figure 4 Construction of RsfadD deletion mutant RsYH2 注：A：RsfadD突变株的构建策略；B：野生菌与突变株中fadD区域分析：C：野生菌与突变株fadD区域PCR扩增. Note: A: Strategy of RsYH2 isolation; B: Genetic organization of the fadD region in GMI1000 or RsYH2; C: PCR analysis of genomic DNA from GMI1000 (lane 2) and RsYH2 (lane 3). CH: chromosome; Up: the upstream fragment of RsfadD; Dn: the downstream fragment of RsfadD. |
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首先测定了RsfadD突变株RsYH2在丰富培养基BG上的生长情况，结果显示RsYH2生长与野生菌GMI1000无明显差异(结果未列)，对盐、酸的敏感性以及运动性等方面，都与野生菌无差异(结果未列)。进一步检测了野生菌与突变株在以不同链长脂肪酸作为唯一碳源的培养基上的生长情况，结果如表 3所示。野生菌GMI1000能利用不同链长的脂肪酸作为碳源，能正常生长，但RsfadD突变株RsYH2生长显著减弱，在添加棕榈酸(C16:0)或异油酸(C18:1)的平板上不能生长。回补菌株RsYH3生长较突变株RsYH2有一定程度的恢复，但仍生长较弱。这一结果证明RsfadD编码脂酰-CoA合成酶，在脂肪酸的利用中起重要作用，但突变株RsYH2还能微弱生长，说明茄科雷尔氏菌中可能还有其他编码脂酰-CoA合成酶的基因。
| Strains | C6:0 | C8:0 | C10:0 | C12:0 | C14:0 | C16:0 | C18:1 |
| GMI100 | +4 | +4 | +5 | +3 | +3 | +2 | +5 |
| RsYH2 | +1 | +2 | +2 | +1 | +1 | - | - |
| RsYH3 | +2 | +3 | +3 | +2 | +2 | +1 | +2 |
| 注：-：平板上没有生长；+：培养6 d后能生长. 其中+1为极微弱生长，+5为生长良好. | |||||||
| Note: -: no growth on a plate; +: growth after 6 days. +1: Very little growth; +5: Heavy growth. | |||||||
在模式生物大肠杆菌中，外膜蛋白FadL将长链脂肪酸转运进入细胞质后，脂酰-CoA合成酶(FadD)将其催化形成脂酰-CoA，进入β-氧化产生大量的乙酰-CoA和ATP，因此FadD在脂肪酸利用中具有重要功能。茄科雷尔氏菌能侵染广泛的寄主，引起危害巨大的青枯病，在世界范围造成重大经济损失，因而开发针对性的抗菌药物是防控黑腐病的重要途径。脂肪酸在茄科雷尔氏菌的信号分子合成与致病性等方面都具有重要作用，本课题组已对其脂肪酸合成相关多个基因功能进行了深入研究[21-22]，但国内外还没有关于茄科雷尔氏菌脂酰-CoA合成酶的报道。
本文利用生物信息学方法，同源比对发现茄科雷尔氏菌RSc2857(RsfadD)为大肠杆菌fadD的同源基因，编码蛋白具有较高的序列相似性，以及保守的ATP/AMP识别位点和脂肪酸结合位点。异体遗传互补实验结果显示，RsfadD能恢复大肠杆菌fadD突变株在以脂肪酸为唯一碳源的基础培养基上的生长；体外活性检测也证明RsFadD为脂酰-CoA合成酶；RsfadD突变株在以脂肪酸为唯一碳源的基础培养基上生长较野生菌显著变弱。以上结果都证明，RsfadD编码脂酰-CoA合成酶，在脂肪酸利用过程中发挥重要作用。
大肠杆菌fadD是其基因组中唯一的脂酰-CoA合成酶基因，fadD突变株不能在以脂肪酸为唯一碳源的基础培养基上生长。但RsfadD突变株在该培养基上能微弱生长，表明茄科雷尔氏菌可能在含有其他的脂酰-CoA合成酶突变株中发挥作用。在铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌中都已报道了多个脂酰-CoA合成酶基因[6-7]，也印证了上述推测。因此综合利用多种生物学方法，研究茄科雷尔氏菌中其他脂酰-CoA合成酶生物功能，将是进一步研究的方向。
体外活性测定结果显示，RsFadD对不同链长脂肪酸的活性都要低于大肠杆菌FadD (EcFadD)。文献报道，EcFadD的ATP/AMP识别位点中第361位谷氨酸是活性关键位点[2]，而RsFadD在第360位(按照EcFadD序列，图 1b)苏氨酸突变为丝氨酸，推测一定程度上影响了催化活性。
野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv. campestris)中RpfB为脂酰-CoA合成酶，对不同链长的脂肪酸具有催化活性，在信号分子DSF (Diffusible signal factor)降解以及短链脂肪酸利用中发挥重要作用[20, 23]。本文测定结果显示，RsFadD对不同链长脂肪酸也都具有活性，推测FadD还可能参与β-氧化之外的其他途径。催化生成的长链脂酰-CoA (>C10:0)在细胞内可进行β-氧化，或参与膜磷脂的合成，而中短链长的脂酰-CoA (C6:0-C10:0)可作为茄科雷尔氏菌FabW的底物，重新与丙二酸单酰-ACP (Malonyl-ACP)聚合，生成长链脂肪酸或其他生物活性分子，因此，我们推测RsFadD还参与短链脂肪酸的回收利用。
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