磷元素是农作物生长必需的三要素之一^[1]，以多种形式参与农作物的生理生化代谢过程，直接影响农作物的生长代谢及产量。研究表明我国约有74%的耕地土壤缺磷^[2]，而耕地土壤中却含有大量的难溶性磷酸盐，造成这种现象的主要原因是磷元素的固定。在农业生产中主要是通过施加磷肥来解决土壤缺磷问题，但长期施加磷肥，不仅对生态环境造成污染，而且使磷元素固定过程加剧，破坏土壤结构，造成土壤板结。因此，通过生物学的方法寻求高效溶磷微生物迫在眉睫，对提高土壤中难溶磷的利用、磷肥的利用率以及生态环境的改善具有重要意义。

溶磷菌是一类能将难溶性磷转化为可溶性磷的微生物。目前，研究报道的溶磷菌主要有伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、曲霉属(Penicillium)、青霉属(Aspergillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、肠细菌属(Enterbacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、黄杆菌属(Flavobacterium)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)等^[3-8]。溶磷菌一方面可将土壤中的难溶性磷转化为能被植物吸收利用的可溶性磷^[9]，为植物提供可吸收的磷元素；另一方面溶磷菌可降低其生存环境的pH^[10]，部分溶磷菌还可以分泌激素，促进植物生长^[11]。目前溶磷菌的研究主要集中于作物根际土壤，盐碱土壤中溶磷菌的研究却未见报道。

本研究旨在从河西走廊盐碱土壤中分离筛选出一株高效溶磷菌，探究其分类地位及溶磷特性，讨论其溶磷机理，以期丰富微生物菌株资源，为河西走廊盐碱土壤微生物资源的开发和应用提供参考。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 供试土样：土壤样品采集于河西走廊荒漠盐碱土，采用五点采样法，去除地表土，取5-15 cm深度土壤，用已灭菌的密封袋带回实验室冷藏于4 ℃备用。土样信息如表 1所示：

1.1.2 培养基：蒙金娜无机解磷培养基即蒙金娜有机培养基^[12]去除卵磷脂，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基^[12]，改良马丁培养基^[12]。

1.1.3 主要试剂和仪器：细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；DNA胶回收纯化试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。

H-1650R台式高速冷冻离心机，湘仪离心机仪器有限公司；721可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；EDC-810基因扩增仪，东胜创新生物科技有限公司；凝胶成像系统，美国伯乐公司；电泳仪，北京六一仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 溶磷菌的分离：采用稀释平板涂布法^[13]。无菌操作，取土样5 g加入45 mL无菌水中制成10^-3、10^-4、10^-5三个稀释梯度的土壤悬液，各梯度取 200 μL土壤悬浮液，接种到蒙金娜无机磷选择培养基平板上，涂布均匀(每个稀释度设置 3个重复)，于28 ℃恒温培养箱中培养5 d后，挑取有透明圈的单菌落在平板上划线纯化，重复2-3次，直至获得纯培养。细菌4 ℃保藏于牛肉膏蛋白胨斜面培养基中，真菌保藏于改良马丁培养基斜面培养基中。

1.2.2 溶磷菌初筛：溶磷圈法^[2]。无菌操作，将保藏于斜面中的菌种活化后，用接种环点接于蒙金娜固体培养基中，28 ℃培养5 d。计算溶磷圈直径(D)/菌落直径(d)比值初步判断溶磷能力。

1.2.3 溶磷菌复筛：无菌操作，将初筛得到D/d≥1.6的菌株活化，刮取并制成菌悬液(菌数约为 1.0×10⁶ CFU/mL)，吸取1 mL菌悬液加入装有 150 mL蒙金娜液体培养基(pH=7.2)的250 mL锥形瓶中(每组3个重复)，设置空白对照组，以接菌算 0 h，28 ℃、150 r/min连续培养144 h，自接菌开始每24 h吸取9 mL菌液测定pH值后置于10 mL离心管中，10 000 r/min离心10 min，采用钼锑抗比色法^[14]700 nm处测定吸光值，并根据磷标准曲线计算出溶磷量，进一步判断其溶磷能力。

1.2.4 形态鉴定：观察菌落形态特征，对菌株进行革兰氏染色、生理生化试验并对照《细菌伯杰氏细菌鉴定手册·第八版》鉴定菌株。

1.2.5 分子鉴定：参照柯春亮等^[1]对菌株B3-5-6的鉴定方法进行，菌株活化后，利用试剂盒提取细菌基因组DNA。选取细菌16S rRNA基因通用扩增引物27F (5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′)和1492R (5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR。PCR反应扩增体系为25 μL：2×Taq master-mix (2.5 μmol/L) 15 μL，上下游引物 (10 μmol/L)各1 μL，DNA模板3 μL，ddH₂O补至25 μL。反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，57 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，25个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将扩增后的PCR产物送至北京天一辉远生物科技有限公司测序，测序结果提交到GenBank数据库中，Blast进行同源性比对，利用MEGA 6.0的邻接法进行系统发育分析。

1.2.6 溶磷条件优化：以分离培养基为基础培养基(设置对照组，每组3个重复，其中对成分未知的牛肉浸膏和蛋白胨试验组单独设置对照)，对7种不同的碳源和6种不同的氮源进行筛选，7种碳源分别是可溶性淀粉、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、甘油、乳糖、牛肉浸膏，6种氮源分别是氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、硝酸钠、硝酸钾、蛋白胨。以上操作均按照1.2.3溶磷菌复筛操作进行(菌数约为1.3×10⁴ CFU/mL)，连续培养192 h，每24 h测定菌液pH及溶磷量。

用SPSS17.0软件设计4因素5水平正交表。以单因素最优培养基为基础培养基，同时参考细菌最常用的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(每组3个重复，葡萄糖浓度梯度依次为5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 g/L，蛋白胨浓度梯度依次为0.5、4.0、7.0、10.0、13.0 g/L，氯化钠浓度梯度依次为0.3、2.5、5.0、10.0、15.0 g/L，温度梯度依次为19、24、28、32、37 ℃)，按照1.2.3溶磷菌复筛操作进行(菌数约为1.3×10⁴ CFU/mL)，连续培养192 h，每24 h测定菌液pH及溶磷量。

1.3 数据处理及作图

用Excel 2007软件进行数据的基本处理，Origin 9.0作图，SPSS 17.0进行显著性分析，设计正交试验，MEGA 6.0构建系统发育树。

2 结果与分析 2.1 溶磷菌的分离筛选

蒙金娜无机固体培养基分离及初筛结果表明，5个土样共得到15株溶磷菌，其中D/d≥1.6的菌株有5株(表 2)。其中以菌株Y3-35的D/d值最大，与其他菌株的D/d值相比存在显著差异(P<0.05)，该菌落直径约为6.7 mm，溶磷圈直径约为18.9 mm，D/d约为2.79 (图 1)。

2.2 溶磷能力的测定

2.2.1 菌株溶磷能力的测定：对5株D/d≥1.6的菌株进行液体培养，结果表明5株溶磷菌的溶磷量整体呈先增大后缓慢减小，最后基本稳定的趋势；pH整体呈先减小后缓慢增大，最后基本保持稳定的趋势(图 2)。其中菌株Y3-35在前144 h内的溶磷量明显高于其他菌株的溶磷量，该菌株溶磷量在第72 h达到206.06 mg/L；pH在第48 h降到3.7，因此将该菌株作为后续研究的供试菌株。

2.2.2 菌株 Y3-35 溶磷量与 pH 相关性分析：对菌株Y3-35在144 h内的溶磷量与pH进行相关性分析，结果表明溶磷量与pH的Pearson’s r相关系数为-0.834，结合图 3可知菌株Y3-35溶磷量与pH呈现显著负相关。

2.3 菌株鉴定

在蒙金娜固体培养基上培养时，前期菌落呈乳白色(图 4A)，表面光滑；后期菌落呈乳黄色(图 4B)，菌落中间有透明粘液，表面光滑。

菌株Y3-35为革兰氏阴性杆菌，该菌株生理生化试验结果如下：淀粉水解试验、吲哚试验和柠檬酸盐试验均呈阴性；触酶试验、伏普试验、甲基红试验和明胶液化试验均呈阳性，乳糖发酵试验呈阳性且无气泡产生。

将菌株Y3-35的16S rRNA基因序列(登录号：KX276715)输入GenBank数据库中，Blast比对分析，选出6条(相似度大于96%)菌株的16S rRNA基因序列，其中菌株Y3-35的16S rRNA基因序列与Pantoea theicola的16S rRNA基因序列相似度为99%，利用MEGA 6.0邻接法构建系统发育树(图 5)，bootstrap采样次数设置为1 000。

根据菌落形态特征及生理生化特征，对照《细菌伯杰氏细菌鉴定手册(第八版)》，并结合系统发 育分析，鉴定菌株Y3-35为Pantoea theicola的近缘种。

2.4 溶磷条件优化

2.4.1 碳源优化：用7种不同的碳源分别替换培养基中的葡萄糖进行溶磷量及pH的测定，结果表明当碳源为葡萄糖时，该菌株溶磷量明显高于其他碳源条件下的溶磷量；pH明显低于其他碳源条件下的pH。该菌株在第120 h溶磷量达到224.05 mg/L，pH在第48 h降到4.05 (图 6)，说明葡萄糖为该菌株的最优碳源。

2.4.2 氮源优化：用6种不同的氮源分别替换液体培养基中的硫酸铵进行溶磷量及pH的测定，结果表明，当氮源为蛋白胨时，该菌株溶磷量明显高于其他氮源条件下的溶磷量，pH明显低于其他氮源条件下的pH。该菌株在培养第144 h溶磷量达到370.65 mg/L，pH在第72 h时降到3.95 (图 7)，说明蛋白胨为该菌株的最优氮源。

2.4.3 正交试验：对菌株Y3-35进行4因素5水平正交试验(表 3)，结果表明4个因素对该菌株溶磷量的影响主次为葡萄糖>温度>蛋白胨>氯化钠。正交试验初步得到的最优溶磷条件为C₆H₁₂O₆ 20.0 g/L、蛋白胨15.0 g/L、NaCl 2.5 g/L、培养温度24 ℃，其他同基础培养基配方。

在最优溶磷条件下，验证试验结果表明该菌株

在第144 h溶磷量达到723.34 mg/L，pH在第72 h降到4.0，该菌株在192 h内平均溶磷量为 497.65 mg/L。

3 结论与讨论

土壤中溶磷菌在土壤磷循环过程中担任着重要的角色^[15]。溶磷菌广泛存在于土壤中，溶磷菌可将土壤中的无效磷转化为有效磷，供植物利用。研究表明，溶磷菌溶磷能力测定的方法主要有：溶磷圈法、土培或砂培法、同位素测定法、钼磷抗比色法、熏蒸消煮法等^[16]。本试验采用溶磷圈法初筛，钼锑抗比色法复筛，得到一株高效溶磷菌菌株Y3-35，通过形态特征、生理生化特性以及16S rRNA基因序列分析，鉴定该菌株为Pantoea theicola的近缘种。不同土壤环境中溶磷微生物也有不同的特性，本研究中的菌株Y3-35分离于河西走廊盐碱土壤，盐碱土壤中的溶磷微生物有嗜盐碱的特性^[17]，这种特性可能是盐碱土壤对其自然选择的结果。

研究表明，不同的溶磷菌在溶磷能力方面存在差异，戴沈艳等^[3]分离筛选得到的伯克霍尔德菌属菌株T4溶磷菌在无机磷液体培养时，溶磷量达到193.1 mg/L。李文红等^[18]分离的NOP3、NOP4溶磷菌在无机磷液体培养时溶磷量分别为68.83 mg/L、4.50 mg/L。本研究分离得到的菌株Y3-35液体培养72 h时溶磷量达到206.06 mg/L，与上述报道相比，该菌株溶磷能力更强，同时也验证说明了不同溶磷菌的溶磷能力存在差异。研究表明，溶磷菌在不同组分培养基条件下，液体培养时溶磷能力也存在显著差异^[19]。柯春亮等^[1]的菌株B3-5-6在碳源为蔗糖时溶磷量为33.26 mg/L，氮源为硫酸铵时溶磷量为22.23 mg/L。本研究中的菌株Y3-35在不同组分培养基条件下溶磷量也存在差异，当碳源为C₆H₁₂O₆时，该菌株液体培养120 h时溶磷量为224.05 mg/L；当氮源为蛋白胨时，该菌株液体培养144 h时溶磷量为370.65 mg/L，这与Reyes等^[19]的研究结果相一致。本研究为进一步优化该菌株的溶磷条件，对其进行正交试验，结果表明，当培养基中各成分的量不同时，菌株液体培养溶磷量也存在显著差异^[20]。菌株Y3-35的最佳溶磷条件：C₆H₁₂O₆含量为20.0 g/L、蛋白胨含量为15.0 g/L、NaCl含量为2.5 g/L、培养温度为24 ℃，其他成分同原培养基，该菌株在该条件下培养144 h时溶磷量可高达723.34 mg/L，与优化前相比溶磷量增加251%。

研究表明，不同的溶磷微生物有着不同的溶磷机理，溶磷过程极其复杂^[10]。目前研究已发现的溶磷机制主要有3种：(1) 有机酸溶磷机制，溶磷菌在自身代谢的过程中释放出酸类物质降低其生存环境pH，溶解磷酸盐^[21]；(2) 质子溶磷机制，溶磷菌通过NH₄⁺的同化释放质子降低pH，溶解磷酸 盐^[22]；(3) 产酶溶磷机制，郝晶等^[23]通过对7株溶磷菌溶磷动力学研究发现，磷酸盐的溶解主要是通过磷酸酶催化来完成的。本研究中菌株Y3-35溶磷量与液体培养介质pH的Pearson’s r相关系数为-0.834，呈现显著负相关，这与席琳乔等^[24]的研究结果相一致，初步推断该菌株的溶磷机制为有机酸溶磷或质子溶磷，但具体是有机酸溶磷机制还是质子溶磷机制，需进一步研究。

利用溶磷菌的溶磷产酸特性改良盐碱土壤以及利用溶磷菌促进植物生长的研究已有报道，赵国杰等^[25]对4株无机解磷菌处理碱化土的理化性质及质量评价结果表明，与对照组相比，施用无机解磷微生物菌剂各组均可提高碱化土壤质量水平，其中I-B-14处理组速效磷含量增加了300%，pH降低了0.34；梅新兰等^[26]的研究表明，与对照组相比，接种溶磷菌处理的各试验组，无论玉米株高、干重、植株全磷含量较不接菌对照均有所提高，且4株溶磷菌处理组土壤中速效磷含量增加了68.9%。溶磷菌来自于土壤又应用于土壤，相比于施用化肥，施用微生物菌剂更加绿色环保，且长期有效。因此，溶磷菌的研究对提高磷肥的利用、促进植物生长以及盐碱土改良等方面具有重要的意义。笔者在后续试验中，将对溶磷菌的应用以及溶磷微生物菌肥制备等方面进行研究。