2017, Vol. 44扩展功能
文章信息
- 杨韵霏, 李由然, 张梁, 李赢, 顾正华, 丁重阳, 石贵阳
- YANG Yun-Fei, LI You-Ran, ZHANG Liang, LI Ying, GU Zheng-Hua, DING Zhong-Yang, SHI Gui-Yang
- 细菌麦芽糖淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的诱导型异源表达
- Inducible heterogenous expression of bacterial maltogenic amylase in Bacillus subtilis
- 微生物学通报, 2017, 44(2): 263-273
- Microbiology China, 2017, 44(2): 263-273
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.160102
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文章历史
- 收稿日期: 2016-01-27
- 接受日期: 2016-05-03
- 优先数字出版日期(www.cnki.net): 2016-05-31
2. 江南大学生物工程学院 江苏 无锡 214122
2. School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi,Jiangsu 214122,China
麦芽糖淀粉酶(Maltogenic amylase)，全称为1,4-α-D-葡聚糖α-麦芽糖基水解酶(1,4-α-D-glucan α-maltohydrolase，EC 3.2.1.133)，属于糖苷水解酶GH13家族，可作用于淀粉及相关多聚糖，能优先水解直链淀粉、环状糊精，生成的主要产物为麦芽糖，副产物为葡萄糖[1-3]。当前工业上主要用曲霉等丝状真菌发酵生产麦芽糖淀粉酶，但多采用周期较长的固态发酵，且发酵产物为真菌α-淀粉酶和糖化酶的混合物，不利于后期的分离纯化。与真菌来源的麦芽糖淀粉酶相比，细菌来源的麦芽糖淀粉酶有更高的水解效率，在淀粉行业及食品工业有更广阔的应用前景。我国尚不能在工业上大规模生产细菌麦芽糖淀粉酶，利用基因工程技术构建合适的表达系统是生产该酶的一条可行途径。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是革兰氏阳性菌，其细胞壁不含内毒素，是非致病的土壤微生物，被认为是食品安全的微生物GRAS (Generally recognized as safe)。其具有良好的发酵基础和成熟的生产技术，是较为理想的工业微生物生产菌株。根据表达机制的不同，枯草芽孢杆菌表达系统可分为组成型和诱导型，其中组成型表达载体稳定性较低，蛋白表达受菌体生长影响较大。诱导型启动子能够在特定条件下介导目的基因的表达，受菌体生长状态影响小，有利于外源蛋白的工业化生产。与芽孢杆菌中其他诱导表达系统相比，由木糖异构酶启动子及其阻遏蛋白所组成的木糖诱导系统，在对目的基因的表达强度和调控方面更具优势。Rygus等报道了巨大芽孢杆菌木糖异构酶基因的启动子受识别木糖的阻遏蛋白的调控，在培养基中添加木糖，启动子转录表达的强度可提高200倍[4]。
本文以大肠杆菌/枯草芽孢杆菌穿梭质粒pHY300-PLK为基础，构建了芽孢杆菌诱导型表达载体；并以地衣芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶编码基因为报告基因，实现了其在枯草芽孢杆菌中的功能表达。进一步对重组菌的诱导产酶条件进行了初步优化，并研究了该重组酶的酶学性质，为其在工业中的应用奠定了基础。
1 材料与方法 1.1 菌种、质粒和培养基地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) ATCC14580、大肠杆菌(Escherichia coli) JM109、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium) 1514、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) WB600、质粒pHY300-PLK均由中国高校工业微生物资源和信息中心(CICIM)保藏。重组质粒pHYBM、pHYBMYF、重组枯草芽孢杆菌WB600/pHYBMYF为本研究构建。
LB培养基(g/L)：酵母粉5.0，蛋白胨10.0，NaCl 10.0。
发酵培养基(g/L)：蛋白胨12.0，酵母粉24.0，甘油4.0，KH2PO4 2.3，K2HPO4 16.4，调节pH至7.0。
抗性筛选时补加终浓度为100 mg/L的氨苄青霉素或30 mg/L的四环素。
1.2 主要试剂和仪器DNA聚合酶，宝生物工程(大连)有限公司；T4 DNA连接酶、克隆载体pMD19-T Simple Vector及各种限制性内切酶，Fermentas (立陶宛)公司；质粒提取试剂盒、核苷酸片段纯化试剂盒及胶回收试剂盒，博大泰克(北京)生物基因技术有限公司；氨苄青霉素和四环素，生工生物工程(上海)股份有限公司；其他所用药品试剂，国药集团(上海)有限公司。
K20干式恒温器，杭州奥盛仪器有限公司；CF16RX II型冷冻离心机，日本HITACHI公司；PICO17型高速离心机，美国Thermo公司；VCX-750型超声波细胞破碎仪，美国Sonic & Materials有限公司；V-1200可见分光光度计，上海美普达仪器有限公司；DYY-6C凝胶水平电泳仪，北京六一仪器厂；University Hood II凝胶成像系统，美国Bio-Rad公司；高效液相色谱(HPLC)系统及工作站，美国Dionex公司。
1.3 细菌基因组DNA的提取、PCR引物及条件以LB培养基培养菌种10 h后收集新鲜菌体，参照Wilson的方法进行细菌基因组DNA的提取[5]。
根据巨大芽孢杆菌1514基因组序列中的木糖异构酶基因的启动子区域及其调控蛋白的基因序列，设计合成引物Pxyl01 (5′-GCCAGATCTTAA CTAACTTATAGGGGT-3′，Bgl II)和Pxyl02 (5′-CGC GGATCCTTGTCATTTCCCCCTTT-3′，BamH I)。
以巨大芽孢杆菌1514基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到木糖异构酶基因的启动子区域片段。反应条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃ 10 min。反应体系 (50 μL)：dNTPs (2 mmol/L) 5 μL，10×Buffer 5 μL，上游/下游引物(25 μmol/L)各1 μL，模板1 μL，HiFi聚合酶(2.5 U/μL) 0.5 μL，ddH2O 37.5 μL。
根据地衣芽孢杆菌ATCC14580基因组序列中的麦芽糖淀粉酶基因序列，设计合成如下引物PyvdF01 (5′-GGCAGATCTATGGAATATGCAGCG ATACA-3′，BglII)和PyvdF02 (5′-ATGCCCGGGT TAGACCGCCCCCAAAATGA-3′，Sma I)。
以地衣芽孢杆菌ATCC14580基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到麦芽糖淀粉酶基因片段。反应条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 10 min。反应体系同木糖异构酶基因的启动子区域片段。
PCR产物纯化后分别与pMD19-T Simple连接，按文献[6]中方法转化大肠杆菌JM109，构建重组质粒pMDBM及pMDYF，经测序确认无误后用于下一步实验。
1.4 重组枯草芽孢杆菌的构建重组质粒pMDBM双酶切获得木糖异构酶基因的启动子区域片段BMxyl，与线性化的载体pHY300-PLK连接，转化大肠杆菌JM109，转化子经筛选鉴定正确后，得到木糖诱导表达载体pHYBM。重组质粒pMDYF双酶切获得麦芽糖淀粉酶基因片段yvdF，与线性化的重组表达载体pHYBM连接，转化大肠杆菌JM109，经筛选鉴定正确后获得重组表达质粒pHYBMYF。
将重组表达质粒pHYBMYF及重组表达载体pHYBM通过Bott等[7]的方法转化入宿主枯草芽孢杆菌WB600中，转化子经筛选鉴定正确后，将所得重组菌命名为枯草芽孢杆菌WB600/pHYBMYF及枯草芽孢杆菌WB600/pHYBM。
1.5 重组麦芽糖淀粉酶的诱导发酵及粗酶液的制备将重组枯草芽孢杆菌WB600/pHYBMYF接种于15 mL LB液体培养基中，在37 ℃、200 r/min振荡培养，以此作为种子液。取1 mL培养过夜的种子液接种于30 mL发酵培养基中，于37 ℃、200 r/min培养8 h后，加入终浓度为1%的木糖，诱导发酵16 h。将发酵液于12 000 r/min、4 ℃条件下冷冻离心收集菌体，弃去上清液，用Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(0.2 mol/L，pH 6.5)清洗并重悬菌体至OD600为10，采用超声破碎法破碎细胞，冷冻离心后所得上清即为粗酶液。
1.6 麦芽糖淀粉酶酶活力检测方法、蛋白含量测定及SDS-PAGE电泳取1 mL用Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(0.2 mol/L，pH 6.5)配制的1%可溶性淀粉作为底物，于40 ℃预热2 min后加入50 μL麦芽糖淀粉酶酶液，40 ℃反应30 min。取500 μL反应液，加入1.5 mL DNS煮沸5 min，于540 nm处测定吸光值，计算产生的还原糖量。以烘干至恒重的麦芽糖为标样绘制DNS标准曲线。麦芽糖淀粉酶酶活单位(U)定义为：在40 ℃、pH 6.5的反应条件下，每小时分解可溶性淀粉生成相当于1 μL麦芽糖的还原糖所需的酶量。
蛋白质浓度测定采用Bradford法[8]。SDS-PAGE电泳参照Schgger等的方法[9]。
1.7 重组表达质粒稳定性测定将重组枯草芽孢杆菌WB600/pHYBMYF单菌落接种于30 mL含30 mg/L四环素的发酵培养基中，于37 ℃、200 r/min培养18 h，收集菌体，用生理盐水洗涤并重悬。洗涤后的菌体细胞接种于无抗新鲜发酵培养基中，每隔12 h转接一次，转接 7次，转接后使初始OD600为0.1，总培养时间为 96 h。重组菌经96 h无选择性生长后，菌液经稀释分别涂布无抗LB固体平板和30 mg/L四环素的抗性平板。待长出单菌落，菌落数分别记为A1和A2。质粒稳定性=A2/A1×100%。
1.8 发酵诱导条件优化1.8.1 诱导温度优化：重组菌WB600/pHYBMYF进行摇瓶发酵实验，接种后于37 ℃、200 r/min培养8 h后，加入1%木糖，保持其他条件一致，分别于不同温度、200 r/min诱导发酵16 h后，收集菌体破碎得到粗酶液，测其蛋白浓度和酶活力，得到诱导温度-酶活力关系表。
1.8.2 诱导剂含量优化：重组菌WB600/pHYBMYF接种后于37 ℃、200 r/min培养8 h后，加入不同浓度的木糖于45 ℃、200 r/min进行诱导发酵，保持其他条件不变，16 h后结束发酵收集菌体破碎得到粗酶液，测其蛋白浓度和酶活力，得到诱导剂含量-酶活力关系表。
1.8.3 添加诱导剂时间优化：重组菌WB600/ pHYBMYF接种后在37 ℃、200 r/min培养不同时间后，添加1%木糖继续诱导发酵，保持其他条件一致，总培养时间36 h，发酵结束后收集菌体破碎得到粗酶液，测其蛋白浓度和酶活力，得到添加诱导剂试剂-酶活力关系表。
1.9 麦芽糖淀粉酶酶学性质研究1.9.1 重组麦芽糖淀粉酶的纯化：将破碎细胞所得粗酶液经Histrap亲和层析进行重组麦芽糖淀粉酶的纯化。结合缓冲液(A液)：25 mmol/L Tris，0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L咪唑，盐酸调节pH至7.4；洗脱缓冲液(B液)：25 mmol/L Tris，0.5 mol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，盐酸调节pH至7.4。用洗脱缓冲液以0-100%进行线性洗脱，流速为1 mL/min，收集纯化后的酶液，利用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度及分子量大小。
1.9.2 麦芽糖淀粉酶水解产物检测：采用高效液相色谱分析法检测麦芽糖淀粉酶水解底物可溶性淀粉所得的产物。色谱柱为Waters公司的XBridge Amide氨基柱，以70%乙腈为流动相，流速设为1 mL/min，柱温40 ℃，以一定浓度的葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖的混合物为标样，以示差检测器检测水解淀粉的产物。
1.9.3 最适作用温度及温度稳定性的测定：在pH 6.5的条件下，在不同温度下(20-70 ℃)分别测定麦芽糖淀粉酶的酶活力，得到温度-酶活力关系图，确定该酶的最适作用温度。将酶在不同温度下(20-70 ℃)分别保温1 h，检测其剩余酶活力，以未保温的原酶液活力为参照，得到温度-稳定性关系图。
1.9.4 最适作用pH及pH稳定性的测定：在温度40 ℃下，用不同pH (4.5-8.5)缓冲液配制1%可溶性淀粉溶液，将不同pH的底物与酶反应，测定麦芽糖淀粉酶酶活力，得到pH-酶活力关系图，确定该酶的最适作用pH。在酶活较稳定的20 ℃，将酶液在不同pH (4.5-8.5)下保温1 h，检测其剩余酶活力，以原酶液活力为参照，得到pH-稳定性关系图。
1.9.5 化学试剂对酶活力和酶热稳定性的影响：在最适温度40 ℃、最适pH 6.5下，在反应体系中加入不同的化学试剂分别测定其酶活力，以未处理的原酶液酶活力为参照，得到各种化学试剂对酶活力的影响。实验中选用几种对该酶有激活作用的化学试剂，检测其对酶热稳定性的影响。
2 结果与讨论 2.1 麦芽糖淀粉酶表达质粒 pHYBMYF 的构建以巨大芽孢杆菌1514基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到大小约为1.4 kb的木糖启动子区域基因片段，将此片段克隆入载体pMD19-T Simple，得到重组质粒，进行核苷酸序列测定验证。通过Bgl II和BamH I双酶切法将验证正确的启动子区域基因片段切下并克隆入载体pHY300-PLK，得到重组表达载体pHYBM，重组质粒经酶切电泳验证正确。
以地衣芽孢杆菌ATCC14580基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到大小约为1.8 kb的麦芽糖淀粉酶基因片段，将此片段克隆入载体pMD19-T Simple，得到重组质粒并测序验证。yvdF基因序列大小为1 761 bp，编码586个氨基酸，理论蛋白大小为67 kD。使用Bgl II和Sma I双酶切法将验证正确的麦芽糖淀粉酶基因片段切下并克隆入构建好的表达载体pHYBM，转化子经提质粒酶切电泳验证正确，获得麦芽糖淀粉酶表达质粒pHYBMYF。重组质粒构建图谱见图 1a，Bgl II和Sma I双酶切得到4 847 bp的pHY300-PLK载体片段和3 170 bp的启动子区域及yvdF基因片段，电泳鉴定图 见图 1b。
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| 图 1 麦芽糖淀粉酶重组质粒 pHYBMYF 的构建 Figure 1 Construction of maltogenic amylase expression plasmid pHYBMYF 注：M：λ DNA/Pst I marker；1：pHYBMYF经Bgl II+Sma I双酶切产物. Note: M: λ DNA/Pst I marker; 1: pHYBMYF/Bgl II+Sma I. |
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将重组表达质粒pHYBMYF及重组表达载体pHYBM通过枯草芽孢杆菌转化法转化入枯草芽孢杆菌WB600，从所得阳性转化子中提取质粒经酶切电泳验证无误后，将所得重组菌分别命名为枯草芽孢杆菌WB600/pHYBMYF和枯草芽孢杆菌WB600/pHYBM。
2.3 重组麦芽糖淀粉酶的表达将原始菌WB600、对照菌WB600/pHYBM及重组表达菌株WB600/pHYBMYF分别进行摇瓶发酵，后两者中加入终浓度30 mg/L的四环素，接种后8 h三种菌发酵摇瓶中分别加入1%木糖诱导剂，以不加诱导剂的重组菌株WB600/pHYBMYF为空白对照，继续振荡培养16 h，离心收集菌体并破碎获得胞内粗酶液，分别测定发酵上清液和胞内粗酶液的麦芽糖淀粉酶活力。结果显示，所有发酵上清液均无酶活，原始菌WB600、对照菌WB600/pHYBM胞内和未添加诱导剂的重组菌胞内也未检测到酶活，而只有诱导后的重组菌胞内检测到酶活力。有一些诱导表达系统并不完全受诱导剂调控，如枯草芽孢杆菌中蔗糖果聚糖酶基因的PsacB启动子，以蔗糖为诱导物，其转录起始具有持续性，并不完全受蔗糖诱导的控制，但在蔗糖诱导下，其表达强度能提高100倍[10]。而本研究构建的木糖诱导表达系统在枯草芽孢杆菌中完全受诱导剂调控，与前两种表达系统相比，更利于发酵产酶过程的控制。将原始菌、对照菌、空白对照及进行诱导的重组菌发酵所得胞内产物进行SDS-PAGE电泳分析，结果见图 2。从图 2可看出，与其他对照相比，只有添加木糖进行诱导发酵的重组菌的细胞破碎液在分子量为67 kD左右有一条明显的表达条带，之前推测yvdF基因表达蛋白大小为67 kD，再次验证了重组菌将麦芽糖淀粉酶基因表达在了细胞内。
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| 图 2 胞内粗酶液 SDS-PAGE 电泳图 Figure 2 SDS-PAGE of the intracellular maltogenic amylase M：蛋白Marker；1： B. subtilis胞内产物； 2：B. subtilis/pHYBM胞内产物；3：B. subtilis/pHYBMYF未经诱导的胞内产物；4：B. subtilis/pHYBMYF诱导后的胞内产物. Note: M: Molecular marker; 1: B. subtilis; 2: B. subtilis/pHYBM; 3: B. subtilis/pHYBMYF without induction; 4: B. subtilis/pHYBMYF with induction. |
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在无选择性压力下，随着重组菌的繁殖，外源质粒可能会出现拷贝数降低甚至丢失的现象，所以经过对构建的重组表达质粒pHYBMYF在宿主枯草芽孢杆菌中稳定性的研究，发现重组菌在无选择压力条件下生长96 h后，含有重组质粒的菌落数为总菌落数的97%左右。该结果表明重组表达质粒pHYBMYF在宿主枯草芽孢杆菌中稳定性较高，具有工业化应用价值。
2.5 重组枯草芽孢杆菌 WB600/pHYBMYF 发酵诱导条件优化2.5.1 最适诱导温度：重组菌接种后于37 ℃、 200 r/min条件下培养8 h后，添加终浓度为1%的诱导剂后采用不同温度进行摇瓶发酵实验，结果如表 1所示。从表 1可见，诱导发酵温度在37-45 ℃左右时，重组酶的酶活较高，温度低于30 ℃时得到的酶活较低，发酵温度为50 ℃时得到的重组酶酶活较45 ℃时下降明显。所以重组菌最适诱导温度在45 ℃，后续研究中诱导发酵时均采用45 ℃。
| 诱导温度 Inducing temperature (℃) |
酶活 Enzyme activity (U/mL) |
菌体量 OD600 |
总蛋白量 Total protein (g/L) |
| 20 | 17.11±0.27 | 3.43±0.33 | 0.81±0.02 |
| 25 | 38.65±1.03 | 6.07±1.07 | 0.98±0.03 |
| 30 | 113.81±3.77 | 8.50±0.67 | 1.20±0.04 |
| 37 | 211.04±3.62 | 10.40±1.79 | 0.89±0.08 |
| 45 | 264.67±4.38 | 12.36±1.32 | 1.00±0.01 |
| 50 | 24.28±0.14 | 3.42±0.11 | 0.73±0.02 |
2.5.2 最适诱导剂添加量：重组菌接种后于37 ℃、200 r/min条件下培养8 h后，添加不同浓度的诱导剂于45 ℃进行摇瓶发酵实验，产酶结果见表 2。由表 2可知，随着所添加诱导剂的浓度增加，酶活不断升高，在诱导剂终浓度为1%时达到最高。而继续提高诱导剂浓度，酶活非但没有升高，反而明显下降。因此所添加的诱导剂含量最适在1%。
| 诱导剂终浓度 Inducer concentration (%) |
酶活 Enzyme activity (U/mL) |
菌体量 OD600 |
总蛋白量 Total protein (g/L) |
| 0.0 | 0.00±0.00 | 6.62±1.03 | 0.72±0.05 |
| 0.4 | 23.95±0.77 | 6.22±0.94 | 1.03±0.05 |
| 0.6 | 83.65±0.42 | 8.32±1.45 | 1.02±0.05 |
| 0.8 | 156.29±2.40 | 10.02±0.77 | 1.02±0.05 |
| 1.0 | 247.78±1.46 | 12.44±0.34 | 1.02±0.01 |
| 1.2 | 87.27±0.13 | 6.66±1.26 | 1.09±0.02 |
| 1.4 | 55.40±0.10 | 6.19±0.38 | 0.96±0.02 |
2.5.3 最适添加诱导剂的时间：在重组菌接种后的不同时间加入终浓度为1%的诱导剂于37 ℃、 200 r/min条件下发酵，产酶结果见表 3。从表 3可知，在接种后培养的前3 h添加诱导剂产酶效率很低，3 h后开始诱导发酵所得重组酶酶活逐渐升高，在接种后9 h添加诱导剂发酵所得酶的酶活最高。9 h后随着前培养时间增加，产酶效率略有下降。所以得出最合适的添加诱导剂时间为接种培养后9 h。
| 诱导剂添加时间 Inducer addition time (h) |
酶活 Enzyme activity (U/mL) |
菌体量 OD600 |
总蛋白量 (g/L) |
| 0 | 0.00±0.00 | 12.76±1.21 | 0.59±0.01 |
| 3 | 14.08±0.59 | 13.42±0.98 | 1.10±0.03 |
| 6 | 204.21±1.34 | 13.61±0.79 | 1.11±0.02 |
| 9 | 287.00±2.85 | 14.43±1.33 | 1.12±0.05 |
| 12 | 276.61±0.16 | 15.47±1.20 | 1.10±0.02 |
| 15 | 278.43±0.78 | 14.32±2.90 | 1.09±0.07 |
| 18 | 269.80±0.16 | 13.41±1.39 | 1.07±0.03 |
| 21 | 240.29±1.18 | 12.53±2.34 | 1.07±0.04 |
| 24 | 201.13±1.40 | 11.87±1.65 | 0.99±0.01 |
芽孢杆菌中的木糖操纵子xyl由编码木糖异构酶XylA以及木酮糖激酶XylB的两个基因构成。该xyl操纵子编码基因上游有一段1 152 bp的结构基因编码了该操纵子的调节蛋白XylR。在未添加诱导物时，调节蛋白XylR与操纵子上的启动子xyl operator结合，抑制木糖代谢基因的表达，实现负控诱导调控。若缺失xylR基因或xyl启动子就能使木糖代谢基因实现组成型表达[11]。
2.6 重组麦芽糖淀粉酶的纯化重组菌所产麦芽糖淀粉酶经亲和层析纯化后的酶在SDS-PAGE中显示出单一条带，分子量约为67 kD (图 3)，与之前推测的yvdF基因表达蛋白大小相符。
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| 图 3 纯化后的重组麦芽糖淀粉酶 SDS-PAGE 鉴定图谱 Figure 3 SDS-PAGE of purified recombinant maltogenic amylase 注：M：蛋白Marker；1：重组麦芽糖淀粉酶粗酶液；2：重组麦芽糖淀粉酶纯化后酶液. Note: M: Molecular marker; 1: Crude recombinant maltogenic amylase; 2: Purified recombinant maltogenic amylase. |
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2.7.1 重组麦芽糖淀粉酶水解性质：以1%可溶性淀粉为底物，与100 μL重组菌诱导发酵胞内粗酶液，于40 ℃、pH 6.5条件下反应1 h，采用高效液相色谱法分析反应产物，标样图谱见图 4a，反应产物液相图谱见图 4b。结果显示，该重组麦芽糖淀粉酶水解可溶性淀粉产生60.42%的麦芽糖及39.58%的葡萄糖。可见该重组麦芽糖淀粉酶分解淀粉主要产物为麦芽糖，还有少量葡萄糖为副产物。
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| 图 4 重组酶分解淀粉产物分析 Figure 4 Product analysis of recombinant enzyme reaction with starch |
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2.7.2 温度对酶活力及酶热稳定性的影响：在pH 6.5的条件下，测定20-70 ℃范围内的麦芽糖淀粉酶的酶活力，得到温度-酶活力关系，如图 5A所示，该重组酶的最适反应温度为45 ℃左右，反应温度高于50 ℃酶活力大大降低。将酶液置于不同温度下保温1 h，检测剩余酶活力，以原酶液活力为对照，结果见图 5B。该酶在40 ℃以下稳定性良好，40 ℃保温1 h后残余酶活力仍能达到96.0%，但45 ℃保温1 h后酶活损失近27.2%，50 ℃保温1 h后酶活损失近70.0%，表明该酶在50 ℃以上稳定性下降较多。据报道，同为地衣芽孢杆菌来源的麦芽糖淀粉酶在大肠杆菌中的最适温度为50 ℃[12]，而本文获得的重组酶在50 ℃时稳定性下降较多，这表明该酶基因经克隆表达后性质略有改变。芽孢杆菌(Bacillus sp. ) US149[13]及黑曲霉(Aspergillus niger)[14]来源的麦芽糖淀粉酶最适温度为40 ℃，高于50 ℃后酶热稳定性大幅下降。另有嗜热芽孢杆菌(Geobacillus thermoleovorans)来源的麦芽糖淀粉酶，在细菌麦芽糖淀粉酶中其温度稳定性最好，80 ℃保温35 h后仍有50%的酶活力[15]。细菌淀粉酶常是单亚基蛋白，而如黑曲霉这类真菌来源的淀粉酶往往能形成多聚体[16]，嗜热芽孢杆菌来源的麦芽糖淀粉酶因形成这种多聚体使得酶热稳定性提高。本文获得的重组麦芽糖淀粉酶也可以通过定向突变来提高其酶热稳定性。
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| 图 5 温度对重组酶活力和稳定性的影响 Figure 5 Effects of temperature on the activity and stability of the recombinant enzyme |
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2.7.3 pH对酶活力及酶稳定性的影响：在温度40 ℃下，测定在pH 4.5-8.5范围内的重组酶活力，得到pH-酶活力关系。如图 6A所示，发现该酶的最适反应pH为6.5左右，pH低于5.0酶活力基本丧失，pH高于7.0酶活力开始下降。20 ℃下，将不同pH的酶液保温1 h后测定其残余酶活力，以未处理的原酶液活力为对照，结果如图 6B所示。由图 6B可见，pH 6.0-7.0之间该酶稳定性相对较好，pH低于5.0酶活力完全丧失，pH高于7.5酶稳定性明显降低。已报道的不同来源多数麦芽糖淀粉酶均在pH 6.0-7.0之间稳定性较好，超出此范围稳定性下降明显[17-19]。
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| 图 6 pH 对重组酶活力和稳定性的影响 Figure 6 Effects of pH on the activity and stability of the recombinant enzyme |
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2.7.4 化学试剂对酶活力和酶热稳定性的影响：以原酶液为对照，得到化学试剂对酶活力的影响如表 4所示。由表 4可知，在试验浓度下，Ca2+、Co2+、EDTA对该重组麦芽糖淀粉酶具有激活作用，其中EDTA对酶激活作用较为明显；Zn2+、Mn2+、Cu2+、Fe3+、SDS、Tween-80对该酶有较强抑制作用，其中10 mmol/L的Cu2+、SDS几乎使该酶完全失活。研究几种对酶有激活作用的Ca2+、Co2+、EDTA对酶热稳定性的影响，结果表明这3种试剂虽对酶有激活作用，但并没有保护作用，其中Ca2+、Co2+反而使酶活力下降。对于许多α-淀粉酶，Ca2+能在一定程度上提高酶的热稳定性，对酶有保护作用，如一种巨大芽孢杆菌来源的中温α-淀粉酶，Ca2+对其有激活作用，浓度为10 mmol/L时能显著提高酶热稳定性，而EDTA能抑制其活性[20]。Li+和K+能提高一种杆菌属(Geobacillus sp.)来源的麦芽糖淀粉酶的酶活力[19]，而对于另一种栖热菌属(Thermus sp.)来源的麦芽糖淀粉酶，10 mmol/L的EDTA能提高其稳定性[21]，在性质上与地衣芽孢杆菌来源的麦芽糖淀粉酶有相似性。
| 化学试剂 Chemical reagents |
浓度 Concentration (mmol/L) |
相对酶活力 Relative activity (%) |
| Li+ | 5 | 105.35±1.56 |
| 10 | 101.27±1.23 | |
| K+ | 5 | 107.20±1.00 |
| 10 | 104.32±1.68 | |
| Mg2+ | 5 | 100.51±1.09 |
| 10 | 102.33±0.60 | |
| Zn2+ | 5 | 53.14±1.14 |
| 10 | 48.96±0.63 | |
| Ca2+ | 5 | 105.71±0.93 |
| 10 | 110.50±1.62 | |
| Mn2+ | 5 | 89.87±0.79 |
| 10 | 87.55±0.92 | |
| Cu2+ | 5 | 0.00 |
| 10 | 0.00 | |
| Co2+ | 5 | 99.20±0.40 |
| 10 | 111.03±0.63 | |
| Fe3+ | 5 | 98.67±1.79 |
| 10 | 62.27±2.88 | |
| EDTA | 5 | 119.30±1.26 |
| 10 | 136.20±1.90 | |
| SDS | 5 | 8.88±0.32 |
| 10 | 16.11±1.00 | |
| Triton-X 114 | 5 | 87.19±0.99 |
| 10 | 103.13±2.25 | |
| Tween-80 | 5 | 51.84±0.45 |
| 10 | 49.45±1.40 |
2.7.5 重组酶的底物特异性：以1 mL 2%可溶性淀粉、马铃薯淀粉、麦芽糊精、β-环状糊精、糖原和1%支链淀粉为底物，在40 ℃、pH 6.5的条件下与100 μL麦芽糖淀粉酶反应1 h，分别测定其酶活力，以2%可溶性淀粉为底物测得的酶活力为100%，结果见表 5。如表 5所示，该重组麦芽糖淀粉酶可以水解可溶性淀粉、马铃薯淀粉、麦芽糊精和β-环状糊精，但不能利用糖原、支链淀粉，说明该酶几乎不能作用于含有支链的多糖。从相对酶活来看，该重组麦芽糖淀粉酶的最适作用底物为β-环状糊精。
| 底物 Substrate |
相对酶活 Relative activity (%) |
| 可溶性淀粉Soluble starch | 100 |
| 马铃薯淀粉Potato starch | 145.48±2.39 |
| 麦芽糊精Maltodextrin | 20.05±0.48 |
| β-环状糊精β-Cyclodextrin | 289.32±4.43 |
| 糖原Glycogen | 0 |
| 支链淀粉Amylopectin | 0 |
本研究构建了一种能高效表达外源基因的大肠杆菌/芽孢杆菌穿梭型诱导表达载体pHYBM，实现了一种细菌麦芽糖淀粉酶在枯草芽孢杆菌细胞内的诱导表达，胞内酶活最高达到296.64 U/mL。前期报道中，相同来源的麦芽糖淀粉酶基因实现了在大肠杆菌中的表达，其胞内酶活为227.82 U/mL[22]，本研究发酵所得重组酶酶活提高了约30.2%，在工业上具有一定的应用前景。后续研究中可以继续改良这一诱导型表达载体，使其能将目的蛋白分泌到细胞外，并对发酵条件进行优化，以期能进一步提高其表达量。
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