猪瘟是由猪瘟病毒引起的高度接触性传染病，最早发现于美国俄亥俄州。世界动物卫生组织(OIE)将其列入OIE疫病名录(OIE-listed diseases)，为必须申报的(Notifiable)动物传染病，我国也将其列为一类动物传染病^[1]。该病在世界范围内流行，以流行范围广、发病率和致死率高为主要特征，给世界养猪业造成严重的危害。1997-1998年荷兰猪瘟暴发造成的经济损失总计超过2亿美元^[2]。近年来，猪瘟在亚洲、欧洲、南美洲等地区呈现复发的趋势，一些宣布已消灭猪瘟的国家(如法国、荷兰、德国、比利时等)又见猪瘟复发的报道^[3]。目前，我国主要通过弱毒疫苗免疫防治猪瘟。C株是全世界公认的具有良好免疫效果的弱毒疫苗，是由中国兽医药品监察所专家将猪瘟石门系强毒在兔体上连续传几百代后得到的兔化弱毒疫苗^[4]。世界范围内广泛使用的疫苗，包括东欧和其他亚洲国家的K株和LC株以及拉美国家的Remis株都是由C株演变而来。在我国，C株一直在预防猪瘟方面起着非常重要的作用，王琴等对我国流行的不同临床致病力和不同基因亚型的9株猪瘟病毒流行毒株进行了免疫保护效力研究，结果表明，以C株疫苗种毒生产的猪瘟活疫苗(传代细胞源)对我国目前流行的猪瘟病毒高、中、低致病力毒株及不同基因亚型(1.1、2.1、2.2)流行毒株均具有很强的保护力，且免疫猪接种不同流行毒株毒后不排毒^[5]，研究结果为我国继续使用猪瘟兔化弱毒疫苗进行全面免疫提供了重要科学依据。但是，传统C株疫苗具有一定的局限性，不能区分免疫和自然感染动物，为了净化、消灭猪瘟，新型猪瘟标记疫苗将发挥重要作用^[6]。

猪瘟病毒(CSFV)基因组大小约为12.3 kb，含有一个大的开放阅读框(ORF)，编码一个3 898个氨基酸组成的多聚蛋白，该多聚蛋白由4个成熟的结构蛋白和8个非结构蛋白组成，各蛋白的排列顺序从N端到C端依次为NH₂-N^Pro-C-Erns-E1-E2-P7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH。核心蛋白C是CSFV编码的第一个结构蛋白，比较保守，有结合病毒基因组RNA、保护RNA和转录调节的作用。其抗原表位对T、B淋巴细胞介导的免疫反应有重要作用^[7]。E1嵌埋在病毒囊膜内，所以不能刺激机体产生中和抗体，但其与E2以异源二聚体的形式存在，E1E2复合物可能是稳固病毒颗粒构型的主要结构蛋白。

E2蛋白存在于病毒囊膜表面。在CSFV编码的蛋白中，E2是最不保守的一种蛋白，为CSFV的主要保护性抗原，参与病毒的感染过程并诱导机体产生中和抗体^[8]。其空间构型由3个疏水区和3个N端的链内二硫键构成。Wensvoort等用了13株CSFV单抗阐述了E2的免疫特性，他认为CSFV表面的抗原决定簇主要分布在A、B、C、D 4个结构域中^[9-10]，而且这4个结构域位于同一结构蛋白，Weiland等通过体外实验证明了这个结构蛋白就是E2蛋白^[11]。E2蛋白由ORF编码的690 (Arg)-1 060 (Leu)之间的371个氨基酸残基组成，在靠近E2蛋白N端上游有一段信号肽序列，其分子量为51-58 kD。E2蛋白的羧基端有一段约40个疏水性氨基酸残基构成的跨膜区(TMR)，使得其主要以同源二聚体或与E1蛋白形成异源二聚体形式存在。Erns由ORF 268 (Glu)-494 (Ala)位的227个氨基酸组成，其糖基化程度很高，有9个潜在的糖基化位点，分子量约为44-48 kD。但Erns没有疏水的跨膜区(TMR)，而是以一种未知的机制连接到病毒粒子表面^[9]。Erns是仅次于E2的免疫原性糖蛋白，也能刺激机体产生中和抗体。由于Erns也是CSFV中比较保守的蛋白^[12]，因而可以作为CSFV标记疫苗用于鉴别感染与免疫抗体的靶抗原。

标记疫苗是一种配以鉴别诊断方法的新型疫苗，即可以通过血清学抗体检测区别免疫抗体与野毒感染抗体的一种新型疫苗。通过对野毒株或弱毒疫苗进行基因操作，插入、移除或突变某一位点，以区别于原始毒株。根据增加或消除某一标记位点，可以将标记疫苗分为阳性标记和阴性标记。根据增加部分的来源，可以将阳性标记分为外源性阳性标记和内源性阳性标记^[13]。

世界范围内猪瘟的防治策略有预防性免疫接种和全面扑杀两种。对于大多数已经消灭猪瘟的国家，如美国、加拿大、巴西、智利、南非、日本和欧盟国家，通常采用扑杀病猪的策略来控制猪瘟。因为弱毒疫苗的使用对已消灭猪瘟的整体环境具有潜在的危险，所以对于突发疫情，扑杀病猪是有效遏制疫情的手段，这样可以保证其相关产品在世界市场上的竞争力。1977年，欧盟委员会全面分析了这两种猪瘟防控策略，最后得出了全面禁止疫苗使用在经济上更有利于养猪业的结论^[14]。该结论促成了扑杀病猪这一策略的逐步实施和疫苗使用的逐步废除。然而，对于大多数尚未消除猪瘟的国家，则以预防性免疫接种为主要手段，辅之以扑杀猪瘟感染或阳性动物的综合防控方法。疫苗免疫控制猪瘟，可以对发病并确诊为猪瘟的病猪进行扑杀。而对于抗体检测阳性，特别是在实施猪瘟净化时，实施扑杀比较盲目，容易将免疫抗体阳性猪扑杀，从而造成很大的经济损失。标记疫苗可以识别免疫抗体与野毒感染抗体，从而在进行扑杀病猪时更具有针对性，可减少经济损失。

近些年，陆续有国内外研究者基于强毒或弱毒进行毒株的改造，在过去的二十多年中出现了大量的猪瘟改造毒株。反向遗传操作技术作为当今RNA病毒分子遗传学研究的重要手段，已广泛用于病毒遗传变异、致病机理、新型病毒载体和新一代标记疫苗研究等，而反向遗传学技术的关键在于将病毒RNA转染至特定细胞。脂质体或电穿孔法是目前比较成熟的转染方法，BHK-21细胞是应用最广泛的受体细胞。范运峰等用脂质体介质转染CSFV Thiverval株发现BHK-21细胞效率明显高于PK15细胞，因此在体外转录后先电转至BHK-21细胞获得活病毒，再感染CSFV易感细胞PK15细胞^[15]。邹兴启等在研究中发现C株在SK6细胞中的电转染效率很高，转染可出现大量的阳性细胞，所以创建了电转SK6细胞体外转录病毒RNA的方法，成功构建了C株感染性克隆^[16]。朱元源等利用猪瘟病毒低温诱变弱毒T株感染性克隆，将其全长结构蛋白基因替换为猪瘟病毒石门毒株全长结构蛋白基因，得到猪瘟石门重组病毒的全长感染性克隆pSMT，随后在pSMT E1蛋白的C端插入Flag抗原基因作为鉴别标记，构建猪瘟石门重组标记病毒的感染性克隆pSMT-Flag，并经电转染法拯救出两株重组病毒^[17]。

随着CSFV病毒学的发展，研究者们逐渐认识到CSFV在感染中诱导产生的抗体主要是与结构蛋白Erns、E2和非结构蛋白NS3结合的。由于NS3所含有的抗原表位在瘟病毒属中具有很高的保守性^[12]，很难进行鉴别区分，这使得Erns和E2成为进行标记疫苗候选毒株构建的基础。

1990年，有研究者发现了WH303等6株猪瘟特异性单抗，它们可以和CSFV的56个毒株反应，但是不和其他瘟病毒属成员BVDV和BDV反应^[18]。后来，单抗WH303识别的最小表位基序被证明是TAVSPTTLR^[19]，为后续基于WH303位点的突变毒株的构建提供了理论依据。

FlagT4v是由猪瘟强毒BICv的E1中加入一个Flag片段，将E2中WH303最小识别基序TAVSPTTLR突变构建而来的^[20]。接种FlagT4v的猪血清可以分别与单抗WH174和单抗Flag结合，但是却不和单抗WH303结合，而以强毒BICv接种猪得到的抗血清可以同时和WH174及WH303单抗发生反应，但是不和Flag单抗反应。该实验结果说明FlagT4v可以作为区分CSFV感染与野毒感染的标记疫苗。然而，FlagT4v是在强毒基础上构建的，所以存在着不可避免的生物安全隐患，连续传代可能恢复毒性，所以需要经过不断修饰来完善。Holinka等从致死猪的脾脏中分离回复毒株FlagT4SPv，进行全基因组测序后与FlagT4v进行基因序列比对，发现FlagT4SPv有3个氨基酸位点突变、18个氨基酸残基和1个核苷酸的缺失，其中N850S这一位点位于WH303最小识别基序^[21]。基于以上发现，在FlagT4v的基础上设计了6个突变毒株：FlagT4A109V、FlagT4N850S、FlagT4A993E、T4A109V、T4N850S、T4A993E，在保持和敲除Flag的基础上，分别对可能造成毒力恢复的3处氨基酸突变位点进行单独突变。其中T4N850S对猪有致病性，证实了N850S突变是导致传代恢复毒性的原因。在此基础上，设计了FlagT4Gv，对FlagT4v的Flag和WH303最小识别基序部分位点进行突变以提高其稳定性，同时将第850位氨基酸由天冬酰胺突变为甘氨酸，并成功拯救出活病毒。FlagT4Gv不仅具有良好的免疫原性和基因稳定性，而且在接种后3 d即可产生免疫反应^[22]，具有很好的保护效力。

最近出现的C-DIVA是第一个以弱毒突变WH303抗原表位构建的候选标记疫苗，将C株的TAVSPTTLR片段突变了1个氨基酸、敲除2个氨基酸，成功实现区别免疫与野毒感染^[23]。

近十几年，基因突变株的构建经历了从以强毒为基础到以弱毒为基础的转变，而且在技术上正在不断完善。以弱毒为基础构建的毒株安全性相对较高，减小了其回复突变为强毒的可能。

哈尔滨兽医研究所仇华吉团队研究评估了腺病毒表达载体表达CSFV的E2蛋白，构建出候选标记疫苗rAdV-SFV-E2^[24]。他们将其接种兔子，发现接种后在9-189 d产生CSFV特异性中和抗体；猪接种后第5代产生强烈的体液和细胞免疫应答，而且可以在临床和病毒学上产生良好的保护性；先存的母源抗体不会干扰rAdV-SFV-E2的免疫效力；从安全、免疫剂量、母系遗传效果、二次免疫和伪狂犬疫苗共同免疫等方面综合来看，rAdV-SFV-E2都具有较高的安全性^[25]。Luo等通过密码子优化的方法，在毕赤酵母中加强了Erns蛋白的表达，并建立了一种基于酵母表达Erns的间接ELISA方法，该优化过的间接ELISA方法可以在感染后6 d从感染CSFV的猪血清样本中检测到CSFV特异性抗体，并且可以区分野毒感染和rAdV-SFV-E2免疫，还具有较高的敏感性和特异性^[26]。肠道沙门氏菌对rAdV-SFV-E2的免疫效果有显著的加强作用^[27]，因此可作为rAdV-SFV-E2的佐剂。rAd-Erns-E2株由腺病毒载体表达石门株E2和Erns构建而来，对猪具有良好的保护作用，而且免疫后的猪攻毒后没有出现CSF相关临床症状，也没有检测到CSFV的存在^[28]。

痘病毒、猪伪狂犬病病毒等复制性病毒载体具有高水平稳定表达外源基因的优点^[1]。已有研究将CSFVE2基因插入痘病毒的TK基因中，成功获得了能表达E2蛋白的rSPV/CSFV-E2^[29]，并且通过后续研究证明了rSPV/CSFV-E2对猪具有很好的保护性^[30]。也有研究者将E2基因插入猪伪狂犬病病毒的gD基因位点，可以使猪伪狂犬病病毒丧失感染性，使病毒不会从免疫动物传染到其他动物，安全性大大提高并且同时可对猪伪狂犬病和猪瘟提供双重保护^[31]。

病毒活载体疫苗具有很大的开发应用潜力，美国梅岛口蹄疫腺病毒载体疫苗已经获批，国内对腺病毒载体疫苗的研究也很多。但截至目前，人类还不完全了解病毒的自然发生及变异机制，不能确定其是否会产生携带外源基因的强毒突变株^[1]，这也意味着对此还需要做更深入细致的研究。

基因重组疫苗作为标记疫苗的一种，在国内外的研究已比较成熟。Flc9和Flc11分别由牛病毒性腹泻病毒Ⅱ(BVDVII)5250株的N端176个氨基酸(E2的ABC区)和整个Erns段分别替换C株相关区域株构建而来^[32]。Flc9中的E2基因具有良好的免疫原性，与BVDV的中和反应滴度是CSFV的2-6倍。但是相比两基因替换株，Erns和E2两基因敲除毒株更安全，因为他们不在动物中横向传播^[33]。

CP7_E2alf是以BVDVCP7株为框架，通过反向遗传学方法用CSFV187株的E2基因替换CP7株相应区段构建而来^[34]，具有良好的免疫原性。在肌肉接种后1周产生保护性，口服免疫2周产生保护性，可以用作紧急接种候选疫苗^[35]。猪体内接种CP7_E2alf后14 d和6个月后，细胞因子TNF-ɑ和IL-6含量明显降低，而IFN-γ和IgG2含量却明显升高，这说明CP7_E2alf在细胞免疫方面具有重要作用^[36]。CP7_E2alf作为欧盟第一个被官方授权的标记疫苗^[37]，不仅在保护效力和区别免疫与野毒感染方面有很好的效果^[38]，而且基因具有稳定性^[39]，这样在很大程度上规避了生物安全隐患。CP7_E2alf株的保护性强于Flc11株^[40]，对其大面积普及应用可以有效减少因错误扑杀免疫抗体阳性猪而造成的经济损失^[41]。

基因重组疫苗集合了多种毒株的基因，因而可以获得多联免疫效果。但是这种方法的一个潜在危险是重组的野毒株之间可能通过同源或非同源重组导致突变为强毒性毒株，造成一定的生物安全隐患。

最早的亚单位疫苗研究开始于1993年，Hulst等构建了表达CSFV E2基因的重组体pAcAS3gXE2±TMR，通过杆状病毒AcNPV共转染昆虫细胞sf-2，用20-100 μg E2蛋白免疫的猪可以抵抗100倍LD₅₀的猪瘟强毒攻击^[42]。在国外该疫苗已经被注册使用，但是免疫效果不如C株，而且需要免疫两次。中国台湾研究者利用巴斯德毕赤酵母系统成功表达了重组E2蛋白，并在其后的动物试验中也取得了成功^[43]。中国大陆对亚单位疫苗的研究比较深入，已有一个杆状病毒表达的E2亚单位疫苗被注册使用，还有正在研究的如CHO表达E2等，亚单位疫苗的应用前景很广阔。

亚单位疫苗的有效成分是病毒粒子的一部分，因此具有良好的安全性^[44]。但是，亚单位疫苗需要有相应的鉴别诊断方法，目前有Erns抗体的检测试剂盒，可以配合E2亚单位疫苗使用。亚单位疫苗的免疫原性通常较低，需要与佐剂同时使用才能达到理想的保护效果。纳米磷酸钙佐剂对疫苗中的有效多肽成分具有很好的吸附能力，吸附率可以达到70%^[45]，黄芪多糖佐剂能够促进免疫球蛋白mRNA的表达与释放，增强免疫球蛋白水平，同时参与机体的补体反应，放大补体联级^[46]，促进抗原识别部位柔性结构转变为刚性结构，从而增强猪瘟抗体形成。

随着兽用生物制品技术和分子生物学、基因工程方法研究的不断深入，CSF标记疫苗技术正在不断发展。虽然迄今基于各种方法的弱毒株构建研究层出不穷，但是只有少数候选毒株可以经过考验得到官方授权，如德国动物疾病研究中心构建的CP7_E2alf株。基于生物安全方面的考量，各种猪瘟标记疫苗在正式投入应用前仍需通过充分的试验资料证明其安全性和有效性^[47]，而今后CSF标记疫苗的研究不仅是开发新的具有可行性的CSF标记疫苗设计策略，更重要的是要逐步解决已有备选CSF标记疫苗的优化和安全性、稳定性等的验证，其次需配套一个准确可靠的鉴别诊断方法，使其能够真正形成商品化产品。相信在未来，会有更多符合要求的标记疫苗问世，这些标记疫苗也将会在人类对抗CSF的过程中起到不可替代的作用。