2013年3月，我国首次报道了人感染H7N9流感病毒的病例^[1]，之后H7N9流感病毒在我国反复流行，至今已发生了5次流行^[2]。H7N9流感病毒在鸡群中表现为低致病性，但2017年初广东省疾病预防控制中心报道：新分离的H7N9流感病毒毒株血凝素(Hemagglutinin，HA)蛋白的裂解位点具有多个碱性氨基酸的插入，暗示已经出现了高致病性H7N9禽流感病毒毒株^[3]。疫苗是禽流感病毒防控的主要手段之一，并且研究表明H7亚型禽流感病毒灭活疫苗^[4-5]和H7N9病毒样颗粒(VLP)疫苗^[6]等对鸡群具有良好的免疫原性，因此对鸡群进行H7N9禽流感疫苗的免疫是一个趋势。然而鸡群在疫苗免疫后，需要一种可靠的抗体检测方法。

目前禽流感病毒抗体检测的常用方法主要包括血凝抑制(HI)试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)^[7]。HI试验检测对象为阻断HA蛋白与受体结合的功能性抗体，而基于HA蛋白的间接ELISA可以检测所有结合HA蛋白的抗体，在保留亚型特异性的同时具有更高的灵敏性^[8]。ELISA具有简便、高效、可用于高通量检测和结果判定客观的优点^[9]，因此本研究旨在提供一种基于HA蛋白的H7N9亚型禽流感病毒抗体间接ELISA检测方法。

H7N9 HA蛋白在流行过程中发生了迅速变异，形成了长江三角洲系(Yangtze River Delta，YRD)和珠江三角洲系(Pearl River Delta，PRD)两个系(Lineage)^[3]，这两个系又可以进一步分为至少6个分支(Clade)，包括W1、W2-A、W2-B、W2-C、W3-A和W3-B分支^[10-11]。为了建立检测多个分支HA蛋白抗体的ELISA检测方法，我们分别表达和纯化了属于W1、W2-A和W2-B 3个分支的3个H7N9毒株全长HA蛋白作为ELISA抗原。我们之前的研究显示跨膜区(Transmembrane domain，TM)替换为H3 HA TM的H7-53TM蛋白(W2-B分支)具有更好的稳定性，因此同时表达、纯化了H7-53TM作为抗原，比较跨膜区置换对HA蛋白检测H7N9禽流感病毒抗体的影响，并建立一种可靠的H7N9亚型禽流感病毒抗体间接ELISA检测方法。

1 材料与方法 1.1 毒株和基因片段

H7N9流感病毒毒株A/Chicken/Guangdong/53/ 2014(H7N9) (H7N9-53)、A/Hangzhou/1/2013(H7N9) (H7N9-HZ13)和A/Chicken/Guangdong/MCX/ 2014(H7N9) (H7N9-MCX)的HA基因：H7-53WT (Genbank登录号：KY221841)、H7-HZ13 (Genbank登录号：KC853766.1)和H7-MCX (Genbank登录号：KY221844)分别由Thermo Fisher Scientific公司或华大基因公司合成，同时合成来源自H7-53WT基因、跨膜区置换为H3 HA TM的H7-53TM基因片段。内部基因来源于A/Puerto Rico/8/34(H1N1)，NA基因来源于H7N9-53毒株，HA基因分别来源于H7N9-53、H7N9-HZ13和H7N9-MCX的重组H7N9流感病毒rH7N9-53WT、rH7N9-HZ13和rH7N9-MCX，由本实验室制备并保存^[12]。

1.2 主要试剂和仪器

Sf9昆虫细胞、pFastBac1质粒由本实验室保存；大肠杆菌DH5α、DH10Bac感受态由本实验室制备并保存；H1N1流感病毒、H5N1禽流感病毒、H9N2禽流感病毒、禽传染性支气管炎病毒(IBV)、新城疫病毒(NDV)单因子阳性SPF鸡血清由实验室制备并保存。Sf900Ⅱ无血清培养基购自Thermo Fisher Scientific公司；H7N9亚型流感病毒HA蛋白兔IgG单克隆抗体购自义翘神州公司；HRP (辣根过氧化物酶)标记羊抗兔IgG(H+L)、HRP标记驴抗鸡IgY(H+L)以及Cy3标记的羊抗兔IgG(H+L)购自Proteintech公司；H7N9禽流感病毒HI抗原购自哈尔滨维科公司。

激光共聚焦显微镜(Leica TCS-SP5)，德国徕卡显微系统有限公司；流式细胞仪(FACSCalibur)，BD Biosciences公司；全自动酶标仪(ELx800)，BioTek公司。

1.3 重组质粒和重组杆状病毒的构建

1.3.1 重组质粒的构建: 以1.1中合成的4个基因片段为模板，通过PCR扩增出相应的HA基因，并分别插入pFastBac1质粒中^[12]。所构建的重组质粒通过双酶切和测序进行鉴定。

1.3.2 重组杆状病毒的构建: 分别将4个重组质粒转化至含有杆状病毒基因组转座子(Bacmid)的大肠杆菌DH10Bac，含有HA基因的重组转座子(rBacmid)通过M13引物进行PCR鉴定。将鉴定正确的rBacmid转染至Sf9细胞，28±2 ℃培养72 h后收集(4 ℃、3 000×g离心5 min)转染上清，即为重组杆状病毒(rBV)种毒。

1.4 蛋白表达、纯化与检测

1.4.1 蛋白表达与纯化: 分别将含有4个HA基因的重组杆状病毒以感染复数(MOI)为1感染Sf9细胞，感染65 h后收集(室温500×g离心5 min)细胞进行表达的检测或者进行蛋白纯化。所表达的4种HA蛋白通过离子交换层析方法进行纯化^[13]，纯化的HA蛋白用于间接ELISA包被抗原。

1.4.2 SDS-PAGE与Western blot: 取细胞裂解液或者纯化的蛋白通过10%的聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳。将电泳分离后的凝胶转印至PVDF膜，PVDF膜经过封闭后，分别以H7N9 HA单抗为一抗、HRP标记的羊抗兔IgG为二抗进行孵育，最后通过ECL进行显色。

1.4.3 间接免疫荧光(IFA): 分别将感染4种rBV或野生杆状病毒(wt-BV)的Sf9细胞进行固定后，用3%牛血清白蛋白(BSA)封闭，以H7N9 HA单抗为一抗、Cy3标记的羊抗兔IgG为二抗标记HA蛋白，用DAPI染核，通过激光共聚焦显微镜进行观察和拍摄。

1.4.4 流式细胞术: rBV或wt-BV感染的悬浮Sf9细胞，用70%乙醇固定，以H7N9 HA单抗为一抗、Cy3标记的羊抗兔IgG为二抗标记HA蛋白后通过流式细胞仪进行分析。

1.5 SPF鸡血清的收集

分别将重组H7N9流感病毒rH7N9-53WT、rH7N9-MCX、rH7N9-HZ13制备的全病毒灭活疫苗免疫SPF鸡，以PBS免疫的SPF鸡为阴性对照。分别在2周龄进行首次免疫，首次免疫后2周用相同的疫苗进行加强免疫，加强免疫后2周进行第三次免疫，首次免疫前和每次免疫后对鸡进行翅静脉采血并分离血清，并通过HI试验确定每份血清的HI滴度。共收集H7N9阳性鸡血清90份，H7N9阴性鸡血清44份。

1.6 血凝抑制(HI)试验

将H7N9禽流感病毒HI抗原制备为4单位抗原，同时制备1%鸡红细胞。HI试验按照《兽药典》中的方法进行。

1.7 间接ELISA反应条件的确定

通过棋盘法确定间接ELISA的血清样品稀释度、抗原包被浓度和酶标驴抗鸡IgY二抗的稀释度。用ELISA方法对44份H7N9阴性鸡血清进行检测，计算cutoff值，cutoff值计算方法为阴性血清平均OD₄₅₀值(x)+3×标准差(s)。

1.8 特异性试验

分别将4种HA蛋白为包被抗原的ELISA方法对H1N1、H5N1、H9N2流感病毒、IBV、NDV单因子阳性SPF鸡血清进行检测，同时以H7N9阳性鸡血清作为阳性对照，将得到的OD₄₅₀值与cutoff值进行比较确定ELISA方法的特异性。

1.9 敏感性试验

分别取rH7N9-53WT、rH7N9-HZ13和rH7N9-MCX灭活疫苗免疫的阳性鸡血清进行梯度稀释，以ELISA结果OD₄₅₀值小于cutoff值时的血清稀释度为ELISA滴度，并与HI滴度进行比较。

1.10 重复性试验

取H7N9阳性鸡血清和阴性鸡血清各3份，按建立的间接ELISA方法对3个批次蛋白进行3次检测，计算批内、批间变异系数。

1.11 ELISA检测方法的统计学分析

通过间接ELISA方法对44份阴性血清和90份H7N9禽流感病毒阳性鸡血清进行检测。检测结果通过GraphPad Prism 6软件受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve，ROC曲线)分析方法对间接ELISA方法进行可靠性分析^[14]。根据ROC曲线分析得到的特异性和敏感度值，取两者之和最大时的Cutoff值作为优化Cutoff值，进而优化ELISA方法的准确性^[15]。通过Spearman’s等级相关方法对ELISA与HI试验的相关性进行分析。

2 结果与分析 2.1 H7N9流感病毒HA蛋白的表达和纯化

2.1.1 重组杆状病毒的构建: HA基因H7-53WT、H7-HZ13和H7-MCX分别属于W2-B、W1和W2-A分支^[10]，为了在昆虫细胞-杆状病毒表达系统中表达HA基因，分别将其插入pFastBac1质粒中。我们之前的实验结果显示跨膜区置换为H3 HA TM的H7-53TM具有更好的稳定性，为了比较其与H7-53WT作为间接ELISA包被抗原是否具有差异，同时将H7-53TM基因插入pFastBac1质粒中。4个重组质粒双酶切和测序鉴定结果符合预期，表明重组质粒均构建成功。之后通过1.3.2中的方法构建重组杆状病毒(rBV)，通过PCR检测，结果符合预期，因此插入4种HA基因的rBV分别构建成功。

2.1.2 HA蛋白的表达: 将分别插入H7-53WT、H7-53TM、H7-HZ13和H7-MCX基因的rBV感染Sf9细胞后检测HA蛋白在细胞中的表达。Western blot结果显示4种HA蛋白均能够表达，并且分子量大小相近，略小于70 kD (图 1)。IFA结果显示4种HA蛋白均定位于Sf9细胞膜上(图 2A)。流式细胞技术检测结果显示，rBV感染的Sf9细胞(红色曲线)中表达4种HA蛋白的比例均在95.67%-95.81%之间(图 2B)。

2.1.3 HA蛋白的纯化: 将Sf9细胞表达的HA蛋白经过离子交换层析方法进行纯化，纯化的HA蛋白进行SDS-PAGE检测，结果显示4种HA蛋白纯化后的纯度相当，可以达到约90% (图 3)。

2.2 4种HA蛋白作为ELISA抗原的比较

2.2.1 间接ELISA反应条件的确定: 以4种HA蛋白为抗原通过棋盘法间接ELISA检测，结果显示4种H7 HA蛋白的最佳包被浓度均为90 ng/孔，最佳鸡血清稀释度均为1:200，抗鸡IgY二抗最佳稀释度均为1:5 000。根据44份阴性血清确定H7-53WT、H7-53TM、H7-HZ13和H7-MCX蛋白为抗原的Cutoff值分别为0.256 7、0.273 1、0.268 1和0.274 5，均在0.25-0.28之间。

2.2.2 特异性试验: 特异性试验结果显示：H7-53WT、H7-53TM和H7-MCX为包被抗原对H1N1、H5N1、H9N2流感病毒、IBV和NDV阳性鸡血清ELISA检测的OD₄₅₀值小于Cutoff值，具有良好的特异性；但是以H7-HZ13 (W1分支)为包被抗原对H1N1和H5N1流感病毒阳性鸡血清ELISA反应结果高于Cutoff值，表现为假阳性，其特异性较差(表 1)。

2.2.3 敏感性试验: 敏感性试验结果显示，4种HA蛋白作为抗原检测W1、W2-A和W2-B分支灭活病毒疫苗产生的血清具有相同的敏感性(表 2)。

2.2.4 重复性试验: 以3个批次制备的4种HA蛋白作为抗原分别对3份H7N9阳性血清和3份阴性血清进行重复性试验，结果显示：H7-53TM作为抗原，批内变异系数(CV)为0.6%-6.3%，批间变异系数为4.1%-6.7%，均小于10%，重复性良好。但是3种野生型HA蛋白对部分血清检测的变异系数超过10%，其重复性较差。其中，H7-53WT作为抗原，批内变异系数为1.5%-16.6%，批间变异系数为1.7%-16.0%；H7-HZ13作为抗原，批内变异系数为0.7%-25.5%，批间变异系数为2.7%-9.1%；H7-MCX作为抗原，批内变异系数为0.9%-16.5%，批间变异系数为3.3%-7.8%。

2.3 以H7-53TM为抗原的间接ELISA方法

2.3.1 ROC曲线分析: 4种HA蛋白中，H7-53TM作为抗原具有最好的特异性和重复性，因此H7-53TM最适合作为H7N9亚型禽流感病毒抗体间接ELISA检测方法抗原。以H7-53TM为抗原对134份鸡血清进行检测，通过ROC曲线分析该检测方法的鉴别能力。结果显示，该检测方法的线下面积(Area under curve，AUC)为1.0±0.0 (P < 0.000 1)，这表示该检测方法具有极高的鉴别能力(图 4A)。当Cutoff值为0.273 1时，可以精准区分阴性和阳性的鸡血清(图 4B)。

2.3.2 ELISA方法与HI试验相关性: 134份血清HI滴度与以H7-53TM为抗原的ELISA结果的相关性分析结果显示，其相关系数为0.854 6，P < 0.000 1，为显著强相关(图 5A)。线性回归方程为：Y=5.793 7X-1.894 0 (X为OD₄₅₀值，Y为HI滴度)，拟合度为0.864 3，P < 0.000 1。为了评价研究建立的ELISA方法能否同时检测不同分支疫苗株免疫产生的抗体，分别对不同分支疫苗株免疫的血清HI滴度与ELISA结果的相关性进行了分析，相关性系数分别为0.822 9 (rH7N9-53WT，P < 0.000 1)、0.517 0 (rH7N9-HZ13，P=0.003 4)和0.540 3 (rH7N9-MCX，P=0.002 1)，表明建立的ELISA方法与W2-B、W1和W2-A分支疫苗株免疫血清HI滴度具有显著相关性(图 5B-D)。

2.3.3 弱阳性样品ELISA方法可靠性: 由于所收集的阳性血清(除3份以外) HI抗体滴度均大于等于2⁵，为了分析建立的ELISA方法对于弱阳性样品是否同样具有良好的鉴别能力，随机选取17份阳性血清样品进行梯度稀释，将稀释后HI滴度为2⁵-2¹以及恰好检测不到的稀释血清样品采用ELISA方法进行检测，并通过ROC曲线分析其鉴别能力。ROC分析结果显示，该ELISA方法AUC为0.96±0.02 (P < 0.000 1)，具有较好的鉴别能力(图 6A)。根据1.11中的方法，该ROC曲线也可以用于优化Cutoff值。当Cutoff值取值为0.527 5时，该ELISA方法的特异性为97.7%，敏感性为82.4%，两者之和达到最大，同时具备高特异性和高敏感性的特性，能够准确区分HI阴性血清和弱阳性血清，因此将Cutoff值调整为0.527 5 (图 6B)。

3 讨论

H7N9亚型禽流感病毒血清学检测对于鸡群H7N9亚型禽流感病毒的感染情况和免疫水平的监测具有重要意义。目前，H7亚型禽流感病毒血清学检测方法主要采用HI试验^[16]，而ELISA方法具有更加高效、简便、高通量等优点，并且待检血清不需要进行前处理，因此更加适合现地检测。已报道的H7亚型HA抗体ELISA检测方法主要为竞争ELISA。Sala等^[17]、Yang等^[18]和Jensen等^[19]以灭活的H7N1亚型流感病毒为抗原，通过检测待检血清抑制H7 HA蛋白单抗与抗原的反应来评价血清中H7抗体的含量。为了避免灭活病毒为抗原的竞争ELISA受到待检血清中NA蛋白抗体的干扰，Shien等^[20]和He等^[21]分别以大肠杆菌表达和杆状病毒表面展示的H7 HA蛋白为抗原建立了竞争ELISA方法。这些竞争ELISA方法具有特异性高和能够检测多物种血清的优点，但是还存在一些缺点，例如：(1)由于单抗特异识别HA蛋白的表位，竞争ELISA方法不能检测所有H7亚型的抗体；(2)当抗原为灭活病毒时，血清中NA蛋白抗体会影响竞争ELISA的特异性；(3)竞争ELISA的敏感度较低，Shien等^[20]建立的竞争ELISA在检测HI滴度为2⁶和2⁵的血清时，敏感性仅有33%和20%。间接ELISA方法具有特异性高、灵敏度好的优点，因此本研究建立了一种基于H7N9流感病毒HA蛋白的间接ELISA方法，对鸡血清中H7亚型HA抗体进行检测。

前期研究表明昆虫细胞表达的HA蛋白具有良好的抗原性，其作为抗原的间接ELISA检测具有良好的特异性、敏感性和重复性^[22]。因此本研究通过昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达了不同分支的4种H7N9流感病毒HA蛋白，其表达水平没有明显差异，所表达的蛋白进一步通过离子交换层析的方法进行纯化。由于4种HA蛋白具有相同的等电点，因此其纯化效果相似，终产物的纯度保持一致。然而以4种HA蛋白为抗原的ELISA检测方法表现出不同的特异性和重复性，跨膜区置换为H3 HA TM的H7-53TM作为抗原的ELISA方法不仅特异性良好，并且具有最好的重复性，批内和批间变异系数小于10%，而3种野生型HA蛋白作为抗原检测部分H7N9阳性或阴性血清批内和(或)批间变异系数大于10%，并且H7-HZ13作为抗原特异性较差。我们之前的研究证明H7-53TM蛋白相比于H7-53WT具有更高的二硫键连接的三聚体和更高的热稳定性^[12]，这可能是跨膜区置换影响HA蛋白抗原ELISA重复性的原因。

进一步通过ROC曲线对以H7-53TM为抗原的ELISA方法的鉴别能力进行分析，发现其能够精准地区分H7N9亚型禽流感病毒抗体阳性和阴性血清(图 5)。对于HI滴度 < 2⁵的弱阳性鸡血清，ROC曲线分析结果显示该ELISA具有良好的可靠性，可以准确区分弱阳性血清和阴性血清。通过弱阳性血清ELISA结果的ROC曲线，我们进一步将Cutoff值确定在0.527 5，以提高该ELISA方法的准确性。与HI试验进行比较发现，以H7-53TM为抗原的ELISA方法与HI试验具有显著强相关性，并且所得到的线性回归方程拟合度较好，可以通过ELISA结果估算HI抗体滴度。Lam等研究表明H7N9流感病毒在流行过程中变异形成了不同的HA分支^[10]，并且H7N9流感病毒正在持续不断地变异。我们相信H7亚型禽流感疫苗在使用后会像其他亚型禽流感病毒疫苗一样，需要根据流行情况周期性地更换疫苗株。然而本研究建立的ELISA方法与W1、W2-A和W2-B分支疫苗株血清HI滴度都具有显著相关性，能够同时检测不同分支疫苗株免疫产生的HA抗体，这提示该ELISA方法能够满足不同H7N9亚型禽流感疫苗株免疫水平的检测要求，不需要频繁更换检测抗原。

综上所述，跨膜区置换的H7-53TM蛋白检测H7N9禽流感病毒抗体具有更好的重复性，以H7-53TM HA蛋白为抗原的间接ELISA检测方法能够精准区分H7N9亚型禽流感病毒阳性和阴性血清，检测结果与HI试验结果具有强相关性，为H7N9亚型禽流感病毒抗体的检测提供了一种适用于实验室和现地的灵敏、便捷的检测方法。