尿素水解菌是一类重要的重金属污染修复微生物，在自然环境中普遍存在^[1]，它们能够合成脲酶，在细胞内外特异性地催化尿素水解^[2-3]，生成CO₃^2-和NH₄^+[4]，在细胞周围形成微米尺度的碱性环境^[5]，导致Ca²⁺与CO₃^2-的过饱和，诱导生成碳酸钙沉淀^[6]。重金属离子则在碳酸钙沉淀的同时形成共沉淀，从而将重金属离子钝化^[7-9]，达到修复目的。近年来由于该技术存在高效、对氧化还原电位不敏感、对土壤环境没有二次污染等优点，应用尿素水解菌诱导碳酸钙沉淀钝化土壤重金属已经发展成为一种绿色原位土壤修复新技术。各种尿素水解菌被应用于地下水和土壤重金属污染的修复，其中Sporosarcina ginsengisoli^[10]、Halomonas sp.^[8]、Bacillus sp.^[11]、Exiguobacterium undae^[12]等多种尿素水解菌被成功应用于重金属污染环境的原位修复。

筛选能够修复重金属污染的尿素水解菌的首要条件是它们需要对重金属毒性具有良好的耐受性。传统的筛选方法通常是测定系列浓度重金属胁迫下细菌的生长曲线^[13]，但这种方法耗时长(通常需要96 h左右)，需要的样品量也大。本研究根据尿素水解菌吸附水解尿素时会产生热量交换的原理，应用微量等温滴定量热仪来检测Hg²⁺对尿素水解菌水解尿素的微量热量交换，从而测定尿素水解菌对Hg²⁺毒性的耐受性。与常规的pH和OD₆₀₀两个指标进行了对比分析，以确定SIITC的可行性。研究结果为今后研究微生物对重金属的耐受性提供了新的思路。

1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器

DreamTaq TM DNA Polymerase，MBI公司；Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒、dNTPs、SanPrep柱式DNAJ胶回收试剂盒、SanPrep柱式DNAJ胶回收试剂盒、DNA ladder mix marker、SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒，生工生物工程(上海)股份有限公司；琼脂糖，BBI公司；pMD^®18-T Vector连接试剂盒，Takara公司。

DNA电泳槽、稳压电泳仪，北京六一仪器厂；凝胶成像仪，上海复日科技仪器有限公司；PCR仪、测序仪，Applied Biosystems公司；Surf系列精密单道可调移液器，生工生物工程(上海)股份有限公司；微量等温滴定量热仪，美国TA仪器。

1.2 尿素分解菌的分离

为适应具有较高盐度的地下水和土壤的重金属污染的修复，实验用的尿素水解菌从咸菜中分离获得。咸菜购买于新疆乌鲁木齐市某大型超市。富集和分离培养基分别为营养肉汤培养基(NB)(蛋白胨10 g/L，牛肉粉3 g/L，氯化钠5 g/L，pH 7.2)和LB基础培养基(胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10 g/L，pH 7.4)。将咸菜固体样品接种到装有100 mL营养肉汤培养基的250 mL锥形瓶中，28、130 r/min富集培养24 h。吸取2 mL富集培养液的悬液，加入到100 mL含2%尿素和3% NaCl的营养肉汤选择培养基中，培养24 h后吸取1 mL耐盐菌菌液，采用十倍稀释法分离菌种，得到的单个细菌菌落采用平板划线法进行纯化获得纯培养。为了能够更方便直接地反映出分离菌株是否具有产生脲酶活性的能力，以测定pH值的变化来表示菌体的尿素分解能力。

纯化培养的尿素水解菌培养过夜后，按SK8255 (细菌)试剂盒操作说明提取基因组DNA。PCR扩增16S rRNA基因的通用引物为：正向引物(27F)：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物(1492R)：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反应体系：Template (基因组DNA 20-50 ng/μL) 0.5 μL，10×Buffer (含Mg²⁺) 2.5 μL，dNTPs (各2.5 mmol/L) 1.0 μL，酶(5 U/μL) 0.2 μL，正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL，加双蒸H₂O至25 μL。PCR反应条件：94；94，55，72，30个循环；72；4终止反应。序列测定由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3 Hg²⁺胁迫下尿素分解菌生长曲线和尿素分解能力

取140 mL去离子水加入到250 mL锥形瓶中，加入2.7 g NB培养基，溶解后置于灭菌锅，1×10⁵ Pa灭菌20 min，灭菌后置于无菌操作台冷却。称量3.0 g尿素溶解于10 mL去离子水中，过0.22 μm滤膜将10 mL尿素溶液添加到NB培养基中(尿素质量分数为2%)。加入不同体积的高浓度的Hg²⁺溶液，使溶液的最终Hg²⁺浓度分别为：0、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 μmol/L。接种1 mL菌液，28、130 r/min振荡培养，间隔一段时间取样测pH和OD₆₀₀值，以pH和OD₆₀₀值作为检测指标研究尿素分解菌对Hg²⁺的耐受性。

1.4 Hg²⁺胁迫下尿素水解菌分解尿素的SIITC实验

取80 mL去离子水加入到250 mL锥形瓶中，加入1.6 g NB培养基和1 g NaCl，溶解后置于灭菌锅，1×10⁵ Pa灭菌20 min，灭菌后置于无菌操作台冷却。称量1.8 g尿素，溶解于10 mL去离子水中，过0.22 μm滤膜将10 mL尿素溶液添加到NB培养基中(尿素质量分数为2%)。加入不同体积的高浓度的Hg²⁺溶液，使溶液的最终Hg²⁺浓度分别为：0、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 μmol/L。接种1 mL菌液，28、130 r/min振荡培养6 h，然后利用微量等温滴定量热仪进行SIITC实验：将20 μL培养6 h后的菌液一次性注入含有1.2 mL去离子水的反应器中，平衡300 s基线后测定热量交换速率。试验温度为25℃。

1.5 统计分析

实验设置3次重复，所得数据利用Excel 2003求算术平均值、标准方差等，用Origin 9.0绘制图表，图中误差线代表标准方差。

2 结果与讨论 2.1 具有尿素分解能力菌株的筛选与鉴定

尿素水解菌从咸菜中分离获得。通过富集培养和十倍稀释法分离菌种得到的单个细菌菌落，采用平板划线法进行纯化获得3株纯培养细菌。通过测定不同时间点细菌悬浮液pH值的方式反映菌株脲酶活性的高低。实验结果发现菌株J3在2%尿素培养基中培养96 h后菌液的pH值达到9.4。Chen等利用从尾矿土壤中分离的Bacillus sp.研究其对80 g/L尿素的分解能力，结果发现培养120 h后菌液pH值达到9.2^[14]。Chen等使用的细菌菌液的pH值(9.2)略低于本实验的pH值(9.4)，说明本实验菌株J3能够有效地分解尿素并且具有较强的脲酶活性。

利用菌株J3的16S rRNA基因序列，从GenBank数据库中进行Blast序列对比得到相近的细菌16S rRNA基因序列，然后利用软件ClustalX version 1.8进行多序列匹配排序，最后通过软件MEGA 5.0程序中Neighbor-Joining法，采用Kimura双参数计算模型来构建尿素分解菌的系统发育树，见图 1。从系统发育树可以确定所筛选出的尿素分解菌J3属于葡萄球菌属，并且与菌株Staphylococcus succinus的16S rRNA基因全序列的相似性达到了100%，因此可以确定从实验样品中筛选出的尿素分解菌J3为S. succinus。

2.2 尿素分解菌对Hg²⁺的耐受性

利用细菌的吸光度来测量细菌培养液的浓度，从而估计细菌的生长情况，OD₆₀₀值大小与菌体细胞密度呈正比关系。从图 2A的OD₆₀₀值变化规律可以看出，在相同培养时间内随着Hg²⁺浓度的增加，OD₆₀₀的数值是逐渐降低的，说明S. succinus的数量是减少的。由此可知，Hg²⁺浓度越高，S. succinus生长繁殖受到的抑制程度越高。培养细菌72 h后，不含Hg²⁺溶液的OD₆₀₀值达到1.5，远高于1 μmol/L Hg²⁺时的OD₆₀₀值(0.9)；Hg²⁺浓度升高至5 μmol/L和10 μmol/L时的OD₆₀₀值仅有0.6和0.4，说明在较高Hg²⁺浓度下S. succinus可以存活，它对Hg²⁺具有一定的耐受能力。Ruiz-Díez等研究发现Ensifer medicae在含12.5 μmol/L Hg²⁺的条件下OD₆₀₀值达到0.5^[15]，对Hg²⁺的耐受强度略高于本实验所用菌株。De等从沿海海水和沉积物中分离出来的5株汞耐受菌Proteus、Xanthomonas、Alteromonas、Aeromonas和Enterobacteriaceae，在200 μmol/L Hg²⁺浓度下仍能存活，说明它们具有很强的耐Hg²⁺能力^[16]。除此之外还有很多关于细菌对Hg²⁺具有较强耐受性的报道^[17-19]。

细菌分解尿素产生NH₄⁺和CO₃^2-，在细胞周围形成微米尺度的碱性环境，使得培养液的pH值升高。从图 2B的pH变化曲线可知，Hg²⁺浓度的增加导致溶液pH值的降低，反映出S. succinus菌分解尿素的量减少，尿素代谢产物的量减少。在无Hg²⁺条件下菌液pH快速升高，96 h后达到9.5，高于1 μmol/L Hg²⁺时的9.0。在5 μmol/L和10 μmol/L Hg²⁺浓度时，pH降低至8.7和8.4。说明S. succinus菌对尿素具有分解能力，但Hg²⁺浓度增加抑制了尿素分解速率。Chen等研究了从尾矿土壤中分离的Bacillus sp.对80 g/L尿素的分解能力，结果发现培养120 h后pH值达到9.2^[14]，略低于本实验的pH值(9.4)。

不同Hg²⁺浓度胁迫下细菌生长的OD₆₀₀和pH值表现为相同的下降规律，表明随着Hg²⁺浓度升高，S. succinus受抑制程度增强，菌数量随之降低，使得该菌分解尿素量减少的同时尿素代谢产物也是减少的，最终溶液的pH降低。但在较高Hg²⁺浓度下S. succinus依旧能够存活，S. succinus对Hg²⁺毒性具有一定的耐受性，是一种有望用于Hg²⁺污染环境修复的微生物。

2.3 SIITC检测尿素分解菌对Hg²⁺的耐受性

等温滴定量热法(Isothermal titration calorimetry，ITC)是近年发展起来的一种研究热动力学的重要方法，它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线^[20]。图 3为不同浓度Hg²⁺胁迫6 h后S. succinus吸附分解尿素时热量速率变化曲线。从图 3中可以看出，在各浓度Hg²⁺胁迫处理下，热量交换速率总体为负值，这表明S. succinus吸附分解尿素是一个吸热反应。反应100多s后，热量变化速率几乎为零，表明此时没有热量变化，反应完全结束。随着Hg²⁺浓度增加，最大热量速率是逐渐降低的，由不含Hg²⁺的-45 μJ/s的交换速率降至10.0 μmol/L Hg²⁺处理的-20 μJ/s；浓度为1.0 μmol/L和2.5 μmol/L Hg²⁺处理的交换速率分别为-35 μJ/s和-30 μJ/s。

对尿素分解交换速率进行积分处理得到体系反应热量。如图 3B所示，随着Hg²⁺浓度的升高，反应体系吸收的热量是逐渐降低的。在不含Hg²⁺的对照组吸收热量最大为-1 291.90 μJ；当Hg²⁺从0.5 μmol/L增加到10.0 μmol/L，热量值从-1 225.57 μJ下降到-535.75 μJ；但0.5 μmol/L Hg²⁺处理的热量值也是远大于1.0 μmol/L Hg²⁺处理的热量值-826.61 μJ，反映出1.0 μmol/L Hg²⁺对菌株的抑制性显著增加。

随着胁迫Hg²⁺浓度的升高，S. succinus吸附水解尿素的最大热量速率和反应体系吸收的热量是逐渐降低的。由此可以推断，随着Hg²⁺浓度的升高，S. succinus受抑制程度显著增强，分解尿素的速率和细菌吸附水解尿素时产生的热量交换量随之降低。

2.4 SIITC检测结果与常规方法的比较

利用传统的检测OD₆₀₀值的方法和SIITC新方法研究尿素分解菌S. succinus对Hg²⁺的耐受性，两者都得出相同的结论：随着胁迫Hg²⁺浓度的升高，S. succinus的受抑制性增强。pH、OD₆₀₀及S. succinus吸附水解尿素的反应热量值变化规律较为明显，有相同的降低趋势。从图 4可以看出，不同浓度Hg²⁺胁迫下S. succinus吸附水解尿素的反应热量值与溶液pH以及OD₆₀₀均有良好的相关性，相关系数r分别达到0.928和0.955。

SIITC已经被用于酶动力学研究^[21-23]和分子生物学研究^[24]，但本研究是第一次用SIITC法测试了细菌对重金属的耐受性，以期筛选修复微生物。本研究以重金属Hg²⁺为例，结合S. succinus吸附水解尿素时会产生热量交换的原理，应用微量等温滴定量热仪来检测Hg²⁺对S. succinus的毒性。研究发现最大热量交换速率和累积交换的热量都随Hg²⁺浓度升高而逐渐降低(图 3a、b)，反映了随Hg²⁺浓度的增加该菌代谢活性受到了越来越重的抑制。不同浓度Hg²⁺胁迫下S. succinus吸附水解尿素的反应热量值与溶液pH以及OD₆₀₀值均有良好的相关性(图 4A、B)，这表明SIITC与传统的生长曲线法、pH变化曲线法一样，可以可靠地检测S. succinus对Hg²⁺胁迫的耐受性。

3 结论

对比研究了SIITC、生长曲线法和基于尿素水解的pH变化曲线法3种方法检测耐盐尿素水解菌S. succinus对Hg²⁺毒性的耐受性。结果表明S. succinus吸附水解尿素的最大热量交换速率和累积热量值随Hg²⁺浓度升高而降低，而且热量交换速率和累积热量值的变化与相应的溶液pH变化和OD₆₀₀变化均有良好的相关性，证明SIITC可用来检测Hg²⁺对尿素水解菌的毒性。SIITC能否可靠地用来检测其它重金属对各种尿素水解菌的毒性还需要进一步深入研究和验证。耐盐尿素水解菌S. succinus在高浓度Hg²⁺胁迫下依然具有较好的生长速率和尿素代谢能力，说明S. succinus对Hg²⁺毒性具有一定的耐受能力，是一种有望用于Hg²⁺污染环境修复的微生物。