人腺病毒(Human adenovirus，HAdV)是一类无包膜的双链DNA病毒，分为A-G 7个血清学组，其中B组腺病毒感染目前已成为急性呼吸系统疾病的重要因素。B组又可分为B1和B2亚组，B1主要包括3、7、16、21、51型；B2包括14、34、35及55型。近年来，HAdV-55在成人特别是学校和军队特殊人群中引起日益频繁的急性呼吸道传染病流行^[1-4]。Cao等^[2]认为腺病毒55型是成人社区获得性肺炎的重要病因之一。Lu等^[1]在2009-2012年收集重庆地区急性呼吸道感染住院儿童鼻咽分泌物标本，在2 234例标本中检出191例腺病毒(8.55%)，6例为HAdV-55，占3.1%，提示HAdV-55也是引起儿童急性呼吸道感染的主要病原体之一。

55型腺病毒在中国最早发生于2006年3-4月中国陕西岐山县，毒株为QS-DLL。当时根据其六邻体高变区序列与已公布序列的比较，认为该病原体为HAdV-11a，杨朝辉在其2009年的硕士毕业论文中^[5]利用100多条引物，通过PCR测序的方法获取了QS-DLL的全基因核酸序列，QS-DLL分离株的核酸序列除了DNA多聚酶、pVI和pTP，其余序列与14型腺病毒的原型株(AY803294)有着最高的一致性( > 98.3%)。2010年，我国和国外的研究人员重新对这次疫情的病毒进行鉴定，通过生物信息学分析发现，该病毒是基于HAdV-B14型基因组骨架嵌合HAdV-B11型Hexon部分片段的重组新病毒，因此被命名为HAdV-55型^[6]。之后，HAdV-55感染的疫情在我国时有发生。

因此腺病毒基因组序列的获取不仅能够更准确地鉴定病毒，还为病毒变异特点、流行规律及发现新病毒提供了有效手段。然而腺病毒全基因序列的获取方法一直比较困难。Liu等^[7]将55型腺病毒分离株基因组分为73个片段进行PCR扩增，PCR产物纯化后测序，经校对和拼接后，获得HAdV-55 Y16株基因序列，然而该方法操作复杂繁琐，易出错。为进一步优化55型腺病毒基因组序列获取方法，本研究通过分析55型腺病毒的基因序列，设计12对引物，扩增12个基因片段，全覆盖55型腺病毒整个基因组，通过序列拼接获取其基因组序列。本研究采用的方法具有流程简单、经济高效等优点，将为55型腺病毒序列进化分析提供有力手段。

人喉癌上皮细胞HEp-2由中国科学院细胞库提供，由本实验室保存培养。咽试纸标本采集自本院急性上呼吸道感染病例。GIBCO胎牛血清、DMEM、青/链霉素、Invitrogen PureLink^TM Viral RNA/DNA Mini Kit购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；引物和PCR用高保真DNA聚合酶I5-MIX购自成都擎科梓熙生物技术有限公司；生化试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

台式离心机购自德国eppendorf公司；GeneAmp 9700型PCR仪购自美国ABI公司；电泳设备购自美国Bio-rad公司。

HEp-2细胞培养于含10%胎牛血清、100 μg/mL链霉素和100 U/mL青霉素的DMEM培养液，于37 ℃、5% CO₂饱和湿度培养箱中培养。

在BSL-2实验室接种HEp-2细胞于6孔板内，接种密度0.5×10⁶个/孔，培养24 h，弃去原培养基，PBS洗细胞3次，每孔加入2 mL的2%的DMEM培养基，并加入确诊患者的咽拭子标本150 μL，37 ℃孵箱内培养并逐日观察细胞病变(Cytopathogenic effect，CPE)情况，当75%以上的细胞出现典型CPE时，收集细胞上清，分装保存。

采用Invitrogen PureLink^TM Viral RNA/DNA Mini Kit提取上述病毒分离液的腺病毒DNA，具体操作参照说明书进行。

以提取的腺病毒DNA为模板，PCR反应扩增HAdV-55的目的基因。PCR反应体系(50 μL)：0.2 U/μL I5-MIX 25 μL，0.5 μmol/L上、下游引物各1 μL，灭菌水21 μL，50 ng/μL模板DNA 2 μL，混匀。PCR反应条件：98 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s，30个循环；72 ℃ 5 min。PCR产物利用1%琼脂糖凝胶电泳判断结果。PCR阳性产物交由成都擎科梓熙生物技术有限公司进行测序。

用生物信息学分析软件MEGA 6.06对获得的腺病毒基因组序列进行分析和标注，分析完成后序列提交至GenBank数据库。

本研究利用腺病毒敏感细胞系人喉癌细胞HEp-2分离腺病毒。标本接种后逐日观察细胞状态，接种后第2天，部分细胞开始肿大、圆缩、脱落，少数细胞出现死亡。接种后第4天，细胞出现明显的CPE，75%以上的细胞死亡。收集接种细胞上清，离心并过滤，获得HAdV-55病毒株，将其命名为SF04/SC/2016株。图 1为咽拭子接种不同时间点HEp-2细胞生长状况。

图 1　HAdV-55病毒株的分离培养(100×) Figure 1　Isolation of HAdV-55 strains (100×)

图选项

抽提SF04/SC/2016病毒株的DNA，对其进行分段PCR扩增，分段策略及对应的PCR扩增引物和测序引物如表 1所示，PCR反应体系和反应条件如1.4所述，PCR产物电泳如图 2所示，产物5、6、10和11出现非特异性扩增条带，其余片段特异性较好。切胶回收正确大小的PCR产物并测序，12个片段序列拼接后最终获得SF04/SC/2016病毒株的全基因序列，病毒基因全长34 755 bp，提交至GenBank数据库，获得基因登录号KY002684。

图 2　PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测 Figure 2　Detection of PCR products by 1% agarose gel electrophoresis 注：M：DNA marker 2000; 1-12：12个PCR产物. Note: M: molecular weight marker 2000; 1-12: twelve PCR products.

图选项

为进一步分析鉴定该病毒，从GenBank下载不同基因型人腺病毒基因组DNA序列，采用邻位相连法(Neighbor-joining)构建系统发育进化树，通过自举分析(Bootstrap)进行置信度检测，自举数据集为1 000次。结果如图 3所示，本研究中获取的腺病毒基因组DNA与已报道的55型腺病毒处于同一分支上，更进一步明确该病原体为55型腺病毒。

图 3　腺病毒基因组DNA系统发育进化树构建 Figure 3　Construction of phylogenetic tree based on human adenovirus genomic DNA 注：括号中的数字表示GenBank中序列号；树各分支上的数值为次自举检验得到的该分支的支持百分数；标尺表示5%的序列分歧度；O：本研究获取的序列. Note: Numbers in parentheses represent the sequences' accession number in GenBank. The number at each branch points is the percentage supported by bootstrap. Bar: 5% sequence divergence. O: the sequence obtained in this study.

图选项

杨朝辉在其2009年的硕士毕业论文中^[5]报道了2006年3-4月中国陕西岐山县腺病毒暴发毒株(QS-DLL株)的特点。当时认为此次暴发的病原体为HAdV-11a。然而QS-DLL分离株的核酸序列除了DNA多聚酶、pVI和pTP，与腺病毒14型的原型株(AY803294)有着最高的一致性( > 98.3%)。近几年，HAdV-55感染的疫情在我国时有发生，而且多发生在营区、学校等场所。

2014年1月Cao等^[2]发表了由我国北京多家单位联合进行的临床研究，结果显示，成人腺病毒肺炎流行有明显季节性，多在每年的2-3月份流感流行后期发生。HAdV-55肺炎患者较其他型别腺病毒肺炎患者年龄平均高约10岁，且其肺炎严重程度评分(PSI)高于其他型别腺病毒肺炎患者。提示腺病毒55型是成人社区获得性肺炎的重要病因之一。

张志强等^[8]回顾分析了2012年4-5月解放军总医院收治的11例成人55型腺病毒重症肺炎患者的临床诊治资料，发现55型腺病毒引起的成人重症肺炎临床症状较重，除高热、咳嗽等呼吸系统症状外，还伴发腹泻、精神症状等肺外表现。其中6例重症肺炎患者胸部CT以多肺叶受累的肺大片实变为主要特征，并可出现空洞、纵隔气肿、皮下积气等^[9]。2016年1月-2月，西藏拉萨驻地部队发生HAdV-55感染的疫情^[10]，这是55型腺病毒第一次在高原地区暴发大规模感染的疫情。

因此，不论是社区还是部队，55型腺病毒都已成为引起呼吸道感染的重要病原体之一，对我国暴发的腺病毒毒株进行基因组测序，有助于了解该病毒的进化特点和流行趋势，有助于对55型腺病毒的预防和控制。然而之前关于腺病毒基因组序列获取的研究中，其方法都比较复杂^{[5, 7]}。因此本研究通过分析55型腺病毒的基因组序列，在相对保守区域设计引物，采用12个基因片段PCR测序拼接的方法，结果表明本研究所采用的方法能够快速准确的获得腺病毒全基因序列，为今后55型腺病毒的研究提供参考。

另外近年来随着测序技术的不断发展，尤其是第三代测序技术，即高通量测序(Next generation sequencing，NGS，又叫“下一代测序”)，具有速度快、读长长、可直接测甲基化的DNA序列、不需要PCR扩增、无碱基偏好、通量高等优点，同时也存在准确率低、依赖酶活性等缺陷。由于分离培养得到的腺病毒是细胞产生CPE后释放的病毒颗粒，伴随病毒颗粒释放的还有细胞本身大量的DNA，第三代测序无法准确区分病原体DNA和细胞自身DNA。另外，在序列精度方面，二代测序优于三代。因此对于基因组不是特别庞大的腺病毒来说，利用分片段PCR扩增并测序的方法，优于第三代测序技术。但对于较大基因组的获取，如细菌、真菌基因组，以及新发未知病原体的快速鉴定，第三代测序技术具有非常明显的优势。