随着印染工业的发展，印染废水已成为当前主要的工业废水之一，总废水排放量排名第三^[1]。在印染过程中约有10%-15%的染料随废水排入环境^[2]，每年约有7.56-15.12万t染料随废水直接进入水体环境^[3]，从而对环境造成了巨大的污染。染料废水具有色度深、有机污染物含量高、成分复杂、生物毒性大、难生物降解、盐度高等特点。所有染料中，偶氮染料占染料总量的80%左右^[4]，其降解产物-苯胺类化合物具有致畸、致癌、致突变性^[5-6]，已成为威胁我国水环境安全的重要因素之一^[7]。因此，偶氮染料废水处理的研究备受关注。

目前国内外处理印染废水的技术主要有物理法、化学法、生物法。在长期的实际应用中虽然物理、化学处理法的脱色率高，但COD去除率较低，且处理费用较高，处理不当还会产生二次污染^[8]。与物理、化学处理相比，生物处理法因具有成本低、操作简单、不会产生二次污染等优点被广泛采用^[9]。印染废水的显著特点是含盐量较高，为了提高印染效率加入无机盐(NaNO₃、Na₂SO₄、NaCl和NaOH等)^[10]和为了调整染料pH添加NaOH导致盐度升高^[11]。因此，染料废水属于典型的高盐工业废水，是公认的最难处理的高浓度有机废水之一。然而，非嗜盐微生物很难在高盐环境下发挥其降解作用，利用中度嗜盐菌来降解高盐度的印染废水就显得尤为重要。目前，关于嗜盐菌脱色偶氮染料的研究很多^[12]，大部分都是关于嗜盐菌的分离及脱色特性研究^[13]。菌群中细菌的协同作用使得微生物菌群的适应性更强，便于规模化应用。但是，目前关于嗜盐菌群脱色偶氮染料的研究较少^[14]。因此，富集能够在高盐环境下脱色偶氮染料的嗜盐菌群具有很高的应用价值和前景。

基于此，本实验以偶氮染料酸性大红GR为底物，富集了在5%盐度下对其高效脱色的中度嗜盐菌群，并对其脱色条件及性能进行研究，为印染废水的生物强化处理提供菌种及实验依据。

1 材料与方法 1.1 主要仪器、试剂、培养基和菌群

全温振荡培养箱(HZQ-F160型)，常州杰博森仪器有限公司；立式压力灭菌锅(LDZX-50KBS)，上海申安医疗器械厂；紫外可见分光光度计(SHIMAZUUV-2550)，日本岛津公司；TGL-20B高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂；MiSeq平台，美国Illumina公司。土壤DNA提取试剂盒，Mobio公司。

5%无机盐培养基(g/L)：Na₂SO₄ 0.5；NH₄Cl 0.3；CaCl₂ 0.1；KH₂PO₄ 0.2；KCl 0.5；MgCl₂·6H₂O 6.0；NaCl 40.0，酵母粉0.5，pH 7.0，1×10⁵ Pa灭菌30 min。

模拟印染废水：5%的无机盐培养基中加入酸性大红GR。

中度嗜盐菌群：将10 mL江苏某印染厂的活性污泥接入90 mL 5%的无机盐培养基锥形瓶中(酸性大红GR浓度为100 mg/L)，30 ℃、150 r/min振荡培养，待脱色率达到80%以上，取10%的浊液接种到新鲜的5%无机盐培养基中(酸性大红GR浓度为100 mg/L)。如此循环8代，富集培养结束。

1.2 菌群组成分析

采用Fast DNA Spin Kit提取试剂盒提取微生物基因组DNA。采用高通量测序的方法获得微生物的16S rRNA基因序列，在Illumina MiSeq PE250高通量测序仪上测序(上海美吉生物医药科技有限公司)。测序引物分别为515F (5′-GTGCCAGCMGC CGCGG-3′)和907R (5′-CCGTCAATTCMTTTRAGT TT-3′)。20 µL PCR反应体系：rTaq酶0.2 µL，10×PCR buffer 2.0 µL，20.5 mmol/L dNTPs 2 µL，5 µmol/L引物515F和907R各0.8 µL，25 mg/L模板DNA 10 ng，无菌ddH₂O补足至20 µL。PCR反应条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃ 10 min。对所有序列进行筛选和拼接后根据16s rRNA基因序列之间的相似度以97%作为域值将有效序列分成操作分类单元(Operational taxonomic unit，OTU)，并确定每个OTU的代表序列。将代表性序列与RDP classifier数据库(http://rdp.cme.msu.edu/misc/resources.jsp)和Silva数据库(http://www.arb-silva.de/)中的已知数据进行比对和物种注释，并在门、纲、目、科、属、种水平统计群落结构。

1.3 菌群脱色酸性大红GR的不同影响因素

为了研究中度嗜盐菌群对酸性大红GR的脱色效果，将菌群置于含酸性大红GR的5%盐度的培养基中，30 ℃静置培养，12 h后4 000 r/min离心5 min收集菌体，用5%无机盐培养基洗涤菌体2次，菌体悬浮于5%无机盐培养基中，摇匀后取1 mL菌液加入到不同盐度、pH、温度和酸性大红GR浓度的新鲜5%盐度培养基中(染料浓度为100 mg/L)。

连续脱色测试：以10% (体积比)接入到含有90 mL酸性大红GR染料(100 mg/L)-5%盐度培养基的250 mL培养瓶中，30 ℃静置培养15 h后测定脱色率。同时取出菌体，转接于新的含有90 mL酸性大红GR染料(100 mg/L)-5%盐度的培养基中，继续脱色15 h，重复5次。实验设3次重复。

1.4 酸性大红GR浓度的测定及脱色率的计算

将活化后的菌群接种到新鲜的5%盐度的培养基中，每隔4 h从含染料的培养基中取出2 mL脱色液，10 000 r/min离心5 min，以未加染料的培养基作为空白，在510 nm波长处测定其吸光度。根据公式(1)计算脱色率：

(1)

A₀为初始时刻染料的吸光度；A_t为t时刻染料的吸光度。

1.5 菌株脱色染料广谱性研究

取1 ml 1.3中的重悬菌液加入到含有不同偶氮染料(100 mg/L)的5%无机盐培养基中，实验底物包括直接耐黑G、分散艳兰S-3BG和活性艳红X-3B。15 h后取2 mL脱色液10 000 r/min离心5 min，以未加染料的培养基作为空白，分别测定0和15 h染料的吸光度，直接耐黑G、分散艳兰S-3BG和活性艳红X-3B的检测波长分别为646、590和539 nm。按照公式(1)计算脱色率。实验设3次重复。

2 结果与讨论 2.1 菌群的富集

经过8次富集获得了一个能够在高盐环境下脱色酸性大红GR的中度嗜盐菌群。如图 1所示，该菌群能在15 h内将100 mg/L的酸性大红GR几乎完全脱色(98.2%)。该菌群脱色效率高，因此具有较高的应用潜力。研究了静置和摇动培养条件下中度嗜盐菌群对酸性大红GR脱色的影响，结果表明，15 h后静置培养的脱色率(98.2%)显著高于好氧状态(75.3%)下的脱色率，这与谢学辉等^[15]的研究结果相同。氧气抑制了微生物偶氮还原酶的活性，这可能是因为氧气比染料更容易成为电子受体^[16]。从运行成本和脱色效率的角度考虑，后续实验采用静置的方法研究其它参数或影响因素对脱色的影响。

2.2 中度嗜盐菌群的群落结构

高通量测序的结果表明(图 2)，该菌群主要由Halomonas、Salinicoccus、Nitratireductor、Aequorivita、Marinobacter、Exiguobacterium和Microbacterium等组成。其中Halomonas、Salinicoccus、Nitratireductor和Aequorivita是主要的菌属，分别占全部序列的58.4%、8.2%、7.8%和6.0%。Halomonas属是Halomonadaceae，代表嗜盐微生物，很多研究发现其可以在高盐环境下降解碳氢化合物^[17]。Halomonas也是本课题组前期富集的一个能在10%盐度下脱色酸性大红GR的嗜盐菌群的主要菌属，占全部序列的98.8%^[18]。Halomonas可在高盐环境下脱色偶氮染料^[19-20]。本研究富集的中度嗜盐菌群中Halomonas占全部序列的58.4%，是脱色酸性大红GR主要菌属。目前该菌已经被分离纯化，相关工作正在进行中。Salinicoccus属于中度嗜盐菌，本课题组前期富集的脱色酸性大红GR菌群中也发现了该菌^[18]。Nitratireductor是催化硝酸盐还原为亚硝酸盐但不能还原亚硝酸盐为氮气的细菌。到目前为止，Nitratireductor共有8种，大部分是从海洋中分离纯化的^[21]，还没有关于该菌脱色偶氮染料的报道，本研究首次发现Nitratireductor参与偶氮染料的脱色，其可能是参与酸性大红GR中N的降解。Aequorivita属于Flavobacteriaceae，大部分从海洋中分离得到，在降解复杂有机物中起重要作用^[22]，但是还没有其脱色染料的报道。因此，本实验富集的脱色酸性大红GR的嗜盐菌群中，Halomonas是脱色酸性大红GR的主要菌属。

2.3 盐度对中度嗜盐菌群脱色的影响

印染过程中为提高印染效率加入大量的无机盐，导致印染废水的含盐量都很高。高盐使细菌细胞脱水，导致细菌降低或丧失脱色染料能力。高盐环境下，普通的微生物处理印染废水的效率降低^[23]。相反，嗜盐微生物可以在高盐环境下发挥作用。在5%盐度下富集的嗜盐菌群，在1%和5%的盐度下，15 h的脱色率几乎都达到100%；在10%和15%盐度下，15 h的脱色率为56.5%和15.1% (图 1)；在20%盐度下，几乎完全抑制了菌群的脱色(结果没有显示)。盐度过高会使微生物质壁分离，抑制细菌的活性，使微生物的脱色效率下降^[23]。本课题组前期用10%的LB培养基富集的微生物菌群在5%的盐度下，12 h的脱色率就达到98.5%，可能是培养基的营养丰富，提高了菌群的脱色能力^[18]。目前，一些脱色偶氮染料的嗜盐菌或耐盐菌已经被分离出来^[24]，它们在高盐环境下显示出较好的脱色效果(5%-15%)，但是盐度过高会抑制微生物的脱色效果，可能是盐度影响了偶氮还原酶的活性^[25]。本文所富集的菌群在盐度1%-10%范围内脱色率均可达50%以上，因此该菌群具有在高盐环境下对染料脱色的能力。

印染过程中添加大量的NaNO₃和Na₂SO₄会影响微生物对染料的脱色效果。因此，研究盐度对微生物脱色的影响有很重要的意义。NaNO₃和Na₂SO₄抑制了嗜盐微生物对酸性大红GR的脱色(图 3)。在Na₂SO₄浓度为1%和2%时，15 h内脱色率均可达100%和88.9%。但随Na₂SO₄浓度的增加，其脱色率降低。在Na₂SO₄浓度为4%时，15 h的脱色率仅为56.2%，而8%的Na₂SO₄则严重抑制了菌群的脱色。实验结果表明，当NaNO₃浓度为0.05‰时，在15 h的脱色率可达99.1%；当NaNO₃浓度为0.20‰时，在15 h时的脱色率仅为39.7%；0.40‰的NaNO₃严重抑制了菌群的脱色效果，浓度越高抑制作用越强。随着NaNO₃浓度的增加，脱色率逐步降低，说明NaNO₃抑制了嗜盐微生物的生长，从而抑制了其对酸性大红GR的脱色。Meng等研究发现，高浓度的NaNO₃ (0.26‰)、Na₂SO₄ (8%)严重抑制微生物脱色的速率^[23]。Liu等也发现无机盐抑制微生物的脱色，其中NaNO₃的抑制作用最强^[26]，与本研究的结果相同。除去盐度对微生物的影响，硝酸盐的氧化还原电位(+360 mV)高于硫酸盐的氧化还原电位(-516 mV)和染料，使硝酸盐更容易成为微生物的电子受体，抑制微生物的对染料的脱色效果^[26]。虽然盐度会抑制菌群脱色，但结果表明，本实验富集的中度嗜盐菌群在NaNO₃和Na₂SO₄环境下均能对酸性大红GR有明显的脱色作用。

2.4 pH和温度对脱色的影响

微生物在最适pH才能更好地发挥脱色作用，pH变化会抑制微生物的生长，尤其会抑制酶活性。研究了不同初始pH对嗜盐菌群对酸性大红GR的影响，从图 4A可以看出，嗜盐菌群对pH适应范围较广，更适合偏碱性环境。当pH值为7.0、8.0和9.0时，酸性大红的脱色率分别为99.8%、100.1%和88.2%。在pH 5.0和6.0的过酸环境下，染料脱色率只有19.1%和24.1%，说明菌株的生长受到抑制，从而影响其脱色效果。当pH 10.0时，15 h的脱色率只有63.2%。很多印染废水的pH偏碱性，有些印染废水pH高达10.0，主要是因为印染过程中会添加NaOH等。惠丰立等也富集了能在pH 5.0-10.0的印染废水中高效脱色的菌群^[27]。该菌群在偏碱性环境下有很好的脱色能力，其中在pH 7.0和8.0时脱色率最高，所以，该菌群在偏碱性印染废水处理中具有很大的应用潜力。

温度对中度嗜盐菌脱色酸性大红GR的结果表明(图 4B)，在10-37 ℃范围内，脱色率随温度的升高而增大；在30 ℃时脱色率最大，达到98.2%。这和Tan等富集的能够脱色酸性大红GR的菌群的结果相同^[14]。在30-55 ℃范围内，随温度的升高脱色率逐渐降低，55 ℃时达到最低。

2.5 起始浓度对脱色的影响

染料起始浓度对中度嗜盐菌群脱色的影响如图 5所示。染料浓度越高，微生物脱色率越低。当初始染料浓度为400 mg/L时，菌群15 h的脱色率只有42.8%。染料初始浓度大于400 mg/L时，15 h的脱色率只有15.1% (结果没有显示)。项学敏等^[28]发现耐盐菌GTY有一定承受负荷限，当污染物浓度过高时，会延长微生物的脱色时间。高浓度的酸性大红GR具有毒性，且随着浓度升高毒性也曾大，抑制了菌群的生长和代谢活性，从而抑制了菌群的脱色效果。

2.6 菌群对不同染料的脱色

偶氮染料化学结构的多样性直接影响微生物对偶氮染料的脱色性能，偶氮染料分子偶氮键的数量及芳环上取代基影响生物脱色效果。研究了中度嗜盐菌对不同染料的脱色效果，如图 6所示。中度嗜盐菌在15 h内将100 mg/L的酸性大红GR几乎完全脱色，而直接耐黑G (87.3%)、分散深蓝S-3BG (20.2%)和活性艳红X-3B (15.2%)的脱色率逐渐降低。戴树桂等^[29]研究发现偶氮染料中促进基团和抑制基团的数量和种类也会影响脱色效果，而且两种基团的作用可以相互抵消。直接耐黑G比活性艳红X-3B的脱色效果好，可能是直接耐晒黑G促进基团的数量[5个氨基(-NH₂)和1个羟基(-OH)]大于抑制基团(2个磺酸基(-SO^3-)；分散深蓝S-3BG和活性艳红X-3B都只有1个偶氮键，但分散深蓝S-3BG还有2个抑制基团，活性艳红X-3B有2个抑制基团(-SO^3-)和1个促进基团(-OH)；研究以含有2个偶氮键的酸性大红GR为底物富集的中度嗜盐菌群，可能更容易脱色偶氮键多的偶氮染料，所以直接耐晒黑G的脱色率大于分散深蓝S-3BG和活性艳红X-3B。与纯菌相比，菌群的多样性使得菌群的适应性和底物范围都较高，因此，混合菌群更适合实际应用。

2.7 连续脱色能力测试

连续脱色能力好的微生物具有很大的应用潜力。中度嗜盐菌群处理100 mg/L的酸性大红GR在连续脱色5个循环后仍能达到98.2%的脱色率(结果没有显示)，显示该菌具有一定的连续脱色能力，对于该菌群的实际应用具有重要的意义。耐盐撕裂蜡孔菌在橙黄G连续脱色3个循环后只有50%的脱色率^[30]。本研究中发现在5个脱色周期中，其脱色率维持在98%左右。相对于其它微生物，该菌群具有很强的连续脱色能力，应用潜力巨大。

3 结论

采用富集的方法，从印染废水的活性污泥中富集了一个能够脱色偶氮染料——酸性大红GR的中度嗜盐菌群，该菌属主要由Halomonas、Salinicoccus、Nitratireductor和Aequorivita等4个菌属组成，可在1%-10%盐度范围内高效地脱色酸性大红GR，在100-400 mg/L的范围内都有较好的脱色效果，可以脱色直接耐黑G和分散深蓝S-3BG等偶氮染料。

该菌群的最佳脱色pH值为7.0，高浓度的NaCl、NaNO₃和Na₂SO₄对酸性大红GR有明显的抑制作用，连续脱色5次后，脱色率仍没有降低。