无论是在自然环境还是工业发酵中，微生物经常会遭遇一系列的逆境胁迫，其中高渗胁迫就是比较常见的一种。在利用微生物发酵生产目标代谢产物时，发酵体系中高浓度的底物/目标产物，以及中间代谢产物/副产物的积累都会形成高渗胁迫环境，高渗胁迫会影响细胞膜结构和胞质酶活性，严重阻碍菌株正常的生理功能和目标代谢产物的最大化积累^[1]。在长期的进化过程中，微生物发展出多样化的适应策略以减小由于渗透压的升高给菌株带来的损伤，其中主要包括离子迁移过程及相容性溶质的积累机制^[2]。相容性溶质是一些具有不带电荷、高度水溶性特点的糖类、醇类、氨基酸及其衍生物等小分子物质，该类物质在细胞内高浓度积累不会对生物大分子如蛋白质、核酸等的生理功能产生不利影响，因此常被用作细胞的渗透保护剂^{[1, 3-4]}。通常情况下，菌株可以通过自身生物合成或从外界环境中摄取相容性溶质如海藻糖、甜菜碱等来抵御高渗胁迫压力。Morbach等的研究指出，在发酵体系中添加甜菜碱能够促进谷氨酸棒杆菌的生长及底物糖的消耗^[5]，说明甜菜碱可以有效缓解高渗胁迫带给菌株的生存压力。此外，外源添加氨基酸有时也可以提高微生物抵御逆境胁迫的能力，文献报道在培养基中添加精氨酸和赖氨酸可以提高大肠杆菌和乳酸菌的耐酸能力，推测外源氨基酸进入胞内后可以消耗多余质子，还可以释放ATP以促进菌株逆境胁迫下的生长^[6]。需要指出的是，由于菌株所遭受的渗透胁迫程度、持续时间及环境中可利用物质的不同，会造成菌株积累不同的渗透保护剂以应对特定的胁迫压力。

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是一种兼性厌氧的革兰氏阳性菌，被广泛应用于氨基酸和维生素的生产^[7]。在发酵生产中，随着反应的进行，菌株会受到来自产物等的高渗胁迫而导致发酵过程效能低下。Gourdon等研究证实，在利用谷氨酸棒杆菌发酵生产谷氨酸的过程中，随着产物积累，底物糖的消耗速率和代谢能力均会出现下降，最终导致菌株生长缓慢及目标代谢物谷氨酸产率的显著下降^[8]。目前已有文献报道，谷氨酸棒杆菌在高渗胁迫短期刺激下会在胞内积累海藻糖、甜菜碱、脯氨酸等相容性溶质来抵御高渗胁迫^[9-11]。Fränzel等^[7]发现对谷氨酸棒杆菌高渗胁迫处理180 min之后，转录组和蛋白质组结果分析表明，相容性溶质相关的载体ProP和转运蛋白BetP均会出现显著上调。但是，谷氨酸棒杆菌在长期高渗胁迫下，主要利用何种相容性溶质及是否有其它氨基酸参与高渗胁迫应答过程仍不清楚。本文通过外源添加不同氨基酸和相容性溶质，对谷氨酸棒杆菌在长期高糖渗透胁迫下的生长进行了初步的探究，有利于进一步了解微生物耐受高糖渗透胁迫的生理机制，从而为微生物进行理性改造提升其胁迫耐受性提供一定的参考价值。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 菌株和引物: Corynebacterium glutamicum ATCC13032由本实验室保存，Corynebacterium glutamicum CICC10234、Corynebacterium glutamicum CICC20903、Corynebacterium pekinense CICC20971和Corynebacterium crenatum CICC20662均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)。实验所用引物详见表 1。

1.1.2 主要试剂和仪器: 各种相容性溶质和氨基酸，北京Solarbio公司；RNA提取试剂盒(RNAprep pure Cell/Bacteria Kit)，天根生物工程公司；反转录试剂盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)，Thermo公司；各种常用生化试剂均为国产分析纯。振荡培养箱，美国精骐有限公司；分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；荧光定量PCR仪，美国Applied Biosystems公司。

1.1.3 培养基: (1) LB培养基(g/L)：Tryptone 10.0，Yeast extract 5.0，NaCl 10.0。(2) LBHIS培养基(g/L)：Tryptone 5.0，Yeast extract 2.5，NaCl 5.0，D-sorbitol 91.0，Brain Hearth Infusion 18.5。(3) LBG培养基(g/L)：Tryptone 10.0，Yeast extract 5.0，NaCl 10.0，葡萄糖5.0。(4)种子培养基(g/L)：葡萄糖25.0，尿素8.0，玉米浆30.0，K₂HPO₄ 1.0，MgSO₄ 0.2，调节pH至7.0。(5)发酵培养基(g/L)：葡萄糖250.0，尿素4.0，玉米浆1.0，FeSO₄·7H₂O 2.3×10^-3，MnSO₄·7H₂O 2.3×10^-3，MgSO₄ 1.0，KH₂PO₄·7H₂O 2.0，VB₁0.2×10^-3，豆饼水解液5.0，CaCO₃ 2%，苯酚红指试剂0.4%，调节pH至7.0。(6) 50%的葡萄糖储液，1×10⁵ Pa灭菌15 min。(7)各种相容性溶质和氨基酸储液均过滤除菌备用。

1.2 不同高糖渗透胁迫对C. glutamicum生长的影响

将C. glutamicum接种于LBHIS培养基，32、200 r/min培养过夜进行活化；然后将菌种转接至含有不同浓度葡萄糖(10%-30%)及蔗糖(10%-35%)的LB试管培养基中，调整起始OD₆₀₀为0.1；32、200 r/min培养16 h后，利用分光光度计在600 nm波长条件下测量菌体吸光度值，作为衡量菌株生长能力的指标。实验重复3次，取平均值。

1.3 不同氨基酸和相容性溶质对高糖渗透胁迫下C. glutamicum生长的影响

在LB培养基中添加25%的葡萄糖及30%的蔗糖作为后续谷氨酸棒杆菌生长的高糖渗透条件，并根据实验需求在培养基中添加终浓度为10 mmol/L的各种氨基酸和相容性溶质。将过夜活化的菌种接种于4 mL试管培养基中，后续培养条件同1.2。

1.4 中心代谢途径相关酶基因的转录分析及葡萄糖利用率的测定

将C. glutamicum接种于LBHIS培养基中过夜活化，然后将菌种转接至含有100 mL高糖培养基(25%葡萄糖+LB)的250 mL三角瓶中，调整起始OD₆₀₀为0.1。实验组中添加终浓度为10 mmol/L的精氨酸，对照组不添加任何物质，32、200 r/min摇瓶培养。待菌体培养8 h和16 h后，4、8 000 r/min离心5 min收集菌体，然后将菌体置于液氮速冻，-80保存备用。参照RNA提取试剂盒说明方法提取对照组与实验组菌体RNA，并测定A₂₆₀/A₂₈₀值以评估RNA提取质量。参照反转录试剂盒说明方法进行反转录，获得cDNA后置于-20保存备用。选取磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)中在葡萄糖跨膜转运中发挥重要作用的基因酶IICB^Glc (ptsG)和酶I (ptsI)^[12]，糖酵解途径(EMP)中关键酶基因6-磷酸果糖激酶1 (pfkA)、丙酮酸激酶(pyk)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gap)，三羧酸循环(TCA)中的乌头酸水合酶(acn)、琥珀酸脱氢酶(sdhCD)和苹果酸脱氢酶(mdh)的基因，进行荧光定量PCR验证。PCR反应体系：2×SYBR Mix 10.0 μL，Primer F (10 μmol/L) 0.8 μL，Primer R (10μmol/L) 0.8 μL，cDNA template 2.0 μL，ddH₂O 6.4 μL。PCR反应条件：95 1 min；95 15 s，60 15 s，72 45 s，40个循环。采用16S rRNA基因作为内参基因，根据相对定量公式(2^-ΔΔC_T)计算目的基因在实验组和对照组中的相对mRNA表达差异，其中未处理对照样本的表达定义为1。

葡萄糖利用率的测定方法参照北京普利莱基因技术有限公司的葡萄糖氧化酶测定试剂盒(E1010)；对照组与实验组菌株培养8 h后8 000 r/min离心5 min，弃菌体保留上清培养基。培养基中残留的葡萄糖在葡萄糖氧化酶(GOD)的作用下生成葡萄糖酸和H₂O₂，然后用过氧化氢酶(POD)催化过氧化氢，使色原物质4-氨基安替比林生成醌亚胺，颜色的深浅与葡萄糖浓度成正比。

1.5 精氨酸对高葡萄糖胁迫下C. glutamicum发酵产氨基酸的影响

将保存的C. glutamicum菌种在LBHIS平板上划线，挑取菌落接种于种子培养基过夜活化。然后将菌种转接于50 mL含25%葡萄糖发酵培养基的500 mL三角瓶中，实验组添加终浓度为10 mmol/L的精氨酸，对照组不添加任何物质。调整起始OD₆₀₀为1.0，32、200 r/min摇瓶发酵培养。实时观察，当苯酚指示剂变为黄色时，添加无菌氨水调节pH为7.0。独立重复试验3次，利用HPLC测定发酵48 h后的发酵产物。

1.6 碱性氨基酸对高葡萄糖压力下棒状杆菌属生长的影响

将在LBHIS培养基中过夜活化的C. glutamicum和其它4种棒状杆菌接分别接种于4 mL的LBG以及含有25%葡萄糖的LB培养基中，外源添加终浓度为10 mmol/L的3种碱性氨基酸。调整起始OD₆₀₀为0.1，培养条件同1.2。

2 结果与分析 2.1 不同高糖渗透胁迫对C. glutamicum生长的影响

为更好地了解C. glutamicum 在不同高糖渗透胁迫下的生长，首先检测了不同浓度的葡萄糖和蔗糖对菌株生长的影响。结果如图 1所示，随着葡萄糖及蔗糖浓度的不断升高，对菌株生长造成的渗透胁迫也在不断增强。当葡萄糖和蔗糖浓度分别达到30%和35%时，菌株的生长已经受到严重抑制；培养16 h后，菌株未见明显的生长，说明高渗胁迫会阻碍细胞正常的生理代谢，严重影响细胞的生长。后期实验中选择终浓度为25%葡萄糖及30%蔗糖作为对C. glutamicum高渗胁迫的培养条件。

2.2 不同氨基酸和相容性溶质对高糖渗透胁迫下C. glutamicum生长的保护作用

积累相容性溶质是多数微生物在应对渗透胁迫时采用的主要应激策略之一^[13-15]。为探究在C. glutamicum长期高渗胁迫中何种物质具有生长补救效应，通过外源添加不同氨基酸和相容性溶质观察其对菌株生长的影响。如图 2所示，各种物质在不同糖类渗透胁迫中的保护作用存在一定差异。在由高浓度葡萄糖引起的渗透胁迫条件下(图 2A)，添加3种碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸和组氨酸)对菌株生长具有明显改善效应，其生物量分别增加54.7%、50.0%和37.6%。另外，谷氨酰胺也对菌株具有一定渗透保护效应，菌株生物量约提高15.0%，而相容性溶质如四氢嘧啶、海藻糖、甜菜碱及其它氨基酸并未表现出明显的渗透保护作用。在高蔗糖胁迫条件下(图 2B)，外源添加脯氨酸和四氢嘧啶使菌株生物量增加20%以上，而在3种碱性氨基酸及酪氨酸作用下菌株生物量也提高约15%，说明这6种物质在高蔗糖胁迫下对菌株具有一定的渗透保护作用。上述结果表明，在由不同糖类引起的渗透胁迫条件下，C. glutamicum能够选择性摄入或积累特定物质作为渗透保护剂。

2.3 精氨酸对高葡萄糖胁迫下C. glutamicum代谢的影响

在发酵工业中，葡萄糖是菌体生长和产物合成的主要碳源，由其引起的渗透胁迫也最为常见。在由高浓度葡萄糖引起的渗透胁迫条件下，外源添加碱性氨基酸可以有效地促进谷氨酸棒杆菌的生长。由图 3A可知，培养8 h后外源添加精氨酸的实验组较未添加任何物质的对照组具有明显的生长优势。为了进一步探究碱性氨基酸的可能作用机制，后续研究分析外源添加精氨酸对C. glutamicum的磷酸烯醇丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)、糖酵解途径(EMP)和三羧酸循环(TCA)中关键酶转录水平的影响。如图 3B所示，添加精氨酸培养8 h后，C. glutamicum的PTS系统、EMP途径和TCA循环中相关基因的表达量均出现了不同程度的上调，表明外源添加精氨酸可以使菌株中心代谢更加旺盛。当培养16 h后对照组与实验组菌株均处于生长稳定期，此时相较于对照组，实验组菌株PTS系统中ptsG和ptsI基因的表达水平未见明显上调，但是EMP途径和TCA循环中相关基因的表达量仍具有不同程度的增强。上述结果显示，进入稳定期后，虽然实验组菌株的葡萄糖摄入速率出现一定程度的降低，但是仍具有较强的中心碳代谢能力。另外，每OD₆₀₀菌体的葡萄糖平均利用率测定结果显示，在对数生长期实验组的葡萄糖平均利用率比对照组提高约2.5倍，两者的葡萄糖平均利用率分别为1.128±0.100 g/h和0.444±0.300 g/h，说明实验组菌株具有增强的胞内物质消耗和能量代谢水平。上述结果提示，外源添加碱性氨基酸后可能对菌株中心碳代谢流的分配产生了影响，使能量更多地流入EMP途径和TCA循环中，从而为菌株的生长提供了充足的能量和相关的前体物质。

2.4 精氨酸对高葡萄糖胁迫下C. glutamicum发酵产氨基酸的影响

上述实验中发现外源添加精氨酸可以有效缓解高浓度葡萄糖对C. glutamicum的渗透胁迫，并且菌株的葡萄糖转运及代谢途径中多个关键基因均出现表达上调。为进一步探究精氨酸在菌株发酵应用中的作用，研究了在高葡萄糖胁迫条件下外源添加精氨酸对菌株发酵生产氨基酸的影响。结果发现在高浓度底物的发酵培养基中，外源添加精氨酸对菌株的多种氨基酸发酵具有一定的促进作用(图 4)。相较于对照菌株，精氨酸添加菌株的单位菌体生物量(1 OD₆₀₀)所获得的谷氨酸产量由4.32 mg/L提高至9.83 mg/L，比最初产量增加了127.5%，同时甘氨酸、丙氨酸和缬氨酸的产量也分别增加了107.7%、89.3%和27.8%。推测由于精氨酸的添加能够促进菌株糖酵解过程，而且上调三羧酸循环中多个重要基因的表达，有助于增加糖酵解和三羧酸循环通量，最终实现谷氨酸产量的提高。

2.5 碱性氨基酸对棒状杆菌属高葡萄糖胁迫下生长的影响

为探究碱性氨基酸对其它棒状杆菌抵御高葡萄糖胁迫的影响，选择4种常见棒状杆菌，分别为C. glutamicum CICC10234、C. glutamicum CICC20903、C. pekinense CICC20971和C. crenatum CICC20662。测定了在正常与高葡萄糖胁迫条件下，外源添加3种碱性氨基酸对C. glutamicum ATCC13032及上述4种菌株生长的影响。从表 2可以看出，碱性氨基酸作为初级代谢产物，外源添加对于菌体的生长均有一定程度的促进作用；而在高葡萄糖胁迫下，3种碱性氨基酸的添加对几种棒状杆菌的生长具有更为显著的促进作用，精氨酸和赖氨酸均使5种菌株的生物量增加30%左右，尽管组氨酸的作用稍弱，菌株的生物量也增加约20%。表明碱性氨基酸一方面可以直接促进菌株的生长，另一方面对高葡萄糖胁迫条件下的菌株也具有一定的渗透保护效应。3种碱性氨基酸对高葡萄糖胁迫下棒状杆菌的渗透保护作用具有一定的普遍性。

3 结论与讨论

谷氨酸棒杆菌是发酵工业中重要的生产菌种，已经被用于多种氨基酸、核苷酸等高附加值化学品的生产。鉴于谷氨酸棒杆菌在发酵生产过程中经常遭遇各种渗透胁迫，本文探究了在高糖渗透胁迫环境下，外源添加不同氨基酸和相容性溶质对谷氨酸棒杆菌生长和发酵特性的影响，其中碱性氨基酸对于高葡萄糖胁迫下菌株的生长具有明显的促进作用。菌株葡萄糖利用率结果表明，外源添加精氨酸使谷氨酸棒杆菌葡萄糖利用速率提高约2.5倍，提示菌株具有增强的底物消耗和代谢能力，也有利于一定程度上降低胞外葡萄糖胁迫程度。此外，外源添加精氨酸在一定程度上能够促进谷氨酸棒杆菌发酵生产氨基酸的能力，如谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸及缬氨酸等。进一步研究发现，外源精氨酸的添加能够增强谷氨酸棒杆菌PTS系统、EMP途径及TCA循环中关键基因的表达水平，提示菌株的EMP途径和TCA循环中的重要节点具有一定柔性，能够更好地调节中心碳代谢流分布，使物质和能量更多地流入EMP途径和TCA循环中，从而为菌株提供更多的ATP能量和相关前体物质，以满足胁迫环境下的生长代谢需求^[16]。需要指出的是，精氨酸的补救效应未在所有的高渗透胁迫条件下得到证实，如高盐胁迫(数据未显示)。鉴于微生物响应环境胁迫的应答过程是全细胞参与的复杂过程，单一因素的作用机制也需要进一步的分析。先前的研究报道表明，精氨酸也具有缓解酵母细胞冷冻胁迫损伤的作用^[17]。胞外模拟实验也揭示，精氨酸盐能够促进蛋白的组装过程并提高蛋白的结构稳定性^[18]。上述发现均提示，精氨酸可能通过多种途径共同参与胁迫环境下的补救效应。因此，对精氨酸等碱性氨基酸在高葡萄糖胁迫下改善棒状杆菌生长和发酵性能的潜在机理进一步探究，将有利于更好地揭示谷氨酸棒杆菌在环境渗透胁迫下的生理适应特性。