羽毛是家禽处理后剩余的废弃物，在全世界的范围内每年有数百万吨羽毛废弃物产生，而我国每年产生的废弃羽毛将近70万t^[1-2]，固体废弃物的管理问题成了家禽屠宰企业亟待解决的问题。然而羽毛废弃物是一种丰富的天然蛋白质资源，其粗蛋白含量高达85%-90%，还含有维生素B₁₂和一些未知的生长因子。羽毛蛋白中除赖氨酸、蛋氨酸的含量明显较低外，其它动物必需氨基酸的组成略高于鱼粉^[3]，这意味着利用羽毛蛋白质水解生产氨基酸作为食品添加剂或氨基酸液体肥具有潜在的经济效益。但禽类羽毛中的蛋白质主要由角质蛋白构成，角蛋白中含有较多的胱氨酸，他们之间形成大量的二硫键，再加上氢键和分子间作用力很难被普通蛋白酶(如胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等)水解^[4]。利用高温高压蒸煮^[5]、酶解法^[6-7]、膨化^[8]、酸碱水解^[9]和利用氧化剂或者还原剂^[10]等传统方法加工处理废弃羽毛，存在氨基酸破坏严重、酶制剂成本高、能耗高、污染大等问题，而利用微生物对角蛋白进行降解可以提高水解产物的营养价值，降低能耗、成本以及对环境的污染问题，是一种环境友好型的废弃物资源化利用方式。

自然界中有多种微生物可以降解羽毛角蛋白，迄今为止已发现30多种，主要包括细菌类的芽孢杆菌属^[11-12]、真菌类的曲霉属^[13]和放线菌的链霉菌属^[14]，但由于生物安全性问题限制了其应用。解淀粉芽孢杆菌3-2是本实验室筛选的一株具有高角蛋白酶活的生物安全菌株，同时能分泌多种活性物质。

本研究利用解淀粉芽孢杆菌3-2液体发酵纯羽毛，通过单因素实验探究不同温度、发酵时间、羽毛含量、单一碳源、复合碳氮源、金属离子等对废弃羽毛降解效果以及发酵液中氨基酸种类和含量的影响，以期提高羽毛降解率及氨基酸产量，为后续生产新型复合氨基酸肥料提供技术支持。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 实验材料: 羽毛来自广东省广州市华南农业大学三角市菜市场，经彻底清洗，烘干粉碎，过1 mm孔径筛备用。

麸皮、玉米粉、豆粕、豆饼均来自广东省肇庆市某饲料加工厂。

1.1.2 主要试剂和仪器: 培养基所用的试剂以及各类碳源均购自广东环凯生物科技有限公司。L-8900全自动氨基酸分析仪，日立高新技术公司；HZQ-X300C恒温振荡器，上海一恒科学仪器有限公司。

1.1.3 培养基: 种子培养基采用NA培养基^[15]。发酵培养基(g/L)：羽毛0.5，NaH₂PO₄ 0.4，Na₂HPO₄ 0.3，0.105 MPa灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 酸解氨基酸含量测定: 按含氨基酸水溶肥料农业行业标准(NY1429-2007)中的方法测定，使用L-8900全自动氨基酸分析仪进行测定。

1.2.2 水溶性游离氨基酸测定: 取5 ml原液至10 mL比色管中，加ddH₂O定容至10 mL，静置过夜。取2 mL上清液至10 mL离心管中，加入2 mL磺基水杨酸，混匀，静置1 h使蛋白沉淀。加入1 mL EDTA和1 mL盐酸后4 ℃、6 000×g离心15 min (或用0.22 μm微孔滤膜过滤)。取上清液1 mL至培养皿中，蒸干。加入1 mL 20 mmol/L HCl溶液，用0.22 μm微孔滤膜过滤。至少取500 μL至进样瓶。上机测定。

1.2.3 羽毛降解率的测定: 发酵液经过滤，105℃烘干至恒重，计算降解率。

羽毛降解率(%)=(对照样品干重-实验样品干重)/对照样品干重×100。

1.2.4 氨基酸产率的计算: 氨基酸产率(%)=

1.2.5 活菌数测定: 采用稀释涂布平板法。

1.2.6 工艺流程: 市场收集羽毛→洗净→0.4 MPa蒸煮30 min→烘干→粉碎→过筛→取样→加无机盐溶液→加5%种子液→恒温、200 r/min摇床发酵96 h→结果测定。

1.2.7 温度对羽毛发酵效果的影响: 发酵培养基含有1%羽毛，初始pH 7.0，接种量5%，100 mL/250 mL，200 r/min，发酵96 h。分别于25、30、37、42 ℃设置4个实验组，每个实验组设5个平行样，每隔24 h取样测定降解率。

1.2.8 外加碳源对羽毛发酵效果及产物的影响: 为探明碳源对菌株3-2发酵羽毛效果及产物的影响，在发酵培养基含有1%羽毛的基础上，分别添加1%的葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉5种碳源，调节pH 7.0，接种量5%，100 mL/250 mL，37 ℃，200 r/min发酵96 h后测定其降解率及氨基酸含量，以不添加外加碳源作为空白组。

1.2.9 复合碳氮源对羽毛发酵效果及产物的影响: 为研究复合碳源对菌株3-2发酵羽毛效果及产物的影响，在发酵培养基含有1%羽毛的基础上，分别添加1%的麸皮、玉米粉、豆粕粉、豆饼粉4种复合碳源，调节pH 7.0，接种量5%，100 mL/250 mL，37℃，200 r/min发酵96 h后测定其降解率及氨基酸含量，以不添加复合碳源作为空白组。

1.2.10 金属离子对羽毛发酵效果及产物的影响: 参考文献[16]，选取对羽毛发酵可能有促进作用的MgCl₂、CaCl₂、ZnCl₂，分别向发酵培养基中添加0.01%，调节pH 7.0，接种量5%，37 ℃，100 mL/250 mL，200 r/min，发酵96 h后测定其降解率及氨基酸含量，以不添加金属离子作为空白组。

1.2.11 羽毛底物含量对羽毛发酵效果及产物的影响: 发酵培养基中分别添加0.5%、1.0%、2.0%、5.0%、10.0%、15.0%、20.0%的纯羽毛，初始pH 7.0，接种量5%，100 mL/250 mL，37 ℃，200 r/min发酵96 h后测定其降解率及氨基酸含量。

1.2.12 时间对羽毛发酵效果及产物的影响: 考虑羽毛降解生成氨基酸与氨基酸分解消耗是一个动态过程，为探明其中的关系，在发酵培养基含有10%羽毛的基础上，添加1%的乳糖，调节pH 7.0，接种量5%，100 mL/250 mL，37 ℃，200 r/min，发酵时间分别为36、48、60、72、84、96、108、120、132 h，测定其降解率及氨基酸含量。

1.2.13 数据处理: 数据处理采用SPSS和origin 8.5完成。

2 结果与讨论 2.1 羽毛常规理化性质

羽毛的常规理化指标测定结果如表 1所示。

2.2 羽毛中游离氨基酸及酸水解氨基酸含量

为了给后续复合氨基酸肥料提供技术支持，测定了羽毛中游离氨基酸和酸水解氨基酸含量。测定结果如图 1所示，羽毛的氨基酸含量达到80%以上，并且氨基酸的种类齐全，作为复合氨基酸肥料的发酵原料有很大的应用潜力。同时，羽毛中游离的氨基酸含量为0 (文中未展示)，说明简单的粉碎无法释放羽毛中的氨基酸，需要进行其他工艺，如微生物发酵来释放氨基酸。

2.3 温度对羽毛发酵效果的影响

温度是影响微生物生长及分泌代谢产物的重要影响因素。本研究探讨了不同温度和时间下，角蛋白降解菌3-2对羽毛降解率及氨基酸含量的影响，结果见图 2。发酵24 h后4个温度梯度下的羽毛降解率都很低；随着发酵时间的增加，4个温度梯度下的降解率快速增加，其中42℃和37℃两个温度的增幅最大；继续随着发酵时间的增加，42℃条件下的降解率基本不再变化，而25、30、37 ℃依旧缓慢增加；在96 h后降解率趋于平稳，以37℃条件下降解率最高，为80.19%。分析原因可能是37 ℃是该菌体的最适生长温度，有利于产角蛋白酶，从而分解羽毛^[17]。温度过高或过低均不利于微生物的生长和角蛋白酶的产生，特别是低温^[16]。据相关研究报道，解淀粉芽孢杆菌的发酵温度一般控制在25-42℃之间，极少数嗜热类微生物的发酵温度控制在70℃左右^[18-19]。

2.4 外加碳源对羽毛发酵效果及产物的影响

羽毛含碳量很低，添加外加碳源作为补充营养物质能促进菌体的快速生长，也可能替代部分氨基酸，减少菌体对氨基酸的消耗。实验考察了葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉5种外加碳源对羽毛发酵的影响，其实验结果如图 3和表 2所示。由图 3可知，葡萄糖、淀粉、蔗糖、麦芽糖对羽毛发酵有抑制作用，尤其以葡萄糖的抑制作用最为明显(后测定添加葡萄糖的发酵液中活菌数明显高于不添加外加碳源的羽毛发酵液中数目)，乳糖对羽毛发酵有略微的促进作用。相关研究表明^[20]，外加碳源能促进细菌生长，对产酶影响不大，但某些碳源，特别是较高的浓度对产酶有明显的抑制^[21]，本实验结果与其相吻合。由表 2可知乳糖、蔗糖、麦芽糖对于氨基酸的生产和积累有促进作用，以乳糖的效果最为显著。其原因可能是对于解淀粉芽孢杆菌3-2而言，乳糖优先于氨基酸被作为碳源利用。

2.5 复合碳氮源对羽毛发酵及产物的影响

为探明复合碳氮源对羽毛发酵及产物的影响，在含有1%的羽毛发酵培养基中，分别添加1%的麸皮、玉米粉、豆粕粉和豆饼粉4种复合碳源，37 ℃接种量5%，100 mL/250 mL，200 r/min，发酵96 h，然后测定有效活菌数和氨基酸含量(因为复合碳源的添加导致羽毛降解率无法测定，所以用有效活菌数作为辅助指标)。由图 4和表 3可知，麸皮、玉米粉、豆粕粉、豆饼均对菌株的生长有促进作用，尤其是麸皮和玉米的促进效果明显，但这两种复合碳氮源对于氨基酸的生成和积累有抑制作用，而豆粕和豆饼有促进作用。这表明外加复合碳氮源只促进菌体细胞生长，对产酶没有效果，甚至还有一定的抑制作用，这与刘晓迪等的研究结果一致^[22]。分析原因可能是外加碳氮源营养丰富，有利于菌体的生长，但菌体所产生的角蛋白酶属于诱导酶^[23]，存在其他更容易利用的外加营养物质时，菌体会优先利用外加复合碳氮源，而不会产生角蛋白酶去分解利用羽毛。由表 3可知，添加豆粕和豆饼中的发酵液中氨基酸积累量高于纯羽毛发酵液中积累量，分析原因可能是角蛋白酶的底物比较广泛，能分解利用豆粕和豆饼中蛋白质，从而造成氨基酸的少量积累^[24-25]。

2.6 金属离子对羽毛发酵效果及产物的影响

研究表明，金属离子对细菌的生长有促进作用^[26-27]，特别是Ca²⁺、Mg²⁺和Zn²⁺。在含有1%的羽毛发酵培养基中，分别添加0.01%的MgCl₂、CaCl₂和ZnCl₂，37 ℃，接种量5%，100 mL/250 mL，200 r/min，发酵96 h，实验结果见表 4和表 5。结果可知，Ca²⁺、Mg²⁺和Zn²⁺对羽毛的降解有抑制作用，尤其是Zn²⁺具有强烈的抑制作用，而且3种金属离子对氨基酸的产生和积累也有抑制作用，这与傅伟的研究结果一致^[16]。

2.7 羽毛底物含量对羽毛发酵效果及产物的影响

羽毛作为解淀粉芽孢杆菌3-2生长的唯一碳源和氮源，也作为产物氨基酸的唯一转化来源，其含量对整个发酵过程至关重要。实验设置了7个不同羽毛底物含量，结果如图 5和表 6所示。从图 5可知，在一定的范围内增加羽毛含量，相当于增加营养物浓度，使细菌生长增加，有利于羽毛的降解。当羽毛含量达到1%时，羽毛降解率最高，达到81.92%。随着羽毛含量的增加，羽毛降解率呈下降趋势，当羽毛添加量为20%时，降解率只有45.32%。分析原因可能是底物浓度过高会影响料液比，使发酵液变得粘稠影响了溶氧，从而不利于菌体生长。从表 6可知，氨基酸含量与羽毛降解率有相反的变化趋势，随着羽毛含量的增加，发酵液中氨基酸含量呈上升趋势，当羽毛添加量为20%时，发酵液中氨基酸含量达到1.808%。分析其原因可能是，虽然羽毛降解率降低，但是菌体生长和代谢消耗的氨基酸增多，导致羽毛降解的总量增大，并且其增大的幅度大于氨基酸消耗的幅度，所以发酵液中氨基酸含量增高。考虑后续大规模工业生产的需求，需综合考虑氨基酸含量和羽毛降解率这两个指标，本实验拟采用氨基酸产率为评价指标。通过计算可知，当羽毛含量为10%时，氨基酸产率最高，为22.32%。

2.8 时间对羽毛发酵效果及产物的影响

时间是影响细菌生长、分泌角蛋白酶、羽毛降解及氨基酸消耗的重要因素，尤其产物氨基酸的积累是由羽毛降解产生氨基酸和细菌生长消耗氨基酸综合影响的动态指标，因此选取一个最佳的发酵终点时间尤为重要。综合以上优化的最佳发酵条件，分别发酵36、48、60、72、84、96、108、120、132 h，测定其降解率及氨基酸含量。由图 6和表 7可知，羽毛降解率随时间一直在升高，在132 h达到最大值，为70.12%；降解速率最快是在48 h，然后降解速率开始放慢；当达到120 h时，降解速度趋于0。分析原因可能是发酵后期，代谢物积累引起环境改变，从而影响角蛋白酶活性，同时角蛋白酶产生自身水解(主要原因)^[28]。总氨基酸含量在0-108 h内随着时间一直在升高，在108 h达到最大值，为20.861 g/kg；然后随着时间的增加，总氨基酸含量呈下降趋势。分析原因可能是细菌先将羽毛角蛋白降解为可溶性的蛋白，再继续降解成短肽和氨基酸，最后氨基酸被细菌用于自身的生长代谢所消耗^[29]。在发酵后期羽毛降解产生氨基酸的速率低于细菌对氨基酸分解利用速率。

由表 7可知，各种氨基酸的变化趋势与总氨基酸的变化趋势并不相同，其单独氨基酸含量的最大值并不都在108 h。为此，对各种氨基酸含量与发酵时间的回归关系进行初步分析，建立的回归方程如表 8所示。利用回归方程，针对不同种类氨基酸，可求出最佳的发酵时间结束点。

3 结论

解淀粉芽孢杆菌3-2能产生高效角蛋白水解酶，利用解淀粉芽孢杆菌3-2降解废弃羽毛生产氨基酸复合肥料是一种可靠、环保、经济的方法，且获得氨基酸肥料营养齐全，利用高效角蛋白降解菌株来降解羽毛生产氨基酸产品，将是未来实现废弃羽毛资源化利用的一个重要方向。

通过单因素实验探究不同温度、发酵时间、羽毛含量、单一碳源、复合碳氮源、金属离子等对废弃羽毛降解效果以及发酵液中氨基酸种类和含量的影响，实验结果表明：废弃羽毛降解率与氨基酸总产量不呈正相关。随着发酵时间延长，羽毛降解率增加，当发酵温度为37℃、羽毛添加量为1%、以乳糖为外加碳源、添加Mg²⁺时，羽毛降解率最高，达到81.92%。随着羽毛添加量增加，氨基酸总含量也增加(在20%范围以内)，当发酵温度为37 ℃、降解时间为108 h、羽毛添加量为10%、乳糖添加量为0.5%、不添加复合碳氮源、不添加金属离子时，氨基酸的种类最全(富含17种氨基酸)，总含量最高，达到20.861 g/kg。

要提高废弃羽毛的降解率及氨基酸含量下阶段可从以下三方面入手：(1)对羽毛进行预处理，通过理化手段处理羽毛，使羽毛破碎，并尽可能破坏羽毛的β折叠及二硫键，使菌株更容易降解羽毛；(2)从自然界中分离筛选出能够更高效降解且产酶量高的菌株(可考虑霉菌，用于羽毛的固体发酵)；(3)对已有的高效羽毛降解菌株进行基因改造，比如将角蛋白酶从诱导酶改造成组成酶、增强启动子、增加角蛋白酶基因拷贝数、阻断或减弱菌株对氨基酸的利用途径，用其它碳源代替氨基酸被菌株所利用。