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文章信息
- 刘玲玲, 王永林, 熊典广, 徐鑫, 田呈明, 梁英梅
- LIU Ling-Ling, WANG Yong-Lin, XIONG Dian-Guang, XU Xin, TIAN Cheng-Ming, LIANG Ying-Mei
- 杨树腐烂病菌(Cytospora chrysosperma)原生质体遗传转化体系的构建
- Genetic transformation system of Cytospora chrysosperma, the causal agent of poplar canker
- 微生物学通报, 2017, 44(10): 2487-2497
- Microbiology China, 2017, 44(10): 2487-2497
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.160962
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文章历史
- 收稿日期: 2016-12-28
- 接受日期: 2017-03-23
- 优先数字出版日期(www.cnki.net): 2017-05-09
2. 北京林业大学标本馆 北京 100083
2. Museum of Beijing Forestry University, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China
杨树腐烂病(Poplar canker)是我国杨树上的一种毁灭性病害,病死率可达70%[1],其病原菌除了零星报道有Leucocytospora nivea以外[2],主要以金黄壳囊孢菌[Cytospora chrysosperma (Pers.) Fr.]为主。发病初期常表现为枝条枯死,后期造成树木整株死亡,严重时导致整片杨树林的大量枯死,给绿化和造林工作带来了重大经济损失[3-4]。
杨树腐烂病菌是子囊菌门(Ascomycota)壳囊孢属(Cytospora)中的一种条件致病菌(Opportunistic plant pathogen),能在健康枝条内长期潜伏而不发病,直至树势衰弱时,病斑才开始扩展[5-6]。现有的防治措施主要以培育抗病品种、化学防治和生物防治为主,虽已取得一定的成功,但仍存在污染环境、产生诱导抗药性和存在生态安全隐患等问题[7-9]。在病原菌与寄主互作的过程中,病原菌也会进化产生强毒性的致病基因来克服外界不良环境。因此,从分子生物学角度阐释病原菌如何在识别、克服寄主的防御系统,如何在与寄主互作过程中进行信号传导以及调控相关基因的表达等成为研究病害形成的新焦点[10]。随着基因组测序技术的快速发展,遗传转化体系的建立为从基因水平解析杨树腐烂病菌的致病机理提供新方法,进而为针对靶标位点设计新农药提供理论基础。
CaC12/聚乙二醇(PEG)介导的原生质体转化技术是子囊菌中常用的一种基因功能研究方法。该方法通过细胞壁降解酶的作用酶解获得原生质体,在PEG的作用下将外源DNA整合到受体的基因组中筛选获得转化子[11]。自PEG转化法在构巢曲霉(Aspergillus nidulans)中建立以来[12],Yoder实验室通过改变稳渗液和细胞壁降解酶等酶解条件,在玉米小斑病菌(Cochliobolus heterostrophus)[13]和菜豆炭疽病菌(Colletotrichum lindemuthianum)[14]等多种病原真菌中建立PEG转化体系,并尝试使用amdS和hphB等标记基因筛选突变体,极大地推进了PEG转化体系在丝状病原真菌研究中的应用。
尽管PEG介导的遗传转化技术以其操作步骤简单、无需特殊设备等优点已成为丝状真菌中常用的遗传转化方法之一,但原生质体及转化效率仍是制约PEG遗传转化技术成功的关键[11]。如在大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)中,Dobinson于1995年首次建立了PEG遗传转化方法,但较低的转化效率(3-5个/μg DNA)制约了该方法的推广及应用[15];随后,研究者又尝试使用ATMT转化法[16-18]解决转化效率低的问题,但大丽轮枝菌(V. dahliae)中PEG转化效率低的问题一直未得到解决,直至2013年王永林等通过优化PEG转化法中酶和稳渗液等条件,极大地提高了转化效率(10-50个/μg DNA)[19],为阐释黄栌枯萎病菌微菌核形成过程中相关基因的调控奠定良好的技术基础[19-23]。
然而杨树腐烂病菌(C. chrysosperma)作为杨树的一种毁灭性病害,目前还未有针对其遗传转化体系方面的研究。同属于壳囊孢属(Cytospora)中的苹果腐烂病菌(Valsa mali) (无性型为Cytospora mali)由高静等已建立PEG转化体系,在Driselase和Lysing enzymes的作用下酶解获得原生质体,并通过PEG介导获得GFP转化子[24],为苹果腐烂病菌的基因功能研究开启了新篇章[25]。本研究初期曾尝试将苹果腐烂病菌中的转化体系应用到杨树腐烂病菌(C. chrysosperma)中,但实验结果并不理想,原生质体的释放量较低(103-104个/mL),重复多次均难以获得转化子。因此解决原生质体制备困难的难题成为建立杨树腐烂病菌遗传转化体系的关键。
本研究旨在通过筛选酶解条件解决原生质体制备困难的难题,建立一个基于杨树腐烂病菌(C. chrysosperma)的高效、稳定的遗传转化体系,为杨树腐烂病菌的分子生物学研究,特别是杨树腐烂病菌的基因功能研究提供技术支持。
1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 供试菌株和质粒: 转化受体金黄壳囊孢菌(C. chrysosperma)是本实验室采集、鉴定并保藏于中国林业微生物菌种保藏中心(保藏号为CFCC 89981)。含潮霉素B抗性基因(hph)的gGFP质粒购自Fungal Genetics Stock Center (Kansas City,KS,USA)。 1.1.2 主要试剂、培养基和仪器: Driselase、Lysing enzymes和Fluorescein diacetate,Sigma公司;蜗牛酶,Coolaber公司;潮霉素B,生工生物工程(上海)股份有限公司;the DIG High Prime DNA Labeling protocol和Detection Starter Kit Ⅰ protocol,德国Roche公司;STC溶液、40% PTC溶液及CM、PDA、YEPD和TB3液体(固体)培养基均参照李思蒙[26]的配方配制。Veriti®96孔快速热循环仪,Applied Biosystems公司;高速冷冻离心机,eppendorf公司;恒温振荡培养箱,北京博宇宝威实验设备公司;电热恒温培养箱,上海一恒科学仪器有限公司;荧光显微镜,德国Leica公司。
1.2 供试菌株对潮霉素B敏感性的测定将CFCC 89981菌株接到PDA平板上,在25黑暗培养4 d后,沿菌落边缘用打孔器(φ=5 mm)打取菌丝块,分别转接到潮霉素B浓度为0、5、10、15、20、25、30和35 mg/L的PDA培养基中,置于25 ℃培养箱中黑暗培养,每个处理5个重复。5 d后观察、测量并记录生长状况。
1.3 杨树腐烂病菌CFCC 89981原生质体的制备 1.3.1 杨树腐烂病菌CFCC 89981细胞壁酶解条件优化: 为了明确菌丝细胞壁降解酶体系,实验选取了4种稳渗液和3种酶配比。当酶量为20 g/L Driselase和8 g/L Lysing enzymes时,选用4种稳渗液分别为0.7 mol/L NaCl (溶于10 mmol/L NaH2PO4,用1 mol/L的Na2HPO4调pH值为5.5)、0.7 mol/L NaCl (溶于无菌水)、1.2 mol/L KCl (溶于10 mmol/L NaH2PO4,用1 mol/L的Na2HPO4调pH值为5.5)和1.2 mol/L KCl (溶于无菌水)对杨树腐烂病菌幼嫩菌丝进行酶解。在确定最优稳渗液后,分别用20 g/LDriselase+8 g/L Lysing enzymes、20 g/L Driselase+30 g/L蜗牛酶及20 g/LDriselase+ 8 g/L Lysing enzymes+30 g/L蜗牛酶3种酶组合对杨树腐烂病原菌CFCC 89981的菌丝进行酶解,每隔1 h统计一次原生质体的数量,每个处理重复3次,最终选择最优的酶配比和时间进行杨树腐烂病菌CFCC 89981原生质体的制备。 1.3.2 杨树腐烂病菌原生质体的制备: 挑取杨树腐烂病菌的分生孢子以无菌水制成分生孢子悬浮液加入100 mL的YEPD液体培养基中,25、150 r/min振荡培养2 d。单层22-25 μm孔隙的Miracloth过滤收集菌丝,用稳渗液冲洗培养48 h后收集的菌丝3-4次,收集至20 mL酶解液中,于30 ℃、70 r/min摇床中酶解。酶解4 h后,用双层Miracloth过滤酶解后的混合物,稳渗液洗涤3-4次,将原生质体滤液收集至离心管中。4 ℃、3 000 r/min离心10 min。弃上清,加入15 mL的稳渗液悬浮原生质体,4 ℃、3 000 r/min离心10 min。弃上清,加入少量的STC悬浮原生质体沉淀,镜检并用血球计数板计数,若浓度过高则继续加入适量的STC溶液,使原生质体的终浓度达到108个/mL,用于下一步实验操作。 1.4 原生质体再生 1.4.1 原生质体再生率的统计: 处理组在最优体系下酶解4 h后的原生质体悬浮液用稳渗剂稀释到104个/mL,取2 μL原生质体与TB3培养基混匀后倒板,25培养,对照组用无菌水稀释。待长出单菌落后,统计单菌落的个数,计算再生率。每个处理重复3次[27]。其中,NR:稳渗液稀释的原生质体的数目;NC:无菌水稀释的原生质体的数目;NT:原生质体的总数。
1.4.2 FDA染色: 为验证原生质体的活力,吸取200 μL的原生质体于2 mL的离心管中,向离心管中滴加2 μL浓度为5 g/L的FDA溶液,室温黑暗静置5 min。利用荧光显微镜观察原生质体的形态和荧光状况,若原生质体形状完好且镜检呈强绿色荧光即表示原生质体的活力高。 1.5 杨树腐烂病菌原生质体的转化与再生取250 μL上述STC溶液重悬的原生质体于50 mL离心管中,向其中加入4 μg gGFP DNA,轻弹混匀,室温静置20 min。加入1.2 mL 40%的PTC后,轻弹混匀,室温静置20 min。加入3 mL TB3液体培养基,翻转混匀,室温静置2 min;再加入5 mL TB3液体培养基,翻转混匀,室温静置2 min。将离心管倾斜60°放入摇床中固定,25 ℃、70 r/min培养14-20 h。
镜检观察原生质体的再生情况及荧光状况,向再生后的液体中加入40 mL潮霉素浓度为25 mg/L的TB3固体培养基,颠倒混匀,倒板,于25 ℃培养箱中黑暗培养。
1.6 杨树腐烂病菌转化子的获得待菌落从TB3固体培养基上长出后,用潮霉素浓度为30 mg/L的PDA培养基覆盖,于25 ℃黑暗培养箱中培养。待长出单菌落后挑取菌丝,在激光共聚焦显微镜SP-5下观察GFP的荧光表达状况。将发绿色荧光的单菌落转接到潮霉素浓度为30 mg/L的PDA平板上,于25 ℃黑暗培养。待其长出菌丝后,一份接到PDA冻存管中,于4 ℃保存,另一份转接到含潮霉素B抗性的PDA平板上,待进一步验证。
1.7 杨树腐烂病菌GFP转化子的鉴定 1.7.1 PCR: 随机选取5个GFP转化子,将其接到铺有玻璃纸的潮霉素浓度为30 mg/L的PDA平板上,将野生型菌株接到铺有玻璃纸的PDA平板上,置于25 ℃黑暗培养。待玻璃纸上长满菌丝后,取菌丝于1.5 mL的离心管中,液氮冷冻研磨,利用CTAB法提取DNA。利用表 1中的引物对其进行PCR检测,鉴定阳性转化子。PCR反应体系及条件参照李思蒙[26]。引物名称 Primer name | 引物序列 Primer sequence (5′→3′) |
hph-sec | GCGAAGAATCTCGTGCTTTC |
hph-for | GATGTTGGCGACCTCGTATT |
GFPfor | ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG |
GFPrev | TTACTTGTACAGCTCGTCCATG |
将单孢纯化后的GFP转化子转接到无潮霉素抗性的PDA培养基中,于25 ℃黑暗培养5 d后,沿菌落边缘用打孔器(φ=5 mm)打取菌丝块,并将其继续转接到无潮霉素抗性的PDA培养基中于25 ℃黑暗培养5 d,如此连续转接并于25 ℃黑暗培养5代后,再将其转接到含有潮霉素浓度为30 mg/L的PDA培养基中,25 ℃黑暗培养5 d,观察转化子是否仍对潮霉素保持抗性,并用荧光显微镜观察GFP基因是否表达。
2 结果与分析 2.1 杨树腐烂病菌CFCC 89981对潮霉素B敏感性的测定杨树腐烂病菌野生型菌株CFCC 89981在25 ℃暗培养5 d后,在不含潮霉素B抗性的PDA平板中,菌丝生长良好(图 1A),菌落平均直径达9 cm (包括菌碟直径,下同);但在含有潮霉素B抗性的PDA培养基中,菌丝生长均受到抑制(图 1B-H)。当潮霉素B的浓度为5 mg/L时菌落平均直径为3.12 cm (图 1B),当潮霉素B浓度为10 mg/L时菌落生长受到抑制,直径仅为0.73 cm (图 1C),浓度增加到15 mg/L时(图 1D)菌落停止生长。说明潮霉素B能够有效抑制杨树腐烂病菌野生型菌株的生长。后续转化实验中,初筛时所用的潮霉素B浓度为25 mg/L,覆盖时所用的潮霉素B浓度为30 mg/L。
2.2 稳渗液对杨树腐烂病菌CFCC 89981原生质体制备的影响相同的酶配比下,分别选用4种稳渗液对幼嫩菌丝进行了酶解。图 2结果显示:随着酶解时间的增加,4种稳渗液均利于原生质体的释放,但释放效果存在差异。其中,以pH 7.0的1.2 mol/L KCl和pH 5.5的0.7 mol/L NaCl的酶解效果较差,原生质体的释放量最多仅有8×107个/mL;其次为pH 7.0的0.7 mol/L NaCl,该条件下初期原生质体的释放量较低,6 h后释放量显著增多,达到1×108个/mL;最优的稳渗液为pH 5.5的1.2 mol/L KCl,酶解4 h原生质体的数量已达到1.2×108个/mL,6 h原生质体的释放量达到最大值1.8×108个/mL,明显高于其他3种稳渗液,满足后续实验中对原生质体数量的要求。因此后续实验中选用pH 5.5的1.2 mol/L KCl作为稳渗液是最优的。
2.3 酶对杨树腐烂病菌CFCC 89981原生质体制备的影响以pH 5.5的1.2 mol/L KCl作为稳渗液的前提下,选用3种酶配比对幼嫩菌丝进行酶解的结果(图 3)发现:随着酶解时间的增加,在3种酶配比中原生质体的释放量均增多。其中,20 g/L Driselase+ 30 g/L蜗牛酶的酶解效果较差,释放原生质体最多仅有8×107个/mL,其次为20 g/L Driselase+8 g/L Lysing enzymes+30 g/L蜗牛酶,酶解效果最好的配比是20 g/L Driselase+8 g/L Lysing enzymes,酶解4 h原生质体的释放量即达到1.2×108个/mL。持续测定发现随时间的推移,原生质体的释放量依然在增加,但为了节省实验时间,在后续实验中,以pH 5.5的1.2 mol/L KCl作为稳渗液,选用的酶配比为20 g/L Driselase+8 g/L Lysing enzymes,酶解时间为4 h。
2.4 原生质体的再生率及活力验证镜检观察发现原生质体的释放方式多为顶端释放(图 4B、C),也有侧位释放(图 4D、E),其直径为6.63-21.95 μm,平均直径为13.46 μm。
在最优体系下酶解4 h后,释放的原生质体的再生率为63.74%±9.73%,且利用FDA染色验证原生质体的活力时发现98%以上的原生质体均形状完好且呈现绿色荧光,表明在该体系下获得的原生质体具有很高的活性。
2.5 杨树腐烂病菌CFCC 89981 gGFP转化子的筛选在转化过程中当原生质体的浓度达到108个/mL时再生效果较好,且荧光显微镜镜检观察可发现原生质体再生后菌丝有明显的绿色荧光(图 5A)。依据覆盖后的PDA (潮霉素浓度为30 mg/L)平板上长出的单菌落的数量来计算转化效率,结果显示在加入质粒DNA为4 μg时,平均获得304个转化子,平均转化效率为76个/μg DNA。
原生质体在TB3液体培养基中再生16 h后,镜检观察到部分原生质体及其再生后的菌丝呈绿色荧光(图 5A)。经筛选后得到的转化子镜检观察菌丝呈绿色荧光(图 5B),表明gGFP DNA已导入杨树腐烂病菌的原生质体并表达。
2.6 杨树腐烂病菌CFCC 89981转化子的PCR鉴定随机挑取5个杨树腐烂病菌GFP转化子并提取DNA,以杨树腐烂病菌野生型菌株CFCC 89981的DNA作为阴性对照,以gGFP质粒DNA作为阳性对照,分别用潮霉素特异性引物(hph-sec/hph-for)和GFP特异性引物(GFPfor/GFPrev)扩增潮霉素片段和GFP片段。PCR结果(图 6)显示:杨树腐烂病菌的GFP转化子和gGFP质粒均扩增出目的条带,而野生型菌株作为阴性对照未扩增出目的条带。由PCR结果表明GFP基因和hph基因均已经整合到杨树腐烂病菌的基因组中。
2.7 杨树腐烂病菌CFCC 89981转化子的Southern blot鉴定用XhoⅠ内切酶对野生型菌株的DNA和GFP转化子菌株(G2、G8、G9、G11和G14)的DNA进行酶切,以GFP基因片段为探针,进行Southern blot验证。Southern blot结果(图 7)显示野生型菌株中无杂交信号,在gGFP质粒阳性对照和GFP转化子中均检测到GFP基因杂交信号,表明GFP基因已经成功整合到杨树腐烂病菌的基因组中。
2.8 杨树腐烂病菌CFCC 89981转化子的稳定性分析将经过PCR和Southern blot验证后的5个已单孢纯化的GFP转化子接到无潮霉素抗性的PDA培养基上,连续转接5代后,再转接到含有潮霉素浓度为30 mg/L的PDA培养基上培养,发现5个转化子均能正常表达GFP蛋白,无衰减现象,且保持对潮霉素B的抗性,表明已整合的GFP基因和hph基因并未丢失,能够在杨树腐烂病菌CFCC 89981中稳定遗传并表达。
3 结论与讨论PEG介导的原生质体遗传转化是目前基因功能研究的常用方法之一,已在多种真菌中实现应用。本研究探索了原生质体制备过程中稳渗液和酶配比等条件,确定最优酶解条件,并首次成功构建以GFP为指示基因、基于杨树腐烂病菌(C. chrysosperma)的PEG转化体系,且转化效率达到76个/μg DNA,为进一步开展杨树腐烂病菌的基因功能研究提供了技术支持。
与其他的遗传转化方法相比,PEG介导的遗传转化方法具有操作简单、周期短等优点,已成为丝状真菌中常用的基因功能研究技术之一,但高活力、高浓度的原生质体制备困难、转化效率低、产生高比例的瞬态转化菌株和多拷贝插入等缺点也同样制约了其在一些真菌中的应用[11]。其中,能否获得高活性、高浓度的原生质体是制约其转化效率的主要因素之一。
本研究在查阅苹果腐烂病菌(V. mali)[24]、栗疫病菌(Cryphonectria parasitic)[29]和杨树炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)[28]等多种病原真菌的PEG介导的遗传转化方法的基础上,通过改变酶的种类、配比、稳渗液等条件,酶解获得高质量的原生质体,并在此基础上建立了基于杨树腐烂病菌CFCC 89981的高效稳定的PEG介导的遗传转化体系。在苹果腐烂病菌中,以1.2 mol/L KCl为稳渗液,50 g/L Driselase和10 g/L Lysing enzymes共同酶解菌丝2 h,原生质体的释放量可达4×107个/mL;而栗疫病菌中则是选用1.2 mol/L MgSO4 (10 mmol/L sodium phosphate,pH 5.8)为稳渗液,在β-glucuronidase和NovoZym 234[29]或纤维素酶、溶菌酶和蜗牛酶[30]共同酶解菌丝2 h的情况下,获得高浓度的原生质体;杨树炭疽菌中仅以1%的Lysing enzyme在0.7 mol/L NaCl为稳渗液的条件下,酶解菌丝3.5 h获得108个/mL原生质体。相较其他3种而言,本实验中以pH 5.5 1.2 mol/L KCl为稳渗液,在20 g/L Driselase和8 g/L Lysing enzymes的共同作用下,酶解菌丝4 h原生质体的释放量即为108个/mL。实验中发现稳渗液的种类及pH、菌龄、酶的种类等均会影响原生质体的释放。
稳渗液的种类和pH会影响原生质体的释放量。与苹果腐烂病菌(V. mali)的PEG转化体系相比,本研究通过调整稳渗液的pH,极大地促进了杨树腐烂病菌(C. chrysosperma)原生质体的释放。与未调节pH的酶解液相比,将1.2 mol/L KCl的pH值调至5.5后,原生质体的释放量明显增多。此前,在粘细菌[31]、双孢蘑菇(Agaricus bisporus)[32]和长根鬼伞(Coprinus macrorhizus)[33]中均有通过调节稳渗液的pH促进酶活性的发挥进而提高原生质体释放量的研究报道,发现当pH接近最佳的酶化合物的需求时,酶解效果最佳。此外,稳渗液除了作为细胞壁降解酶的溶剂外,还在维持原生质体的内外压力和生理状况中起到重要作用[34]。
菌丝作为酶解材料,其幼嫩程度直接影响酶解获得的原生质体的数量及质量。幼嫩的菌丝更有利于酶解释放原生质体[35]。相同条件下,杨树腐烂病菌的孢子在YEPD培养基中振荡培养40-48 h,菌丝的细胞壁易被降解释放原生质体,而实验中孢子振荡培养时间过长或直接酶解菌龄较大的菌丝时,均会降低原生质体的释放量。张志光在探讨真菌原生质体制备技术时指出菌龄对原生质体释放的影响主要是由于细胞壁的成分和结构的变化引起的。随着菌龄的增加,细胞壁上会沉积色素等次生物质,增大酶解难度[34]。高静等在苹果腐烂病菌的研究中也发现菌丝老化会导致细胞壁加厚,酶解困难;而菌丝过于幼嫩会导致菌丝量不足或酶解得到的原生质体容易破碎,再生困难[24]。但最适酶解的菌丝年龄会随着转化受体种类的不同存在差异。如在大丽轮枝菌(V. dahliae)[19, 36]中,孢子振荡培养24 h最适宜酶解释放原生质体,而在三孢布拉氏霉菌(Blakeslea trispora)[37]中是60 h,凤尾菇(Pleurotus pulmonarius)[38]中则是48 h。
此外,原生质体的释放过程中,除稳渗液、菌龄外,酶的种类也会对其产生影响。本实验中相较Lysing enzymes和蜗牛酶,Driselase降解细胞壁的效率更高。然而在板栗疫病的转化中使用纤维素酶、溶菌酶和蜗牛酶酶解菌丝即可获得大量的原生质体[30]。杨树炭疽病菌中仅用Lysing enzymes酶解即可获得大量的原生质体[28]。不同真菌的细胞壁成分存在一定的差异,因此筛选其适用的细胞壁降解酶的种类也是制备原生质体的关键之一。
酶解过程中还发现,杨树腐烂病菌获得的原生质体直径为6.63-21.95 μm,直径差异较大,但FDA染色观察发现虽然原生质体直径差异较大,但均能保持完好形态且表现出较强绿色荧光,具有较高的活力。此外,葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)中酶解获得的原生质体直径为6.72-32.35 μm[39],链霉菌(Streptomyces clavuligerus)中原生质体的直径为1.02-5.40 μm[40],均存在类似的原生质体直径差异较大的现象。
综上所述,本研究在杨树腐烂病菌(C. chrysosperma)中首次成功建立了PEG介导原生质体的遗传转化体系,与苹果腐烂病菌(V. mali)相比,在增加原生质体产量的同时提高了转化效率,且该遗传体系的建立为研究杨树腐烂病菌的基因功能和致病机制提供了技术支持。
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