2017, Vol. 44扩展功能
文章信息
- 章美琴, 孙兵兵, 陈代杰, 蒋宇, 杨晟
- ZHANG Mei-Qin, SUN Bing-Bing, CHEN Dai-Jie, JIANG Yu, YANG Sheng
- 鲍曼不动杆菌遗传操作系统研究进展
- Genetic manipulation system of Acinetobacter baumannii
- 微生物学通报, 2017, 44(10): 2463-2469
- Microbiology China, 2017, 44(10): 2463-2469
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.160947
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文章历史
- 收稿日期: 2016-12-23
- 接受日期: 2017-02-10
- 优先数字出版日期(www.cnki.net): 2017-06-26
2. 上海交通大学药学院 上海 200240;
3. 中国医药工业研究总院 上海 201203;
4. 中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所 中国科学院合成生物学重点实验室 上海 200032
2. School of Pharmacy, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China;
3. China State Institute of Pharmaceutical Industry, Shanghai 201203, China;
4. CAS Key Laboratory of Synthetic Biology, Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences (CAS), Shanghai 200032, China
鲍曼不动杆菌是一种革兰氏阴性球杆菌，自1970年以来，随着广谱抗菌药物的滥用，鲍曼不动杆菌耐药性也随之增强，可引起皮肤表面和软组织的感染以及更严重的疾病(败血症、肺炎等)[1]。鲍曼不动杆菌之所以成为医院内治疗的难点与它的多重耐药性密切相关。通常不动杆菌属都是自然感受态，可以从外界获取各种基因元素(质粒、插入序列和抗性岛等)而具备耐药性[2-3]。此外，鲍曼不动杆菌可以在非生命体表面形成生物膜，顽强的抵抗力使其能在干燥物体表面长期存活[4]，较高的定殖率使其能在患者、医护人员内部或之间进行传播[5]。
随着鲍曼不动杆菌在医院内引起感染的暴发，使其成为一种重要的病原体[6]。全面理解鲍曼不动杆菌的致病机理和耐药机制是治疗鲍曼不动杆菌感染的关键。目前，虽然已有600多株的鲍曼不动杆菌基因组完成测序，大量的基因组信息可用于研究各种遗传因子在敏感菌株和致病菌株中的作用，但仍由于遗传操作工具的匮乏从而限制了鲍曼不动杆菌的基因功能的进一步研究[7]。
通常我们通过基因失活或者选择性修饰评估某个基因的功能。对于鲍曼不动杆菌而言，可以采用单交换插入得到重复突变、双交换得到等位基因替换、转座突变得到基因突变株等遗传操作方法进行基因组编辑。目前，Jacobs等已经发布了将外源基因导入鲍曼不动杆菌的3种常用方法的精简版实验室实用操作手册[7]，本文在其基础上增加了最佳实验条件，并对鲍曼不动杆菌的遗传操作方法进行了更新，同时完善了遗传操作质粒的信息，包括复制子、宿主范围以及转移方法。
1 外源基因导入鲍曼不动杆菌的方法将外源DNA导入鲍曼不动杆菌是进行鲍曼不动杆菌遗传操作的首要步骤，目前主要包括电转化、自然转化和接合转移3种方法。
1.1 电转化的方法电转化(Electroporation)主要是利用脉冲电流使细菌外膜瞬间产生小孔，让外界的DNA、蛋白、DNA-蛋白复合物通过小孔进入胞内。这是一种将外源DNA转入细胞内的常用方法，其转化效率受到电转参数、外源DNA量、细胞的密度、缓冲体系和感受态细胞生长阶段的影响，Yildirim等通过多因素探索实验发现菌体的浓度和镁离子的浓度相较于其他因素对电转化效率的影响最大，其中电转化的效率与菌体浓度成正相关，与镁离子的浓度成负相关。实验证明，在100 Ω的电阻和17 kV/cm的电压下，将25 ng的质粒DNA电转入处于稳定生长期(OD600=6.0)的鲍曼不动杆菌ATCC 17978中，可获得最高的转化效率，每微克DNA约产生1.05×109个转化子[8]。通过电转化的方式，可以快速高效地将自杀质粒或穿梭质粒导入鲍曼不动杆菌，实现基因组的编辑，研究目的基因的功能。通过电转化的方式转入鲍曼不动杆菌的遗传操作质粒见表 1。
| 质粒 Plasmids | 复制子 Replicons | 抗性标记 Resistance marker (s) | 宿主范围 Host range | 转移方法 Transfer methods | 参考文献 References |
| 复制型质粒 Replicative plasmids | |||||
| pCON19-79 | RSF1010 | TetR(10 mg/L) KanR(50 mg/L) | Broad | Conjugation | [9] |
| pMMB67EH | RSF1010 | AmpR(100 mg/L) | Broad | Electroporation | [10] |
| pWH1266 | pBR322, pWH1277 | AmpR(100 mg/L) TetR(10 mg/L) | A. spp. E. coli | Electroporation | [8] |
| pBAV1K-T5 | RCR | KanR(50 mg/L) | Broad | Electroporation Natural transformation | [11] |
| pMQ300 | pBBR1 | HygR(100 mg/L) | G- | Conjugation | [12] |
| pNLAC1 | pMAC, pBR322 | TetR(10 mg/L) | A. spp. E. coli | - | [13] |
| pBAD18Kan-Ori | p15A, A. baumannii | KanR(50 mg/L) | A. spp. E. coli | Electroporation | [13] |
| pAT02 | RSF1010 | AmpR(100 mg/L) | Broad | Electroporation | [14] |
| pAT03 | RSF1010 | AmpR(100 mg/L) | Broad | Electroporation | [14] |
| pAT04 | RSF1010 | TetR(10 mg/L) | Broad | Electroporation | [14] |
| 非复制型质粒 Nonreplicative plasmids | |||||
| pEX100T | pMBl | AmpR (100 mg/L) | - | Conjugation | [15] |
| pMo130-TelR | Ori | TelR(6 mg/L) KanR(50 mg/L) | - | Conjugation | [16] |
| pSSK10 | oriRK6 | KanR(50 mg/L) | - | Conjugation | [17] |
| pUC18T-mini-Tn7T-hph-lux | Ori | HygR(100 mg/L) | Broad | Electroporation Conjugation | [18] |
| pABK | Ori, pBL1 | KanR(50 mg/L) | - | Conjugation | [19] |
| pFLP2 | pBR322 | AmpR(100 mg/L) | Broad | Conjugation | [20] |
| pJQ200 | P15A | GmR(20 mg/L) | G- | Conjugation | [21] |
| 注：Ori：ColE1的复制起始位点；oriRK6：RK6的复制起始位点；TetR：四环素抗性；KanR：卡那霉素抗性；AmpR：氨苄青霉素抗性；HygR：潮霉素抗性；TelR：亚碲酸盐抗性；GmR：庆大霉素抗性；A. spp.：不动杆菌属；G-：革兰氏阴性菌. Note: Ori: ColE1 origin of replication; oriRK6: RK6 origin of replication; TetR: Tetracycline; KanR: Kanamycin; AmpR: Ampicillin; HygR: Hygromycin; TelR: Tellurite; GmR: Gentamycin; A. spp.: Acinetobacter spp.; G-: Gram-negative bacteria. | |||||
不动杆菌属都是自然感受态，鲍曼不动杆菌也同样具备较高的自然转化(Natural transformation)能力。与其他菌不同的是鲍曼不动杆菌能够在进入指数生长期后迅速进入自然感受态状态，并于稳定生长期维持一段时间后逐渐降低感受态能力[22]。鲍曼不动杆菌的自然转化实验的标准流程是将处于稳定生长期与衰亡期之间的50 μL鲍曼不动杆菌加入到含有100 ng DNA的LB培养基中，然后在37的摇床中孵育1 h，最后涂布于相应的平板上培养。据文献报道，转化效率与温度、渗透压、以及转入的DNA的量、种类无关，主要受到pH、Ca2+浓度以及白蛋白浓度的影响[23]。
1.3 接合转移的方法通过3个细菌之间的直接接触转移DNA的方法也是鲍曼不动杆菌获取外源DNA的主要方法之一。将含有目标基因的质粒从大肠杆菌供体菌转移至鲍曼不动杆菌受体菌中，并让含有能够自我转移的辅助质粒的大肠杆菌辅助菌参与DNA转移过程，这是一个复杂的过程：(1)将辅助质粒(如pRK 2013、pRK 2073)转至含有供体质粒的大肠杆菌中，使得供体菌具备接合转移(Conjugation)的能力；(2)含有目标基因的质粒从供体菌转移至鲍曼不动杆菌中。常用于鲍曼不动杆菌接合转移的供体质粒见表 1[7]。
2 鲍曼不动杆菌基因组改造技术尽管鲍曼不动杆菌基因组测序菌株已达600多株，但有相当一部分基因的功能未知，为了对这些基因的功能进行深入研究，需要对鲍曼不动杆菌进行基因组改造。目前可使用的基因组改造技术包括等位基因交换、DNA重组工程和转座子技术3种方法。
2.1 等位基因交换与众多细菌相同，鲍曼不动杆菌自身具备重组系统。含有失活基因或者修饰基因的自杀质粒/非复制型质粒(Nonreplicative plasmids)低频率整合入基因组，然后通过表型筛选可得到发生基因替换的菌株。鲍曼不动杆菌中的常用自杀质粒包括pMo130-TelR、pSSK10、pEX100T、pJQ200等，见表 1。但是，通过自杀质粒导入外源DNA发生基因替换的方法存在3点不足：(1)自杀质粒的外源DNA也存在部分或者不存在同源性的非合理性重组现象；(2)构建质粒费时；(3)通过二次交换重组还原成野生型。此外，向鲍曼不动杆菌中直接电转入含有抗性的同源线性DNA片段，也可以发生同源重组的基因替换，但是重组效率低下并且发生非合理性重组现象更加严重[24-25]。所以，仅依靠鲍曼不动杆菌自身的重组系统进行等位基因交换的方法已经不再适用于鲍曼不动杆菌的基因组改造，现常用DNA重组工程实现其基因组改造。
2.2 DNA重组工程近年来，新发现的RecETab重组工程系统，极大地提高了鲍曼不动杆菌的重组效率。重组工程最初用于大肠杆菌中的基因替换，是一种基于同源重组的原理在基因组上进行基因定点插入、敲除或者序列替换的方法[26]。线性的双链DNA (如PCR产物)或者单链的寡核苷酸导入胞内作为基因组改造的同源底物，来源于Rac噬菌体编码的同源重组蛋白(如λRed系统或者RecET系统)催化基因重组反应[27]。基于同源重组原理进行的基因组编辑分为单交换和双交换两种。单交换用于整合质粒插入基因组，使目标基因失活，但基因组上存在整合质粒上的所有原件包括抗性筛选标记[28]。双交换可实现基因的无痕敲除/敲入。
尽管λRed系统在众多革兰氏阴性菌中表现出良好的工作效率，但经IPTG诱导的λRed系统不仅无法协助完成鲍曼不动杆菌的基因重组，而且大大降低了鲍曼不动杆菌的生长速度，可能λRed系统表达的蛋白对鲍曼不动杆菌具有毒性。RecET同源序列已经在鲍曼不动杆菌(IS-123)中被鉴定，将IS-123克隆入需IPTG诱导的pMMB67EH质粒，Tucker等将此系统命名为RecETab。该系统已经成功用于ATCC 17978和ATCC 19606的基因组改造，实现单/双基因的敲除，如氧化压力相关基因(oxyR)、外排泵基因(aceI)等。但只有当整合片段超过5 μg且同源臂序列超过125 bp时，鲍曼不动杆菌的基因组才会发生同源重组。如图 1所示，含有125 bp的同源臂的整合片段，在RecETab表达的重组酶的辅助下通过双交换的方式将基因组上的目的基因替换为卡那抗性盒，然后利用FLP/FRT系统消除卡那抗性盒，实现目标基因的敲除[14]。但是，菌株对外源DNA的转化效率不高或进入细胞的外源DNA量不足都会导致同源重组失败。
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| 图 1 利用RecETab和FLP/FRT系统完成目的基因的敲除 Figure 1 The RecETab system and FLP/FRT system are used for unmarked gene deletion 注：A：质粒RecETab的图谱，该质粒可以表达同源重组蛋白；B：联合运用RecETab系统和FLP/FRT系统进行基因无痕敲除的流程. Note: A: Plasmid RecETab map, this plasmid can express homologous recombination proteins; B: Strategies for unmarked gene deletion with RecETab system and FLP/FRT system. |
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转座子是DNA插入因子的一种，可以在基因组上的一个位置跳跃到一个新的位置，依据插入位点的特征，分为特异性插入和随机插入。特异性插入的转座子包括特异位点重组的接合转座子、识别保守的富含AT序列的转座子以及唯一识别位点的转座子，如Tn7。随机插入的转座子包括来源于果蝇的Mariner转座子，来源于噬菌体的Mu转座子以及来源于细菌的Tn系列转座子。转座突变首先在大肠杆菌、铜绿假单胞菌和霍乱弧菌等革兰氏阴性菌中被发现，后来发现在鲍曼不动杆菌中也可以得到较好的应用[29-30]，目前鲍曼不动杆菌中常用的随机插入转座子见表 2。转座子在基因组上的插入突变或分子标记为探究基因功能提供了新方法。Tn5和Himar1是鲍曼不动杆菌中最常用的两个转座突变系统[31, 37]。
| 转座子 Transposons | 特征 Properties | 参考文献 References |
| ▶Himar1 mariner ▶Two Himar1 derivatives (MAR2x T7, HimarBP) | ▶Cut-and-paste transposition ▶TA target site duplication ▶No requirement of species-specific host factor ▶Broad-host range | [31-33] |
| ▶Tn5 | ▶Cut-and-paste transposition ▶A 9-bp target site duplication ▶Mostly utilized for random mutagenesis | [31, 33] |
| ▶Tn10 | ▶Cut-and-paste transposition ▶Requirement of a 6-bp unique target sequence ▶A 9-bp target site duplication | [33-34] |
| ▶Tn7 | ▶Single, unique sites (attTn7) ▶generally located downstream of glmS | [35] |
| ▶mini-Tn10PttKm | ▶Single, unique sites | [30] |
| ▶Tn3171 | ▶“Hot-spot”for insertion in agene Governing arginine biosynthesis | [36] |
| 注：表中的特征表示该转座子随机插入基因组的方法及插入位置的偏好性. Note: Properties means the methods of transposons randomly insert into genome and insert location preferences. | ||
来源于Tn5的EZ::TN < R6Kγori/KAN-2 > 转座系统，比野生型Tn5转座系统的转座效率提高了1 000倍，已经被普遍应用于鲍曼不动杆菌和其他的不动杆菌中[38]。EZ::TN转座子是一核酸蛋白复合物，其转座酶末端一定要有反向重复序列存在，此转座子可直接电转入鲍曼不动杆菌中，在无抗生素压力筛选下，只有2%的回复突变。此外，EZ::TN转座系统介导的转座插入位点定位较简单，可利用“拯救”克隆的方法直接定位EZ::TN < R6Kcori/ KAN-2 > 转座系统的基因插入位点[39]。另外，直接PCR扩增和随机末端PCR扩增基因组DNA也是两种非常适用的快速定位转座插入位点的方法。
来源于铜绿假单胞菌的MAR2xT7是一种基于Himar1的转座系统[31-32]，可以在辅助质粒pRK2013的帮助下通过接合的方式将转座子MAR2xT7导入鲍曼不动杆菌中，发挥较好的转座效果。相较于其他转座系统，MAR2xT7转座系统能够利用转座位点杂交分析(TraSH)方法进行突变株的基因印迹追踪，检测出突变库中的突变株。
尽管转座系统操作简单高效，但目前适用于鲍曼不动杆菌的转座系统十分有限，有待进一步完善。
3 总结与展望基于临床研究的需要，研究者们越来越关注鲍曼不动杆菌多重耐药性机制的研究，并不断探索基因与表型之间的关系。目前利用电转化、自然转化和接合转移的方式向鲍曼不动杆菌中转入外源基因的实验条件已经非常成熟，但是在基因组层面对于鲍曼不动杆菌的定点基因改造技术有待进一步发展。由于耐药菌株获取困难，常用转座突变系统建立突变库获取耐药菌株研究样本，如在ATCC 17978中构建的一个约有15万个单插入位点的突变库，已经被用于鲍曼不动杆菌持续耐药的新的毒性因子的研究[40]。针对抗性标记种类稀少的问题，采用来自酵母菌中的FLp/FRT系统[41]和来自噬菌体的Cre/loxP系统[42]进行抗性标记消除，实现了鲍曼不动杆菌基因组的多基因的改造。
此外，CRISPR/Cas9系统自2012年发布以来，由于其操作简单、成本低廉、作用高效的特点，得到广泛的应用[43]。Cas9作为一种核酸内切酶蛋白，能够在gRNA的指引下结合到基因组的靶序列位置，实现定点切割，再利用同源重组的方式将Donor DNA导入切割位点，实现基因的敲除/敲入[44-46]，能够有效避免多重抗性标记的使用，未来也有望应用于鲍曼不动杆菌的基因改造。
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