Pseudomonas protegens H78是本实验室从油菜根际分离得到的一株生防细菌，能产生多种具有抗菌活性的次级代谢产物，其中包括藤黄绿菌素(Pyoluteorin，Plt)。Plt是一种聚酮合酶(Polyketide synthase，PKS)和非核糖体钛合成酶(Nonribosomal peptide synthetase，NRPS)杂合的广谱抗生素，能有效抑制卵菌、细菌和真菌，尤其对植物致病菌终极腐霉有很好的抑制作用。Plt合成及调控基因簇，主要由pltLABCDEFG与pltRM两个反向转录的操纵子组成。其中pltR编码一个转录激活子，负责pltL-G操纵子的表达及Plt合成的激活^[1]。研究表明Plt合成受到Gac/Rsm信号转导级联、群体感应系统、RNA分子伴侣等调控因子复杂的调控^[2-3]。然而，参与Plt合成调控的潜在分子机制还有待进一步研究与探明。

Crc蛋白(Catabolite repression control protein)广泛存在于假单胞菌中，是全局性转录后调控蛋白，在碳代谢物阻遏应答途径中起着关键作用^[4]。近年来研究表明Crc参与假单胞菌中氨基酸、糖类、碳水化合物和芳香族化合物等的分解代谢过程，并分级同化吸收碳源用于自身生长^[5-6]。Crc蛋白的活性和sRNA (CrcZ、CrcY)的表达量有关，研究发现这些sRNA包含几个CA结构域，可以与Crc蛋白结合，进而阻碍Crc蛋白与靶mRNA结合^[7-8]。Crc蛋白在靶RNA的识别位点中包含一个短的AANAANAA结构域(CA结构域)，并在RNA分子伴侣Hfq蛋白存在时Crc才能与CA结构域结合^[9]。本研究发现在P. protegens H78中Crc调控蛋白对Plt生物合成具有显著的正调控作用。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒: 研究中使用的菌株及质粒见表 1。

1.1.2 引物: 研究中用引物委托上海华津生物科技有限公司进行合成，引物序列见表 1。

1.1.3 培养基配方、抗生素用法及培养发酵条件: LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，NaCl 10.0，pH 7.5；KMB培养基(g/L)：甘油15 mL，蛋白胨20.000，K₂HPO₄·3H₂O 0.514，MgSO₄ 0.732，pH 7.5；固体培养基琼脂使用浓度12 g/L。抗生素使用浓度(mg/L)：对于大肠杆菌，四环素(Tc) 15、卡那霉素(Km) 50、硫酸氨苄青霉素(Amp) 100；对于假单胞菌，四环素(Tc) 30、卡那霉素(Km) 50、硫酸氨苄青霉素(Amp) 100。大肠杆菌培养条件为37、200 r/min振荡培养；假单胞菌培养条件为28、180 r/min振荡培养。

1.1.4 主要试剂和仪器: KOD-plus-Neo DNA高保真聚合酶，东洋纺(上海)生物科技有限公司；Solution Ⅰ DNA连接酶、质粒提取试剂盒、DNA片段纯化试剂盒、胶回收试剂盒，宝生物工程(大连)有限公司；EasyTaq Mix DNA聚合酶、DNA Marker、EasyPure Genomic DNA快速纯化试剂盒，北京全式金生物技术有限公司；DNA限制性内切酶，New England Biolabs (NEB)公司；ONPG、IPTG和X-gal，生工生物工程(上海)股份有限公司。HPLC用于检测Plt产量的分析柱为反相C₁₈色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，安捷伦科技(中国)有限公司。

1.2 DNA操作及PCR反应

常规DNA操作方法参照文献[10]。

基因组纯化、质粒抽提、DNA片段纯化及胶回收纯化的方法均参照试剂盒说明书。酶切、酶连反应体系及条件参照试剂使用说明书，但视情况对反应体系进行优化。

KOD-plus-Neo DNA高保真聚合酶用于片段克隆，PCR反应体系(50 μL)：10×KOD-plus-Neo buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 5 μL，25 mmol/L Mg²⁺ 3 μL，1.0 U/μL KOD-plus-Neo DNA高保真聚合酶1 μL，10 μmol/L引物各1.5 μL，DNA模板0.5 μL，ddH₂O 32.5 μL。PCR反应条件：94℃ 5 min；98℃ 10 s，55−65℃，68℃ 0.5−3 min，30个循环；68℃ 7.5 min。EasyTaq Mix DNA聚合酶用于菌落PCR验证，PCR反应体系(20 μL)：2×EasyTaq Mix 10 μL，ddH₂O 8 μL，10 μmol/L引物各1 μL，DNA模板为菌落。PCR反应条件：95℃ 5 min；94℃ 30 s，55−65℃，72℃ 0.5−3 min，30个循环；72℃ 10 min。

1.3 Plt产量测定

Plt产量测定方法参照文献[1]。

1.4 β-半乳糖苷酶活性测定

采用Miller方法进行β-半乳糖苷酶活性测定^[10]。

本研究中所有实验均独立重复两次以上，每个实验每个菌株均设置3个以上平行重复。

2 结果与分析 2.1 H78Δcrc突变株的构建及验证

采用同源重组无痕敲除方法在H78基因组上敲除crc基因^[11]，突变株构建图谱如图 1A所示。以crc-A1/crc-A2和crc-B1/crc-B2为引物，H78基因组为模板，采用KOD聚合酶体系扩增crc基因的上下游同源片段。使用EcoRⅠ/Hind Ⅲ双酶切使载体pK18mobsacB线性化，采用In-Fusion HD Cloning Kit构建敲除质粒pK18-crc。通过单交换、双交换及菌落PCR筛选突变株，挑取阳性克隆子，进行PCR验证，图 1B为阳性敲除菌株PCR产物电泳图。对PCR产物进一步测序分析，发现crc确实已成功敲除，crc敲除菌株命名为H78Δcrc。

2.2 Crc对Plt生物合成的影响

H78野生型菌株及H78Δcrc突变株在KMB培养基中进行发酵，在28℃、180 r/min振荡培养，不同时间点分别取样测定细胞密度(OD₆₀₀)和Plt产量。细胞生长及Plt合成曲线图谱如图 2所示。从图 2A中可以看出，crc基因缺失对菌株生长无显著影响，0−24 h间两者生长几乎一致；在24 h后，H78Δcrc比H78生长略微缓慢。图 2B显示，H78及H78Δcrc的Plt产量均在24 h达到最高点，H78的Plt产量最高约为18 mg/L，而H78Δcrc的Plt产量约为11 mg/L。总体而言，crc基因缺失导致Plt产量下降明显。Crc作为全局调控蛋白，可能间接参与并且正调控Plt的生物合成。

2.3 Crc对Plt合成基因表达的调控

前期工作已通过5′RACE确定了pltL的转录起始位点(+1)，采用lacZ报告分析进一步研究Crc对Plt合成基因表达的调控。首先构建pltLp-lacZ、pltLo-lacZ和pltL′-′lacZ三个lacZ融合报告质粒，分别在转录水平、转录后水平以及整体水平研究Crc对plt合成基因表达的调控。pME6522-pltLp及pME6015-pltL_总均采用In-Fusion HD Cloning Kit进行构建，融合质粒pME9533-pltLo采用酶切、酶连方法进行构建，构建图谱如图 3所示。经测序证实3个lacZ融合报告质粒均构建成功。

2.3.1 Crc在整体水平上对plt合成基因表达的调控: 通过构建pltL′-′lacZ融合质粒(−454 bp到+62 bp，即pltR−pltL之间的全部非编码区域以及ATG下游的6个密码子)，用于研究Crc在整体水平上对plt合成基因表达的调控。H78和H78Δcrc分别在KMB培养基中进行发酵，28℃、180 r/min振荡培养，12、16、20、24 h时分别取样测定细胞密度(OD₆₀₀)和β-半乳糖苷酶活性。实验结果如图 4所示，与H78相比，突变株H78Δcrc中的pltL′-′lacZ表达显著下降，表明Crc蛋白在整体水平上对plt生物合成基因表达具有正调控作用。

2.3.2 Crc在转录水平及转录后水平对plt合成中基因表达的调控: 构建pltLp-lacZ转录融合质粒(–454 bp到+1 bp，即从pltL的转录起始位点到其上游454 bp区域)和pltLo-lacZ转录后融合质粒(+1 bp到+71 bp，即从pltL的转录起始位点到其下游71 bp区域)，分别用于研究Crc在转录水平及对转录后水平对plt合成基因表达的调控。发酵条件参考2.3.1。图 5A所示，与H78相比较，突变株H78Δcrc中的β-半乳糖苷酶表达显著下降，表明Crc蛋白在转录水平上正调控plt合成基因的表达。同样，如图 5B所示，crc突变导致pltLo-lacZ表达显著下降，表明Crc对plt合成基因表达存在转录后水平的正调控作用。

3 结论与讨论

本研究初步鉴定了Crc对Plt生物合成具有正调控作用，在总体水平、转录水平以及转录后水平均正调控plt合成基因的表达。Crc是一种RNA结合蛋白，能够识别靶mRNA起始密码子ATG附近的特定的核苷酸序列(CA结构域)，阻碍翻译起始复合体的形成，从而直接阻碍基因表达^{[9, 12-13]}。此外，Crc在转录水平上间接调控基因表达，例如在恶臭假单胞菌Pseudomonas putida中，Crc抑制alkS基因的表达，而alkS在烷烃降解通路中是转录激活因子，因此Crc间接在转录水平上影响烷烃降解^[14]。综上所述，Crc在转录、转录后及总体水平上均正调控plt合成基因表达，然而Crc对plt合成基因在转录水平调控，还是转录后水平调控的具体的分子调控机制，均有待进一步研究阐明。本研究为进一步阐明Plt合成的调控机制与网络奠定基础，同时为开展基因及代谢工程提供依据。