斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)属鲶形目(Silurformes)鮰科(Ictaluridae)^[1]，原产于美洲，是美洲重要的水生经济鱼类，肉质鲜美又无肌间刺，因此深受消费者青睐。1984年湖北水产科技工作者引进国内养殖斑点叉尾鮰，因其适应国内各种养殖环境，并具有饵料来源广、广温性及生长速度快等优势，迅速在国内掀起了养殖热潮。但随着斑点叉尾鮰养殖的大规模推广，养殖户受市场高价的诱惑，养殖规模及密度不断扩大，养殖环境不断恶化，导致病害频发，已成为斑点叉尾鮰养殖业健康发展的一大障碍。目前已报道的斑点叉尾鮰细菌性病原主要有嗜水气单胞菌^[2]、温和气单胞菌^[3]、嗜麦芽寡养单胞菌^[4]、海豚链球菌^[5]、鮰爱德华氏菌^[6]、荧光假单胞菌^[7]、鲁氏耶尔森氏菌^[8]及鲍曼不动杆菌^[9]等。

2016年六七月湖北仙桃养殖场的斑点叉尾鮰出现一种病害，发病死亡率30%，引起严重经济损失。发病斑点叉尾鮰体表轻微溃烂，肛门有淡黄色液体流出，经解剖后发现肝脂变严重、轻微坏死，脾肾轻微充血，肠道严重糜烂坏死。本研究从患病死亡斑点叉尾鮰体内分离到一株高致病菌株，开展了生理生化指标测定、16S rRNA基因序列测定、系统发育分析及回归感染，并对其药物敏感性进行了测定，旨在为斑点叉尾鮰普通变形杆菌病的有效防控提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 试验鱼: 5尾自然患病斑点叉尾鮰取自湖北仙桃鮰鱼养殖场；健康斑点叉尾鮰规格50±1.5 g，购自湖北嘉鱼苗种场，活力强，无明显外伤，暂养7 d无异常后用于实验。

1.1.2 主要试剂和仪器: 普通营养琼脂、营养肉汤、水解酪蛋白琼脂购自北京陆桥生物技术有限公司；药敏纸片及细菌生化微量鉴定管购自杭州滨和微生物试剂有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒及PCR试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司。无菌操作台、摇床及高压灭菌锅购于上海博讯实业有限公司；离心机及恒温培养箱购于上海恒一科学仪器有限公司；PCR仪购于赛飞(中国)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离: 在无菌条件下取患病斑点叉尾鮰体表溃烂肌肉、肝、肾、脾及坏死肠道，接种于普通营养琼脂平板上。恒温28 ℃培养24 h后，挑取形状、大小及颜色基本一致的菌落进行细菌纯化培养。纯化好的菌株与25%甘油混匀后保存于–80 ℃。

1.2.2 人工感染: 取健康无伤病斑点叉尾鮰用于感染试验，设置试验组及对照组，每组斑点叉尾鮰为10尾，每组均设置2个重复。将分离菌株用生理盐水制成浓度为1.2×10⁹ CFU/mL的菌液，试验组斑点叉尾鮰每尾腹腔注射菌液0.1 mL，对照组每尾注射等剂量生理盐水。试验期间不投喂，保持水质良好，溶氧充足，水温控制在25±2 ℃。连续观察记录斑点叉尾鮰发病死亡情况，对濒死斑点叉尾鮰进行解剖及细菌再分离。

1.2.3 细菌LD₅₀测定: 配制浓度为4.2×10¹⁰、4.2×10⁹、4.2×10⁸、4.2×10⁷、4.2×10⁶ CFU/mL的分离菌株菌悬液，采取腹腔注射法进行攻毒试验，注射量为0.1 mL/尾，即不同组斑点叉尾鮰菌液注射剂量分别为4.2×10⁹、4.2×10⁸、4.2×10⁷、4.2×10⁶、4.2×10⁵ CFU/尾，对照组斑点叉尾鮰相同部位注射等剂量的0.65%生理盐水，每组斑点叉尾鮰均是10尾。连续观察并及时记录斑点叉尾鮰发病死亡情况，用概率单位图解法^[10]计算半致死剂量(LD₅₀)。

1.2.4 形态学及生理生化特性测定: 对分离菌株进行革兰氏染色，并在光学显微镜下观察其形态特征。采用细菌生化微量反应管，参照《常见细菌系统鉴定手册》^[11]对分离菌株生理生化指标进行测定。

1.2.5 16S rRNA基因序列测定及系统发育分析: 将分离菌株接种于营养肉汤中，取处于对数生长期的菌液离心(4 ℃，12 000 r/min) 1 min后收集菌体，经试剂盒提取DNA后作为PCR扩增模板。上游引物27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′；下游引物1492R：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。参照曹海军等^[12]方法进行PCR扩增，50 μL PCR反应体系：10×PCR buffer 5 μL，dNTPs (10 mmol/L) 1 μL，上、下游引物(10 mmol/L)各1 μL，rTaq DNA聚合酶(5 U/μL) 0.5 μL，DNA模板2 μL，ddH₂O补足至50 μL。PCR反应条件：95 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，共30个循环；72 ℃ 8 min。将PCR扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司纯化及测序。将测序结果与NCBI中已有序列进行BLAST比对，并利用Mega 5.1软件中Neighbor-Joining法构建系统发育树。

1.2.6 药敏特性分析: 参照NCCLS实验标准^[13]，采用纸片扩散法开展药敏实验。将分离菌株接种于营养肉汤培养基中，用生理盐水调整菌液浓度为1.5×10⁷ CFU/mL。取200 μL菌液均匀涂布于水解酪蛋白琼脂平板上，贴上不同的药敏纸片，置于28 ℃恒温培养24 h后测量抑菌圈大小。

2 结果与分析 2.1 细菌分离

从自然患病斑点叉尾鮰肝、肾、脾及坏死肠道分离到同一株高致病菌株k1。经人工感染研究，实验组斑点叉尾鮰出现死亡，而对照组没有出现异常情况。感染发病死亡斑点叉尾鮰出现体表轻微出血，肛门有大量黄色液体流出；解剖发现肝、肾及脾严重充血，肠道糜烂及轻微坏死。从感染致死斑点叉尾鮰的肝、肾、脾及坏死肠道分离到与菌株k1生理生化特性一致的菌落，因此证实k1株为斑点叉尾鮰致病菌。根据建立的实验鱼死亡率(%)与分离菌株注射剂量对数[lg(CFU)]的关系曲线：y=21x–106.02 (表 1、图 1)，k1株对斑点叉尾鮰的半数致死剂量LD₅₀=1.41×10⁷ CFU/50 g，即LD₅₀=2.82×10⁵ CFU/g。

2.2 细菌鉴定

k1株为革兰氏阴性菌，详细理化特性如表 2所示，k1菌株理化特性与普通变形杆菌Proteus vulgaris基本一致。k1的16S rRNA基因序列片段大小为1 395 bp，GenBank登录号为KY118917，将测序结果与NCBI中已有序列blast比对，比对结果表明分离株k1与变形杆菌种类同源性最高，选取同源性高的变形杆菌属及水产重要病原菌的16S rRNA基因序列，构建系统发育树进行分析(图 2)，菌株k1在发育树上与普通变形杆菌Proteus vulgaris聚为一支。综合判定分离菌株k1为普通变形杆菌Proteus vulgaris。

2.3 药敏特性

研究了分离菌株k1对19种抗生素的敏感特性，结果见表 3。分离菌株k1对环丙沙星、头孢唑林、头孢拉定、氯霉素、氟苯尼考、诺氟沙星、阿奇霉素、新霉素、卡那霉素、左氧氟沙星、庆大霉素及丁胺卡那霉素高度敏感，对苯唑西林、阿莫西林、痢特灵、克林霉素、利福平、红霉素及多西环素不敏感。

3 结论与讨论

普通变形杆菌隶属于肠杆菌科(Enterobacteriacedae)变形杆菌属(Proteus)，是革兰氏阴性杆菌，两端钝圆，无荚膜，不形成芽孢，有周身鞭毛，运动活泼，有菌毛，可黏附于真菌等细胞表面^[14]。

普通变形杆菌在养殖水体、底泥及腐败物以及人和动物肠道中普遍存在，是机会致病菌，因继发感染引起人类疾病的报道较多，主要有食物中毒、膀胱炎及伤口感染等，危害较大^[15]。感染鱼类致病的报道日趋增多，目前已经有普通变形杆菌感染虾^[16]、大口鲶^[12]、中华鳖^[17-18]、赤点石斑鱼^[19]及鳄鱼^[20]等发病致死的报道。由此可见普通变形杆菌宿主从无脊椎动物到脊椎动物直至人类，宿主广泛而且致病力强，是人畜鱼共患重要病原之一。变形杆菌致病机理一般是通过菌毛黏附到宿主细胞上，并在宿主细胞快速滋生鞭毛及多糖荚膜，然后进入到宿主细胞内部并大量释放尿素酶、溶血素、溶蛋白酶等毒力因子，从而导致宿主出现异常及病变，引发疾病^[21]。

本研究从患病斑点叉尾鮰肝、肾、脾及坏死肠道分离到菌株k1，经腹腔注射分离菌株k1菌悬液，实验组斑点叉尾鮰出现与自然发病类似症状，并且对斑点叉尾鮰的半致死剂量为2.82×10⁵ CFU/g，表现出了较强的致病力。本次普通变形杆菌感染斑点叉尾鮰致病在国内尚属首次报道。变形杆菌在自然界广泛存在^[22]，因此在水产动物肠道中同样存在，由于水产动物肠道中各种微生物构成了一个相对平衡的微生态系统^[23]，在正常情况下微生物与宿主相互影响^[24-25]，不产生危害。但随着养殖业的发展，人们干预养殖进程，破坏了微生态平衡，变形杆菌可能获得快速繁殖的机会，引起致病。此次斑点叉尾鮰因感染普通变形杆菌而发生以肠道坏死为主要症状的病害，符合变形杆菌致病特点。

本研究对菌株k1生理生化特性进行了测定，其大部分指标均与普通变形杆菌一致，而柠檬酸盐、D-葡萄糖产气、水杨苷、七叶灵水解及脂酶等指标稍微有差异，其原因可能是人工读取结果导致的误差，但结果表明菌株k1很可能是普通变形杆菌。经16S rRNA基因序列比对及系统发育分析，菌株k1在系统进化树上与普通变形杆菌聚为一支，因此综合判定分离菌株k1为普通变形杆菌Proteus vulgaris。细菌鉴定方法目前一般是结合16S rRNA基因序列分析及生理生化特性测定结果综合判定，鉴定结果较传统鉴定法更省时、高效及准确。

目前对于细菌性病害防控，抗生素仍是主要利器之一。本实验研究了普通变形杆菌对19种抗生素的敏感特性，分离菌株k1对氟苯尼考新霉素及庆大霉素等12种抗生素高度敏感，对阿莫西林、克林霉素及多西环素等7种抗生素耐药。药敏实验结果显示菌株k1对丁胺卡那霉素高度敏感，与李槿年等^[18]研究结果一致，对新霉素、庆大霉素等高度敏感与李槿年等^[18]有差异，但对庆大霉素高度敏感与曹海军等^[12]研究一致。同时分离菌株对阿莫西林等耐药，与曹海军等^[12]研究一致，提示需严防抗生素滥用，避免耐药菌株的产生。药敏实验结果存在差异的可能原因在于菌株的来源不同，本次药敏实验结果可作为防控斑点叉尾鮰普通变形杆菌病的科学参考依据。