2017, Vol. 44扩展功能
文章信息
- 张思奇, 孙丽萍, 赵同雪, 徐澜坤, 耿肖兵, 李永刚
- ZHANG Si-Qi, SUN Li-Ping, ZHAO Tong-Xue, XU Lan-Kun, GENG Xiao-Bing, LI Yong-Gang
- 玉米茎基腐病生防菌的筛选及应用
- Screening and application of bio-control bacterium against corn stalk rot caused by Fusarium graminearum
- 微生物学通报, 2017, 44(10): 2345-2352
- Microbiology China, 2017, 44(10): 2345-2352
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.170336
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文章历史
- 收稿日期: 2017-05-03
- 接受日期: 2017-08-07
- 优先数字出版日期(www.cnki.net): 2017-08-15
玉米茎基腐病是世界性分布的土传病害，我国玉米产区多雨年份玉米茎基腐病发病率最高可达80%以上[1]。与未发生玉米茎基腐病相比，穗长、行粒数、百粒重显著减少，秃尖显著增长，造成一般减产25%左右，严重减产40%以上，加之穗轴易破碎，影响机械收割质量，严重时降低粮食等级[2]。玉米茎基腐病多发生在玉米乳熟期，发病部位为根系和茎基部的1–3节。玉米茎基腐病的发病时间越早，发病率越高，危害程度越重，造成的产量损失就越大，已成为严重制约玉米产业发展的病害之一[3]。
玉米茎基腐病主要在茎部发病，表现为内部组织腐烂、茎杆维管束组织丝状游离和须根系减少[4]。有关玉米茎基腐病病原的研究不尽相同，在1962年夏锦洪等就报道了玉米茎基腐病是由2种细菌(Erwinia carotovora f. sp. zeae和Pseudomonas zeae)和腐霉菌(Pythium aphanidermatum)引起的[5]。截止目前，引起玉米茎基腐病的主要致病菌分为以下4类：(1)腐霉菌(Pythium)是主要病原菌，其中禾生腐霉菌、肿囊腐霉菌是常见致病菌[6]；(2)镰刀菌(Fusarium)为主要致病菌，以禾谷镰孢(F. graminearum)和串珠镰孢(F. moniliforme)为主；(3)腐霉菌和镰刀菌交互作用复合侵染[7-9]；(4)腐霉菌与镰刀菌都是主要致病菌。研究表明同一地区不同时间分离的致病菌也不尽相同。本课题组在对黑龙江省玉米茎基腐病分离和鉴定过程中，认为禾谷镰孢为主要致病菌之一。
目前，玉米茎基腐病以化学防治为主，但随着人们环保意识的增强，对食品安全和生命健康等越来越重视，生物防治作为农业可持续发展的新兴技术成为关注的热点。在众多的生防菌应用中，尤其以生防细菌具有种类多、生活周期短、代谢活动快且产物多、繁殖能力高、对病原菌的作用方式多样[10]、易人工培养等特点，拮抗细菌及代谢产物在生物防治中都起到了重要作用[11]。
因此，本论文以玉米茎基腐病主要致病菌禾谷镰孢为目标病原菌进行了玉米内生拮抗细菌的筛选、鉴定及应用的研究，为玉米茎基腐病的生物防治奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料玉米品种：九单57，吉林省吉科种业有限公司。
供试菌株：病原菌株为禾谷镰孢，由本课题组分离保存。玉米内生菌分离的样本来自于东北农业大学香坊实验站玉米田内的健康玉米植株。供试生防菌株(生防菌48SJ7-1)由本实验室分离、鉴定并保存。抑菌谱测定真菌种类：半裸镰孢(Fusarium semitectum)、腐霉菌(Pythium)、灰梨孢属(Pyricularia grisea)、层出镰孢[F. proliferatum (Rice)]、腐皮镰孢(F. solani)、木贼镰孢(Fusarium equiseti)、链格孢菌(Alternaria alternate)、马铃薯黑痣病菌(Rhizoctonia solani Kühn)、立枯丝核菌(水稻)(Rhizoctonia solani)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、禾谷镰孢(F. graminearum)、立枯丝核菌(大豆)(R. solani Kühn)、葡萄霉菌枝孢属[Cladosporium cladosporioides (Rice)]、轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)。
主要试剂：革兰氏染色的结晶紫染液，厦门海标科技有限公司；番红复染液，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；卢戈氏碘液，湖北邦盛化工有限公司；95%乙醇溶液，河北康济药械有限公司；V-P试剂，上海一研生物科技有限公司。
供试培养基：LB培养基、PDA培养基、明胶液化培养基、淀粉水解培养基、M.R.试验培养基、糖醇类发酵试验培养基、柠檬酸盐利用试验培养基、酪朊水解试验牛奶培养基、需氧性测定的培养基、新鲜肉汁胨培养基的配制参照文献[12]。
主要试剂盒、仪器：植物的基因组提取试剂盒，康维生物科技有限公司；台式恒温振荡器ZD-85，上海浦东物理光学仪器厂。
供试对照化学药剂为2%戊唑醇悬浮种衣剂，四川红种子高新农业有限责任公司。600 g制剂/100 kg种子，种子包衣。
1.2 玉米茎基腐病拮抗内生菌的筛选 1.2.1 玉米内生细菌的分离: 采集长势良好的玉米植株，冲洗干净后取各组织2 g用纱布包好，以下工作在超净台中进行。处理组：包裹好的材料浸入75%酒精1 min，转入0.1%升汞浸泡1−2 min对玉米组织进行表面消毒，无菌水冲洗3次，待玉米组织表面风干后在灭菌的研钵中加入3 mL无菌蒸馏水研磨至匀浆，倒入NA培养基中摇匀，分装至3个无菌培养皿中，作为3个重复。对照组：包裹好的材料浸入75%酒精1 min，转入0.1%升汞1−2 min进行玉米组织表面消毒，无菌水冲洗3次，待玉米组织表面风干后在灭菌的研钵中加入2 mL蒸馏水浸泡1 min，将浸液倒入NA培养基中摇匀，分装至3个无菌培养皿中，作为3个重复。将上述培养皿25 ℃避光培养48 h，根据菌落的形态及颜色等挑取单菌落，按常规方法进行分离纯化，于4 ℃恒温保存备用。 1.2.2 拮抗菌的筛选: 生防菌株的筛选采用对峙培养法，将生防细菌在NA培养基上28 ℃活化48 h后划线接种在距PDA平板中心3 cm处，然后在此PDA平板的中央接种经过扩繁的供试的禾谷镰孢菌碟(d=0.7 cm)，每个处理3次重复，放入恒温箱中26 ℃培养6 d后测量植物病原菌菌丝生长的最长半径与最短半径，计算其比值。 1.2.3 抗菌谱的测定: 对符合抑菌要求的菌株经盆栽试验确定防效，将获得的目标菌株采用平板对峙法进行抑菌谱的测定。将玉米茎基腐病菌禾谷镰孢及测定抑菌谱的14种植物病原真菌培养活化，采用平板对峙的方法进行抑菌谱的测定，具体方法见1.2.2。 1.3 玉米茎基腐病拮抗内生菌的鉴定 1.3.1 形态学鉴定: 取拮抗细菌菌悬液，采用逐级稀释法稀释到10−6，取10 µL涂于NA平板，28 ℃恒温培养3 d，观察单菌落形态。然后进行革兰氏染色和芽孢染色[13]。 1.3.2 生理生化鉴定: 以《伯杰细菌鉴定手册》为主，参照东秀珠、蔡妙英主编的《常见细菌系统鉴定手册》的有关内容，进行细菌菌落形态、大小、颜色、表面光泽透明度及湿润度等，以及菌体形态、革兰氏染色、有无芽孢等、菌体大小、排列方式、培养特征、生理生化特征的各项分类鉴定。主要进行接触酶试验、明胶液化试验、硝酸盐还原试验、甲基红(M.R.)试验、乙酰甲基甲醇(V.P.)试验、糖醇类发酵试验、柠檬酸盐利用试验、酪朊水解试验、需氧性测定[13-14]。 1.3.3 分子鉴定: 分子鉴定采用16S rRNA基因扩增方法参考成丽霞等[15]的方法，用植物的基因组提取试剂盒提取总DNA，扩增产物克隆后送于生工生物工程(上海)股份有限公司测序，利用MEGA 4.0软件进行系统发育分析，基因序列于NCBI数据库在线比对。对供试菌株的染色体总DNA进行PCR扩增。16S rRNA基因扩增采用通用引物：16s P3S8 (5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和16s P5S15 (5′-ACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)。50 µL PCR反应体系为：2×Taq PCR Master Mix (2×Blue dye) 25 µL，模板DNA (5 ng/µL) 2 µL，上下游引物(10 mmol/µL)各2 µL，ddH2O 19 µL。PCR反应条件参照姬广海等[16]，略有改动：退火温度由55 ℃调高至58 ℃；72 ℃延伸8 min改为10 min。
1.4 48SJ7-1对玉米茎基腐病盆栽防效的测定种子处理：将玉米种子放入55 ℃的温水中，不断搅拌至25 ℃，浸种10 min，置于1%的次氯酸钠溶液中表面消毒10 min，然后用无菌水冲去种子表面残留的次氯酸钠，在超净工作台上吹干表面水分备用。
生防菌悬浮液的配制：将48SJ7-1菌株的种子液以1%的接种量接种至LB培养基中，250 mL三角瓶装液50 mL，30 ℃、150 r/min培养。用血球计数法观测菌液浓度，用无菌水配制成菌液浓度为1×109 cfu/mL。
接种体的准备：将禾谷镰孢在PDA平板上重新培养4 d后，取直径5 mm的菌碟接种到高粱粒培养基中，每个三角瓶中接种5−7个菌碟，26 ℃黑暗培养，每天振荡三角瓶1−2次，待菌丝长满每个高粱粒的表面，待用。
接种方法：将灭菌土装入12 cm×12 cm培养钵中至培养钵的2/3，接种约12粒带菌高粱粒，覆上约4 mm厚度的灭菌土，播种玉米，每钵3粒种子，再用2 cm的灭菌土覆盖在种子表面，以未接种病原菌的植株作对照，每个处理3次重复，重复2次试验。25 ℃光暗交替(12 h/12 h)培养，定期浇水保持湿润。
盆栽试验共设5个处理：处理1：玉米出土后每株玉米浇3 mL的生防菌(48SJ7-1)悬浮液；处理2：玉米出土后每株玉米浇5 mL的生防菌(48SJ7-1)悬浮液；处理3：玉米出土后每株玉米浇7 mL的生防菌(48SJ7-1)悬浮液；处理4：2%戊唑酮悬浮种衣剂按600 g/100 kg进行玉米拌种；处理5 (CK)：只接种病原菌。每处理设置3个重复，每个处理60株，种植15 d后调查发病率，隔15 d再调查1次，每次调查30株。
玉米茎基腐病病情分级标准[17]：0级，整株无病；1级，地上部和地下部生长基本正常，根部可见少量病斑，病斑面积占根表总面积1/4以下，根群颜色白中有褐；2级，地上部和地下部生长明显受阻，叶色变淡，株高仅及对照的3/4，侧根少而短，无须根，病斑连片，病斑面积占根表总面积的1/4−1/2，根群颜色白、褐相当；3级，地上部和地下部生长极不正常，地上部可见青枯、黄枯状，株高仅及对照的1/2，侧根极小，病斑面积占根总面积的1/2−3/4，根群颜色褐中带白；4级，发芽但不出苗，几乎窒息而死，病斑面积占根表总面积的3/4以上，根为褐色。
计算公式：防效(%)=[(空白对照区病株率−处理区病株率)/空白对照区发病率]×100；发病率(%)=[∑(每个病级的植株数×相对级数值)/(调查总植株数×最高级数值)]×100。
2 结果与分析 2.1 拮抗菌的分离与筛选从玉米组织内分离纯化得到200余株对禾谷镰孢有拮抗作用的内生细菌，根据抑菌最长半径与最短半径比值，选择拮抗效果最强的细菌(比值大于2)，初步进行了盆栽防效的测定，得到一株生防效果较好的细菌，作为供试生防菌，命名为48SJ7-1。该生防菌对玉米茎基腐病病原菌禾谷镰孢具有很好的拮抗作用，其最长半径与最短半径比值为3，且边缘菌丝稀疏。从图 1中可以看出病原菌禾谷镰孢的菌丝生长明显受到抑制，菌丝生长稀疏，颜色变淡。测定了48SJ7-1对14种植物病原真菌的抑菌谱，3次重复试验测量其拮抗最长半径/最短半径平均值的结果见表 1。
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| 图 1 48SJ7-1对禾谷镰孢菌丝生长的影响 Figure 1 Inhibition effect of antagonistic endophytic bacteria 48SJ7-1 on the mycelial growth of F. graminearum 注：接种5 d后测定最长半径与最短半径的比值. Note: Maximum radius and minimum radius of F. graminearum were measured five days after inoculating the agar dish with F. graminearum. |
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| 菌株 strains |
最长半径/最短半径 Maximum/Minimum radius |
| 灰梨孢属P. grisea | 2.23 |
| 半裸镰孢F. semitectum | 2.20 |
| 腐皮镰孢F. solani | 2.39 |
| 腐霉菌P. pringsheim | 2.17 |
| 葡萄霉菌枝孢属C. cladosporioides | 2.29 |
| 木贼镰孢F. equiseti | 2.73 |
| 尖镰孢F. oxysporum | 2.19 |
| 大豆立枯丝核R. solani | 2.30 |
| 马铃薯黑痣病菌R. solani | 2.38 |
| 水稻立枯丝核R. solani | 2.51 |
| 禾谷镰孢F. graminearum | 3.00 |
| 层出镰刀F. proliferatum | 1.58 |
| 链格孢菌A. alternate | 2.06 |
| 轮枝镰孢F. verticillioides | 1.92 |
| 注：数值均为3次测量的平均值；其中拮抗最长半径/最短半径 > 2为效果好的菌株. Notes: Above data was the average of 3 times. Results were expressed as better (Maximum/Minimum radius > 2). |
|
内生菌48SJ7-1对14种病原真菌抑菌谱的测定结果表明(表 1)：除对层出镰孢(F. proliferatum)和轮枝镰孢(F. verticillioides)抑菌效果表现较差外，对其它12种病原真菌均表现较好的抑菌效果。
2.3 48SJ7-1菌株鉴定 2.3.1 48SJ7-1菌株的传统鉴定: 通过培养和观察发现菌体呈杆状，芽孢呈椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏。幼龄菌落为圆形，表面和边缘均光滑，呈白色，培养2 d后菌落表面变得干燥，起皱，中间突起具有伞状缺口，呈火山喷发状，但边缘仍然平整光滑，菌落颜色仍然为白色，见图 2。生防细菌48SJ7-1的生理生化鉴定结果见表 2。通过这些测定，与甲基营养型芽孢杆菌基本一致[14]。
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| 图 2 48SJ7-1菌落特征 Figure 2 The morphology of 48SJ7-1 colony |
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| 试验项目 Test items |
结果 Results |
| 革兰氏染色 Gram stain |
+ |
| 接触酶反应 Catalase |
+ |
| 明胶水解 Gelatin liquefaction |
+ |
| 酪蛋白 Casein |
+ |
| 硝酸盐还原试验 Mannose |
+ |
| 需氧性测定 Aerobic |
+ |
| 淀粉水解 Starch hydrolysis |
+ |
| V-P试验 V.P. test |
− |
| 蔗糖 Sucrose |
+ |
| 葡萄糖 Glucose |
+ |
| 乳糖 Lactose |
+ |
| 甘露糖 Mannose |
+ |
| M.R.试验 M.R. test |
− |
| 柠檬酸盐 Nitrate reduction |
− |
| 注：+：阳性；−：阴性. Note: +: Positive; −: Negative. |
|
从玉米体内分离得到的内生菌经拮抗作用测定，具有较好抑菌效果的菌株48SJ7-1进行了室内盆栽试验，结果见表 3。
| 供试药剂 Tested agents |
使用剂量 Application dose |
出苗后15 d After the emergence of 15 d |
出苗后30 d After the emergence of 30 d |
|||
| 发病率 Disease incidence (%) |
防效 Control effect (%) |
发病率 Disease incidence (%) |
防效 Control effect (%) |
|||
| 48SJ7-1 (1×109 CFU/mL) | 3 mL/株 | 23.63 | 34.39±2.62c | 24.97 | 34.40±2.91c | |
| 5 mL/株 | 13.91 | 60.95±5.03b | 15.58 | 59.14±1.31b | ||
| 7 mL/株 | 11.02 | 69.35±1.55ab | 12.02 | 68.47±1.45a | ||
| 2%戊唑醇悬浮种衣剂 2% tebuconazole FSC |
600 g/100 kg | 9.79 | 72.87±1.66a | 10.55 | 72.28±1.58a | |
| CK | 36.07 | − | 38.11 | − | ||
| 注：表中数据为“平均值±标准差”.同列数据后标不同字母表示经Duncan氏新复极差法检验在5%水平差异显著. note: The data are “x±s”. Different uppercase letters in the same column show significant difference at 5% level by Duncan smultiple range test. |
||||||
从表 3可以看出，通过盆栽试验，接种生防菌48SJ7-1后，各处理都能降低玉米茎基腐病发病率，出苗30 d后，生防菌48SJ7-1 (1×109 cfu/mL 7 mL)的防效为68.47%，与对照药剂2%戊唑醇悬浮种衣剂(600 g/100 kg种子)的防效72.28%差异不显著，随着生防菌使用浓度的增加防效也增加。通过对各处理的表观观察，发现该菌对玉米的长势有明显促进作用，且表观上无药害发生。
3 讨论本实验通过形态学、生理生化以及分子鉴定，确定生防菌48SJ7-1为甲基营养型芽孢杆菌。目前，已发现甲基营养型芽孢杆菌对多种病原菌有防治作用。例如：对黄瓜灰霉病防效最高可达79.8%[18-19]，对黄瓜炭疽病防效最高可达73.7%[20]，对烟草青枯病防效为70.37%[21]，对水稻细菌性条斑病防效为61.8%[22]，对人参锈腐病防效为73.63%[23]，对白菜黑斑病防效为79.08%[24]，对番茄青枯病防效为55.6%[25]。其中由华北制药集团爱诺有限公司生产的用于防治黄瓜灰霉病的甲基营养型芽孢杆菌9912母药和制剂，已于2015年12月31日在我国首获登记[26]。本研究通过抑菌谱实验证明甲基营养型芽孢杆菌48SJ7-1的抑菌范围更广，显示该菌具有作为生防菌的潜力。对比其他同类研究的结果发现，尽管本研究的生防菌剂生防效果显著，但还有待进一步提高，可从菌剂的剂型、使用方法和剂量等方面尝试改进。
有研究表明，甲基营养型芽孢杆菌抑制真菌的活性物质为酯肽类物质[26]。酯肽对真菌的菌丝生长和孢子萌发具有不同程度的抑制作用[27]。相较于化学农药和传统抗生素，脂肽具有对动植物无害、可生物降解及不易产生交叉抗性等优点[26]。
目前，还未发现甲基营养型芽孢杆菌防治玉米茎基腐病的报道。本研究明确了甲基营养型芽孢杆菌对玉米大斑病的防治作用及效果，并对甲基营养型芽孢杆菌的抑菌范围做了初步的确定，扩大了甲基营养型芽孢杆菌作为生防菌的应用范围，为其下一步的发展提供理论基础。同时，本研究也为玉米大斑病的防治提供了新的思路，应用前景广阔。
当前，本研究仅进行了室内盆栽试验，还需要通过田间试验进一步验证该生防菌剂的防治效果。另外，本研究还未就该生防菌的定殖能力、抑菌机制、胞内外抑菌活性物质及生防菌的发酵条件、生防菌剂的剂型等方面做进一步研究，这也是本研究下一步的研究方向。
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