微生物学通报  2017, Vol. 44 Issue (10): 2337−2344

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陈夏林, 李由然, 顾正华, 丁重阳, 张梁, 石贵阳
CHEN Xia-Lin, LI You-Ran, GU Zheng-Hua, DING Zhong-Yang, ZHANG Liang, SHI Gui-Yang
两种L-天冬氨酸α-脱羧酶的表达与酶学性质分析
Expression and characterization of two L-aspartate alpha-decarboxylases
微生物学通报, 2017, 44(10): 2337-2344
Microbiology China, 2017, 44(10): 2337-2344
DOI: 10.13344/j.microbiol.china.170009

文章历史

收稿日期: 2017-01-04
接受日期: 2017-03-22
优先数字出版日期(www.cnki.net): 2017-03-24
两种L-天冬氨酸α-脱羧酶的表达与酶学性质分析
陈夏林1,2, 李由然1,2, 顾正华1,2, 丁重阳1,2, 张梁1,2, 石贵阳1,2     
1. 江南大学 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室    江苏 无锡    214122;
2. 江南大学生物工程学院    江苏 无锡    214122
摘要【目的】 实现单核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)和杰氏棒杆菌(Corynebacterium jeikeium) L-天冬氨酸α-脱羧酶基因在Escherichia coli中异源表达, 纯化重组蛋白并对其进行酶学性质分析。【方法】 依照E. coli的密码子偏好性优化来源于L. monocytotogensC. jeikeiumpanD基因序列。人工合成后以此构建表达载体pET28a(+)-panDL.m和pET28a(+)-panDC.j, 转化E. coli BL21(DE3), 实现panDL.mpanDC.j基因的异源表达。利用亲和层析纯化获得携带组氨酸标签的纯酶后进行酶学性质研究, 并考察底物对酶反应的影响。【结果】 重组菌蛋白电泳分析结果表明, 重组酶PanDL.m和PanDC.j均有自加工功能, 裂解后形成了α亚基和β亚基。重组酶比酶活分别为8.9 U/mg和11.8 U/mg。两种酶的最适反应温度均为60 ℃, 最适pH分别为7.0和6.0, 它们都在30−50 ℃, 酸性条件下较稳定。与目前研究最多的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)来源的PanDC.g相比, PanDL.m受底物天冬氨酸的抑制作用较小。【结论】 PanDL.m和PanDC.j可在高温酸性条件下特异性转化L-天冬氨酸生成β-丙氨酸, 其中PanDL.m受底物的抑制作用较小, 具有一定的工业应用潜力。
关键词L-天冬氨酸α-脱羧酶     β-丙氨酸     单核增生李斯特菌     杰氏棒杆菌     酶学性质    
Expression and characterization of two L-aspartate alpha-decarboxylases
CHEN Xia-Lin1,2, LI You-Ran1,2, GU Zheng-Hua1,2, DING Zhong-Yang1,2, ZHANG Liang1,2, SHI Gui-Yang1,2     
1. National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China;
2. School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China
Received: January 04, 2017; Accepted: March 22, 2017; Published online (www.cnki.net): March 24, 2017
Foundation item: National Natural Science Foundation of China (No. 31401674); The 13th Five-Year National Key Program for Technology Research and Development of China Plan Grant (No. 2016YFD0401400)
*Corresponding author: SHI Gui-Yang, Tel: 86-510-85918229; E-mail: gyshi@jiangnan.edu.cn.
Abstract: [Objective] In this study, two L-aspartate α-decarboxylase genes (panD) from Listeria monocytogenes (panDL.m) and Corynebacterium jeikeium (panDC.j) were expressed in Escherichia coli, respectively, and the recombinant enzymes were purified and characterized. [Methods] The panD genes from L. monocytogenes and C. jeikeium were synthesized and inserted into pET28a(+) to obtain expression plasmids, which was then transformed into E. coli BL21(DE3). PanDL.m and PanDC.jwere functionally expressed and the recombinant enzymes were purified by HisTrapTMaffinity chromatography. Their catalytic properties were characterized and the effects of substrate concentration on enzymatic conversion were studied. [Results] Those α and β subunits were detected by Tricine-SDS-PAGE, indicating that both of the PanDs were processed by self-cleavage. The specific activities were 8.9 U/mg for PanDL.m and 11.8 U/mg for PanDC.j. They exhibited the same optimal temperature at 60 ℃, while they possessed different optimal pH at 7.0 and 6.0, respectively. Both the enzymes were stable at the condition of 30−50 ℃, and pH 4.0−7.0. Compared with the most studied PanD from C. glutamicum, the substrate inhibition effect of the PanDL.m was significantly less. [Conclusion] Under the high temperature and acidic conditions, PanDL.mas well as PanDC.j could specifically transform L-aspartic to β-alanine. PanDL.m could be more appropriate for industrial application because of less substrate inhibition.
Key words: L-aspartate α-decarboxylase     β-Alanine     Listeria monocytogenes     Corynebacterium jeikeium     Enzymatic properties    

L-天冬氨酸α-脱羧酶(L-aspartate-α-decarboxylase, EC4.1.1.11, ADC, PanD), 又称L-天冬氨酸1-脱羧酶, 可催化L-天冬氨酸脱掉α羧基生成β-丙氨酸[1-3]。β-丙氨酸是生物体内合成泛酸的重要前体物质, 是自然界中唯一存在的β型氨基酸, 是一种非蛋白氨基酸。β-丙氨酸及其衍生物广泛应用于医药、美容、食品、饲料及化工等领域, 市场需求量呈日渐上升趋势[4]。相较于国内外目前采用的化学合成法[5-6], 利用PanD生物转化L-天冬氨酸生产β-丙氨酸具有工艺简单、纯化方便、绿色无污染的特点, 具有十分明显的经济和社会效益[7]

PanD主要存在于细菌、古细菌、放线菌等低等生物中, 可分为丙酮酰基团依赖型和磷酸吡哆醛依赖型两类。与后者相比, 前者具有明显的优势, 其催化能力依赖自加工形成的丙酮酰基团, 无需外源辅助因子, 且催化特异性高, 因此更具工业应用前景。PanD合成时, 最初转录翻译成无活性的原酶, 随后在Gly24-Ser25处发生裂解, 水解生成N端带有丙酮酰基团的α亚基和C端带有羟基的β亚基, 该丙酮酰基团即为酶催化的关键位点[8-9]

酶转化反应中最关键的是生物催化剂(酶)的开发, 微生物的多样性为生物转化提供了更广阔的发展空间。NCBI数据库中已报道的panD基因有761种, 但目前的研究主要集中在大肠杆菌(Escherichia coli)[10]、结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)[11]、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)[12]、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)[13]、钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)[14]和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[7], 而实际适合开发酶制剂的只有后3种。其中PanDB.s的酶活最高为8.4 U/mg, PanDC.g酶学性质的相关报道最多, 最适反应温度为55 ℃, 最适pH为6.0, 在低于37 ℃, pH 4.0−7.0稳定性较好。现有的PanD在催化过程中都存在一定程度的底物依赖性失活现象[10, 15], 这是限制其工业应用的关键性因素。已有的研究中, 尝试通过定点突变[16]、固定化作用[10]改变酶的性能, 但未见显著成果。因此挖掘新的panD基因来源并研究其特性对酶法合成β-丙氨酸具有重要的研究意义和工业价值。本文选择单核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)和杰氏棒杆菌(Corynebacterium jeikeium)来源的panD基因为研究对象, 首次实现了这两个基因的异源表达, 并对其酶学性质及底物抑制情况进行了比较分析, 为生物转化生产β-丙氨酸的工业应用提供了科学依据。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 目的基因、菌种及质粒: 研究中所用panD基因由苏州金唯智生物科技有限公司合成; E. coli BL21(DE3)、E. coli BL21(DE3)-panDC.g (携带有C. glutamicum来源的panD基因)和质粒pET-28a(+)均为本实验室保藏。

1.1.2 主要试剂、仪器和培养基: 限制性内切酶Nde Ⅰ、Hind Ⅲ、标准分子量蛋白购自Fermentas公司; T4 DNA连接酶、DNA marker购自TaKaRa公司; 卡那霉素购自生工生物工程(上海)股份有限公司; 质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司; Sepharose His trap HP购自美国GenScript公司; 其他试剂为国产分析纯。核酸电泳仪、Bio-Rad 525BR蛋白电泳仪购自美国Bio-Rad公司; 蛋白纯化仪AKTA Avant 25购自GE Healthcare公司; 高效液相色谱仪Agilent 1260购自美国Agilent公司。LB和TB培养基见参考文献[13]。

1.2 方法

1.2.1 重组菌E. coli DE3/pET28a(+)-panD的构建: 从NCBI上查阅并筛选获得L. monocytogenesC. jeikeium来源的panD序列, 由苏州金唯智生物科技有限公司合成。基因序列按照E. coli密码子偏好性进行优化, 5′端添加CATATG (引入酶切位点Nde Ⅰ), 3′端去除终止密码子后加AATTGC (引入酶切位点Hind Ⅲ), 在蛋白N端和C端加上His-tag。基因合成后连接载体pUC57-simple, 获得pUC57-panD。提取pUC57-panD质粒, 用Nde Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切, 经琼脂糖凝胶电泳鉴定、回收、纯化后, 用T4 DNA连接酶连接到同样经过Nde Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切的pET28a(+)载体上, 构建重组表达载体pET28a(+)-panD, 将重组质粒转化到E. coli BL21(DE3)感受态细胞中, 选取卡那平板上阳性转化子提取质粒酶切验证, 得到重组菌E. coli BL21(DE3)/pET28a(+)-panD, 并保存于甘油管中。

1.2.2 重组蛋白的诱导表达: 从甘油管中接10 μL菌体至20 mL含50 mg/L卡那霉素的LB培养基中, 37 ℃、200 r/min培养8 h, 取2 mL菌液转接至50 mL含50 mg/L卡那霉素的TB培养基中, 37 ℃、200 r/min培养, 2 h后加入25 μl异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG, 1 mol/L), 20 ℃、200 r/min培养16 h。发酵结束后收集菌体, 超声破碎, 通过Tricine-SDS-PAGE分析鉴定重组蛋白。Tricine-SDS-PAGE分析方法参见文献[17]。

1.2.3 重组蛋白的纯化: 用结合缓冲液A (20 mmol/L Na2HPO4·12H2O、20 mmol/L NaH2PO4·2H2O、500 mmol/L NaCl、100 mmol/L咪唑, pH 7.4)洗涤菌体2次, 加入5 mL结合缓冲液A, 振荡混匀后测OD600, 稀释OD至10后破碎, 破1 s停2 s, 破碎时间5 min, 破碎液于4 ℃、12 000 r/min离心20 min, 取上清, 即为粗酶液。Sepharose His trap HP用结合缓冲液A平衡后上样, 再平衡, 洗脱缓冲液B (20 mmol/L Na2HPO4·12H2O、20 mmol/L NaH2PO4·2H2O、500 mmol/L NaCl、500 mmol/L咪唑, pH 7.4)洗脱, 收集的洗脱液为纯酶液, 用Tricine-SDS-PAGE分析。采用Bradford法测定蛋白质浓度。

1.2.4 酶活的测定: 酶活定义:在37 ℃, pH 7.0的条件下, 每分钟转化产生1 μmol β-丙氨酸所需要的酶量为一个酶活单位U (μmol/min)。

酶活的测定方法: 2.5 mL转化体系中, 将0.5 mg的酶与磷酸缓冲液(20 mmol/L Na2HPO4·12H2O, 20 mmol/L NaH2PO4·2H2O, pH 7.0)混合, 37 ℃预热20 min, 加入同样预热过的终浓度100 mmol/L的L-天冬氨酸(pH 7.0, NaOH溶解)进行转化反应, 反应20 min, 煮沸20 min灭活, 1 000 r/min离心20 min, 取上清保存, 用邻苯二甲醛(OPA)衍生β-丙氨酸, 使用HPLC检测衍生后β-丙氨酸含量[18]

1.2.5 重组酶最适温度及热稳定性测定: 将重组酶分别置于30、37、45、55、60、65、70、80 ℃下反应20 min, 测定酶活, 以确定最适反应温度。将酶分别在以上温度放置12 h, 然后在37 ℃条件下测定酶活, 比较酶在不同温度条件下的稳定性。

1.2.6 重组酶最适pH及pH稳定性: 将0.5 mg重组酶分别加入20 mmol/L pH 4.0、5.0、6.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、20 mmol/L pH 6.5、7.0、7.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液及20 mmol/L pH 8.0、9.0的Tris-盐酸缓冲液中, 再加入166 μL的L-天冬氨酸(200 g/L, pH 7.0, NaOH溶解), 37 ℃反应20 min, 测酶活, 以确定最适反应pH。将酶分别置于以上缓冲液中, 37 ℃放置12 h, 然后测酶活, 比较酶在不同pH条件下的稳定性。

1.2.7 底物L-天冬氨酸对PanD的抑制作用: 实验组取5 mg酶(PanD)加入到含有100 g/L的L-天冬氨酸和20 mmol/L的磷酸缓冲液(pH 7.0)的5 mL反应体系中, 37 ℃反应1 h, 用Ni柱回收酶, 取回收后的酶测酶活, 对照组底物浓度为0 g/L。

1.2.8 重组酶的转化实验: 用pH 7.0磷酸缓冲液配制终浓度为100 mmol/L的L-天冬氨酸底物50 mL, 加入10 mg的重组酶, 37 ℃、200 r/min反应24 h, 测β-丙氨酸转化率。

2 结果与分析 2.1 PanD氨基酸序列分析及密码子优化

研究中的PanDC.j和PanDL.m氨基酸序列和目前报道较多的PanD的氨基酸序列进行比对, 从图 1可以看出, 这几个氨基酸序列相似程度较低, 仅有59.91%, 其中严格保守的残基有Lys9、His11、Arg12、Thr16、Ala18、Leu20、Tyr22、Gly24、Ser25、Ile28、Asp29、Ile46、Asn51、Gly52、Arg54、Thr57、Tyr58、Ile60、Ile69、Asn71、Gly72、Ala73、Ala74、Ala75、Gly81、Asp82、Val84、Ile85和Asn111, 高度保守位点较多。这些酶的自加工位点均为Gly24-Ser25键, 有研究表明Arg3、Arg54、Thr57、Tyr58可能与PanD自加工和催化活性有关[19], Arg54可能与PanD的底物特异性有关, Lys9可能对底物的α羧基的去质子化起到保护作用。PanD的来源不同, 其PanD氨基酸序列差异也较大, 这可能是导致其酶活与酶学性质差异的原因。

图 1 8种不同来源的PanD氨基酸序列对比 Figure 1 Amino acid sequence alignment of 8 PanDs 注: 8种PanD的GenBank登录号: M. tuberculosis (NP_218118.1)、C. jeikeium (WP_011273004.1)、C. glutamicum (NP_599388.1)、H. pylori (NP_206836.1)、B. subtilis (NP_390122.1)、L. monocytogenes (NP_465424.1)、S. enterica (NP_459185.1)、E. coli (NP_414673.1);严格保守残基用黑色框出, 自加工位点用三角标出. Note: Reference sequence of 8 PanDs: M. tuberculosis (NP_218118.1), C. jeikeium (WP_011273004.1), C. glutamicum (NP_599388.1), H. pylori (NP_206836.1), B. subtilis (NP_390122.1), L. monocytogenes (NP_465424.1), S. enterica (NP_459185.1), E. coli (NP_414673.1); Strictly conserved residues are boxed in black and the self-processing site is marked by a triangle.

根据E. coli所偏爱的密码子对panDL.mpanDC.j基因进行密码子优化, (G+C)%含量分别由45.7%和49.3%变成54.18%和54.67%, 氨基酸未发生改变。人工合成的序列经克隆连接载体pUC57-simple, 获得pUC57-panD

2.2 重组菌的构建

将pUC57-panD质粒用Nde Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切, 经琼脂糖凝胶电泳鉴定、回收、纯化后获得panD序列, 长度均在400 bp左右, 与理论值一致。将目的基因序列连接到pET28a(+) T7启动子下游, 获得重组质粒pET28a(+)-panD, 将上述重组质粒转化到E. coli BL21(DE3)感受态细胞中, 获得重组菌E. coli BL21(DE3)/pET28a(+)-panD。双酶切验证, 均得到了400 bp左右的目的条带(图 2), 说明外源基因已经成功连接到表达载体上。

图 2 重组载体pET28a(+)-panD酶切验证 Figure 2 The enzymatic digestion of pET28a(+)-panD 注: M1: DL15000 DNA marker; M2: DL2000 DNA marker; 1−2: Nde Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切重组载体pET28a(+)-panDL.m和pET28a(+)-panDC.j. Note: M1: DL15000 DNA marker; M2: DL2000 DNA marker; 1−2: Recombinant plasmid pET28a(+)-panDL.mand pET28a(+)-panDC.j digested by Nde Ⅰ and Hind Ⅲ.
2.3 重组酶的诱导表达与纯化

重组菌E. coli BL21(DE3)/pET28a(+)-panD经IPTG诱导16 h后, 超声破碎, 离心后取上清, 经Tricine-SDS-PAGE电泳检验, 图 3显示, 重组菌均成功表达了异源的PanD, 条带分析结果显示, 表达量均达到60%以上。这两组重组酶的自剪切类型与PanDC.g相同, 均不需要孵育, 可自加工裂解成α亚基与β亚基。破碎得到的上清液, 用His Trap HP镍柱纯化。Tricine-SDS-PAGE电泳验证结果如图 3所示, 均获得了较纯的目的蛋白, 可用于进一步研究。重组酶纯酶PanDL.m和PanDC.j在常规的酶活测定条件下(37 ℃, pH 7.0), 比酶活分别为8.9 U/mg和11.8 U/mg。

图 3 重组菌E. coli BL21(DE3)/pET28a(+)-panD表达产物的Tricine-SDS-PAGE电泳分析 Figure 3 The Tricine-SDS-PAGE analysis of expression product in recombinant strain 注: M:标准蛋白Marker; 1−3:重组菌BL21(DE3)/pET28a(+)-panDL.m、BL21(DE3)/pET28a(+)-panDC.j和BL21(DE3)/pET28a(+)细胞破碎上清; 4, 5:纯化后的重组蛋白PanDL.m和PanDC.j. Note: M: Standard protein marker; 1−3: The centrifugated supernatant of the recombinant BL21(DE3)/pET28a(+)-panDL.m, BL21(DE3)/pET28a(+)-panDC.j and BL21(DE3)/pET28a(+); 4, 5: Purified PanDL.m and PanDC.j.
2.4 重组酶最适温度及热稳定性

温度对两种PanD的酶活影响如图 4A所示, 两者都在60 ℃时达到最高酶活, 分别为10.9 U/mg和14.5 U/mg。随着温度的升高, PanD酶活均呈现先升高后降低的趋势。各温度下PanDC.j酶活均比PanDL.m高, 对温度变化也更敏感。从重组酶的热稳定性实验结果图 4B可以看出, 酶在设定的温度条件下放置12 h, 酶活均有一定程度的损失, 温度越高酶活损失越快。50–65 ℃范围内, PanDL.m较PanDC.j稳定, 当温度达到80 ℃, 两者的酶活基本完全丧失。

图 4 温度对酶活力的影响(A)及酶的热稳定性(B) Figure 4 Effect of reaction temperature on PanD activity (A) and thermal stability of the enzyme (B)
2.5 重组酶最适pH及pH稳定性

PanDL.m和PanDC.j的最适pH和pH稳定性实验结果如图 5A图 5B所示, 随着pH的增加, 两者的酶活均呈现先增后降的趋势, 都在酸性条件下比较稳定。PanDL.m适合在中性或酸性环境下作用, 最适pH为7.0, 当pH大于7.5时, 酶活迅速降低。PanDC.j可以在较宽的pH范围条件下作用, 最适pH为pH 6.0, 此时稳定性也最好, 酶活仅损失21%。

图 5 pH对酶活力的影响(A)和酶的pH稳定性(B) Figure 5 Effect of reaction pH on PanD activity (A) and pH stability of the enzyme (B)
2.6 底物对PanD的抑制作用

丙酮酰依赖型PanD在有底物L-天冬氨酸存在时, 催化位点丙酮酰基团与磷酸吡哆醛辅因子作用相似, 可与底物共价结合形成席夫碱[2], 促进底物脱羧, 最终产生β-丙氨酸, 但此过程中酶会发生自杀式的转氨作用, 发生底物依赖性失活现象[10, 15]。本研究中PanD酶与底物反应后, 通过Ni柱再次纯化回收PanD酶, 并去除L-天冬氨酸和反应产生的β-丙氨酸。对比PanDL.m、PanDC.j和目前研究较多的PanDC.g与底物反应前后酶活(图 6), 发现酶与底物反应后皆呈现出不同程度的失活现象, 分别损失了11%、43%和16%, 其中底物对PanDL.m的抑制作用最弱。

图 6 底物对酶活力的影响 Figure 6 Effect of substrate on PanDs activity
2.7 重组酶的转化实验

转化反应过程中每隔1 h取样, 测定底物的转化率, 结果如图 7所示。不同目的基因来源的PanD对L-天冬氨酸的转化结果不同。反应前4 h, 底物的转化率均迅速增长, 但随后底物转化率的增长变得缓慢, 这可能与底物对酶的不可逆抑制作用有关。反应24 h时, PanDL.m、PanDC.j和PanDC.g三者对底物的转化率分别为67.7%、82.2%和58.0%, PanDL.m和PanDC.j对底物的转化率明显高于PanDC.g, 值得进一步研究应用于工业生产。

图 7 L-天冬氨酸的转化率 Figure 7 The conversion ratio of L-Asp
3 结论与讨论

PanD作为泛酸合成途径中的重要调控酶, 可作为一些病原微生物的药物靶细胞, 如H. pyloriM. tuberculosis, 是一种潜在的抗菌剂[2, 20]。在工业领域, PanD主要用于特异性催化L-天冬氨酸生成β-丙氨酸, 可将从多肽藻青素获得的大量L-天冬氨酸转化成更高价值的β-丙氨酸, 还可用于手性拆分制备D-天冬氨酸和β-丙氨酸[10, 21]。目前有关PanD的研究主要集中于少数几种来源的PanD酶的结构解析和自剪切机理方面, 很少关注PanD的酶学性质, 而更多来源的PanD的酶学特性尚不清楚, 有待研究者的开发。

本研究选择L. monocytogenesC. jeikeium来源的PanD在E. coli中表达, 并对酶学性质进行了初步分析。PanDL.m和PanDC.j在普通测定条件下, 酶活分别达到了8.9 U/mg和11.8 U/mg, 高于现有报道PanD酶活[7]。两种酶催化反应适宜的温度及pH范围与现有的C. glutamicum来源的PanD无明显不同, 对底物的转化率分别为67.7%和82.2%, 明显高于PanDC.g, 为工业化应用奠定了基础。在实验过程中, 我们发现这两种重组酶的热稳定性并不是很好, 其中PanDC.j对温度尤为敏感, 后期可能需要优化反应条件与反应体系, 或从分子水平上对其进行改造, 提高酶反应的稳定性。同时, 我们也发现PanDL.m和PanDC.j与其他丙酮酰依赖型PanD相同, 在转化过程中也存在不同程度的底物依赖性失活现象。虽然PanDL.m酶活损失程度相对较低, 有助于提升β-Ala生物转化的效率, 但是目前这种不可逆的失活现象的机理研究并不透彻, 需要深入的研究, 从根本上解决PanD的底物依赖性失活问题, 这对于PanD转化L-天冬氨酸生产β-丙氨酸具有重要的意义。

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