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文章信息
- 陈凯, 李纪顺, 王贻莲, 李玲, 扈进冬, 魏艳丽, 赵忠娟, 杨合同
- CHEN Kai, LI Ji-Shun, WANG Yi-Lian, LI Ling, HU Jin-Dong, WEI Yan-Li, ZHAO Zhong-Juan, YANG He-Tong
- 洞庭湖湿地木霉多样性及生防活性
- Species diversity and biocontrol activity of Trichoderma in Dongting Lake wetland
- 微生物学通报, 2017, 44(10): 2307-2320
- Microbiology China, 2017, 44(10): 2307-2320
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.170021
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文章历史
- 收稿日期: 2017-01-09
- 接受日期: 2017-04-20
- 优先数字出版日期(www.cnki.net): 2017-05-09
木霉Trichoderma Pers.是世界性分布真菌,主要存在于土壤、腐烂的木材及杂草中,因其在工业酶制剂、抗生素及生物防治等方面的应用价值而得到广泛关注和研究[1-2]。目前该属真菌已知250余种(http://www.indexfungorum.org、http://www.isth.info/tools/molkey/index.php)[3],国内近几年也展开了木霉属资源和系统分类研究,已知木霉属真菌的数量迅速增长,截止2016年共有中国新记录种117种[4-7],充分展示了我国该类群丰富的物种多样性。
洞庭湖位于中国湖南省北部,北纬27东经111之间,是中国第二大淡水湖,周边的湿地是一个处于动态变化中的海陆过渡带,具有极其丰富的生物资源,是珍贵的自然资源,也是重要的生态系统,具有不可替代的综合功能。但目前对洞庭湖微生物资源的研究较少,特别是木霉的研究更为欠缺。因此,系统开展其生境中木霉的遗传及生物多样性研究,可进一步丰富木霉的菌种资源,扩展木霉的应用空间,更有效地服务于工农业生产。
1 材料与方法 1.1 供试菌株供试植物病原真菌:立枯丝核菌Rhizoctonia solani、终极腐霉Pythium ultimum、尖孢镰孢Fusarium oxysporum、灰葡萄孢Botrytis cinerea,均为本实验室保藏。
1.2 培养基、主要试剂和仪器菌株培养与分离培养基为PDA和PDAm,4种水解酶活性测定培养基为葡聚糖酶培养基、蛋白酶培养基、纤维素酶培养基及几丁质酶培养基[8],上述培养基于0.1 MPa灭菌20 min后备用。
Fungal DNA Mini Kit试剂盒,OMEGA公司;TaKaRa TaqTM聚合酶,宝生物工程(大连)有限公司。CX31显微镜,Olympus公司;MyCycler PCR仪,Bio-Rad公司;GenoSens 1880凝胶成像分析系统,上海勤翔科学仪器有限公司。
1.3 样品采集于2015年4月沿洞庭湖湿地采集土样和水样,水样直接用干净的塑料瓶盛取约50 mL,封口保存;土样采用五点采样法,首先在采集地块的对角线选5等分点,然后去掉表层土1−2 cm,用深度25 cm的采土器在每点采取深度20 cm左右的土样,再将5份土混合均匀,取500 g装入干净自封袋中封好。选择52个采样点,采集土样52份,水样18份。
1.4 菌种分离称取10 g土样,倒入100 mL灭菌生理盐水中,25 ℃摇床振荡1 h,进行梯度稀释,每稀释度取1 mL放入平板中,加入45 ℃左右的PDAm混匀,25℃培养7−14 d。对于水样,直接取1 mL混入培养基中。待木霉长出后,挑取不同形态的木霉菌落转接PDA平板,25℃培养,并经单孢纯化后保存备用。
1.5 种类鉴定主要利用ITS序列比对分析结合形态特征进行种类鉴定[9]。利用Fungal DNA Mini Kit试剂盒提取木霉基因组DNA,采用引物ITS1-F/ITS4进行扩增[10],PCR产物交生工生物工程(上海)股份有限公司测序,结果提交NCBI (https://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi)和ISTH (http://www.isth.info/tools/molkey/index.php)网站进行比对分析。在PDA平板上25℃培养单孢纯化的各木霉菌株,定期观察菌株的平板形态和分生孢子梗分枝等特征,通过综合分析确定菌株的种类。
1.6 系统发育进化分析选取部分代表菌株的ITS序列(单倍型),利用MEGA 6.0构建系统发育进化树,采用邻接法Neighbor-Joining,分析模型Kimura 2-parameter model和Gamma Distributed,自展数据集Bootstrap replications为1 000次。
1.7 生物学功能评价 1.7.1 平板抑菌实验: PDA平板直径两端距中心35 mm处分别接种直径5 mm的木霉菌株和病原真菌,以只接种病原真菌为对照,25 ℃培养3−5 d,记录病原真菌对峙方向生长半径,计算抑制率(%)。抑制率(%)=100%×(对照病菌生长半径−处理病菌生长半径)/对照病菌生长半径。
1.7.2 水解酶活性检测: 选取1.7.1中抑制率效果较好的木霉菌株进行酶活检测。主要检测蛋白酶、纤维素酶、β-1, 3-葡聚糖酶及几丁质酶的活性大小。配制各水解酶活性检测培养基平板,平板中央接种直径5 mm的木霉菌株培养物,25℃培养6 d,记录水解带宽度。 1.7.3 灰色关联度分析: 利用灰色关联度分析法对初筛得到的木霉菌株进行综合评价[11-12]。视所有供试菌株为一个灰色系统,每一菌株都是系统中的一个元素。以“参考菌株”各项性状指标构成的数列作为参考数列x0,以供试菌株各项性状指标构成的数列作为比较数列xi (i=1、2、3……),将参考数列x0与比较数列xi进行量化后比较,由二者的相似程度来判断二者的关联度(ri),关联度越大,综合效果越好。具体的分析步骤如下:确定参考菌株:根据生防木霉菌株的测定性状确定生防木霉菌株的理想值组成参考菌株。
数据的无量化处理:由于各性状量纲不一致,因此需要在分析之前将原始数据进行无量纲化处理,常用的方法有初值化和均值化等,本研究采用初值化方式进行处理。
计算关联系数ξi(k):公式为ξi(k)=(Δmin+Δmaxk)/ [Δtij(tk)+Δmaxk],其中Δmin=miniminj|xi(tk)–xj(tk)|,Δmax=maximaxj|xi(tk)–xj(tk)|。
计算关联度ri:公式为ri=Σξi(k)×ωj,其中ri为比较数列xi与参考数列x0的关联度,ωj是j个性状的加权系数。
2 结果与分析 2.1 木霉菌株分离结果从洞庭湖湿地采集的52个土样和18个水样中,共分离到114株木霉,菌株鉴定种类及登录信息等见表 1。供试的52个土样中,有50个土样中分离到了木霉菌株,检出率为96.2%;18个水样中,有9个水样中分离到了木霉菌株,检出率为50.0%。将各个种中ITS区域完全相同的菌株命名为1个单倍型,共得到52个单倍型。
样品号 Sample No. |
菌株号 Strains |
登录号 GenBank accession No. |
种类 Species |
来源 Source |
经纬度 Longitude/Latitude |
单倍型 Allelic group |
1 | QT21984 | KY209917 | T.asperellum | 禾本科菵草/土 | E113 8'34" /N29 26'15" | AP2* |
1 | QT22040 | KY209918 | T. longibrachiatum | 禾本科菵草/土 | E113 8'34" /N29 26'15" | LB1* |
1 | QT21969 | KY209915 | T. harzianum | 禾本科菵草/水 | E113 8'34" /N29 26'15" | HZ1 |
1 | QT21970 | KY209916 | T. atroviride | 禾本科菵草/水 | E113 8'34" /N29 26'15" | AV1* |
2 | QT21987 | KY209920 | T. crassum | 菊科马兰头/水 | E113 6'9" /N29 24'3" | CR1* |
2 | QT21988 | KY209921 | T. virens | 菊科马兰头/土 | E113 6'9" /N29 24'3" | VE4* |
2 | QT22069 | KY209919 | T. atroviride | 菊科马兰头/水 | E113 6'9" /N29 24'3" | AV1 |
3 | TW21990 | KY209922 | T. harzianum | 禾本科双穗雀稗/土 | E113 6'9" /N29 24'3" | HZ1* |
3 | TW21990-1 | KY189312 | Trichoderma sp. | 禾本科双穗雀稗/土 | E113 6'9" /N29 24'3" | SP1* |
3 | QT21993 | KY209923 | T. capillare | 禾本科双穗雀稗/土 | E113 6'9" /N29 24'3" | CP1* |
4 | QT21995 | KY209924 | T. saturnisporum | 豆科南苜蓿/土 | E113 6'9" /N29 24'3" | ST1 |
4 | QT21996 | KY225594 | T. virens | 豆科南苜蓿/土 | E113 6'9" /N29 24'3" | VE4 |
5 | QT21998 | KY225596 | T. asperellum | 豆科大巢菜/土 | E113 3'23" /N29 26'35" | AP1 |
5 | QT22000 | KY225597 | T. harzianum | 豆科大巢菜/土 | E113 3'23" /N29 26'35" | HZ1 |
5 | QT22001 | KY225598 | T. saturnisporum | 豆科大巢菜/土 | E113 3'23" /N29 26'35" | ST2* |
5 | QT21973 | KY225595 | T. harzianum | 豆科大巢菜/水 | E113 3'23" /N29 26'35" | HZ3 |
6 | QT22002 | KY225599 | T. asperellum | 豆科大巢菜、禾本科双穗雀穗/土 | E113 3'23" /N29 26'35" | AP1 |
6 | QT22003 | KY225600 | T. harzianum | 豆科大巢菜、禾本科双穗雀穗/土 | E113 3'23" /N29 26'35" | HZ3 |
6 | QT22004 | KY225601 | T. saturnisporum | 豆科大巢菜、禾本科双穗雀穗/土 | E113 3'23" /N29 26'35" | ST1 |
7 | QT22006 | KY225602 | T. virens | 蓼科羊蹄/土 | E113 5'58" /N29 26'12" | VE1 |
7 | QT22007 | KY225603 | T. koningiopsis | 蓼科羊蹄/土 | E113 5'58" /N29 26'12" | KN2 |
8 | QT22008 | KY225604 | T. brevicompactum | 禾本科马唐/土 | E113 5'58" /N29 26'12" | BV1 |
8 | QT22010 | KY225605 | T. atroviride | 禾本科马唐/土 | E113 5'58" /N29 26'12" | AV1 |
8 | QT22013 | KY225606 | T. saturnisporum | 禾本科马唐/土 | E113 5'58" /N29 26'12" | ST1* |
9 | QT22045 | KY225607 | T. virens | 玄参科通泉草、莎草科莎草/土 | E113 2'51" /N29 24'20" | VE1 |
9 | QT22046 | KY225608 | T. asperellum | 玄参科通泉草、莎草科莎草/土 | E113 2'51" /N29 24'20" | AP5* |
10 | KY22016 | KY225609 | T. virens | 杨柳科柳树/土 | E113 0'32" /N29 21'34" | VE4 |
11 | QT22047 | KY225610 | T. hamatum | 伞形科天胡荽/土 | E113 0'32" /N29 21'34" | HM4* |
12 | HB22049 | KY225611 | T. asperellum | 禾本科竹/土 | E113 0'32" /N29 21'34" | AP3* |
12 | HB22052 | KY225612 | T. koningiopsis | 禾本科竹/土 | E113 0'32" /N29 21'34" | KN4* |
13 | QT22017 | KY225613 | T. saturnisporum | 玄参科通泉草/土 | E113 0'32" /N29 21'34" | ST3* |
13 | QT22019 | KY225614 | T. koningiopsis | 玄参科通泉草/土 | E113 0'32" /N29 21'34" | KN3* |
14 | QT22021 | KY225615 | T. koningiopsis | 禾本科双穗雀稗、豆科大巢菜/土 | E113 0'32" /N29 21'34" | KN4 |
14 | QT22053 | KY225616 | T. harzianum | 禾本科双穗雀稗、豆科大巢菜/土 | E113 0'32" /N29 21'34" | HZ5* |
15 | HB22055 | KY225618 | T. hamatum | −/土 | E113 0'28" /N29 23'3" | HM1 |
15 | HB22075 | KY225619 | T. hamatum | −/土 | E113 0'28" /N29 23'3" | HM1* |
15 | HB22070 | KY225617 | T. harzianum | −/土 | E113 0'28" /N29 23'3" | HZ3* |
16 | KY22056 | KY225620 | T. erinaceum | 杨柳科杨树/土 | E112 49'10" /N29 30'53" | EN2* |
16 | KY22057 | KY225621 | T. brevicompactum | 杨柳科杨树/土 | E112 49'10" /N29 30'53" | BV1 |
17 | QT22022 | KY225622 | T. virens | −/土 | E112 49'10" /N29 30'53" | VE1* |
18 | QT22024 | KY225626 | T. virens | 莎草科莎草/土 | E112 49'10" /N29 30'53" | VE3 |
18 | QT22025 | KY225627 | T. asperellum | 莎草科莎草/土 | E112 49'10" /N29 30'53" | AP3 |
18 | QT21977 | KY225623 | T. pleuroticola | 莎草科莎草/水 | E112 49'10" /N29 30'53" | PU1* |
18 | QT21978 | KY225624 | T. atroviride | 莎草科莎草/水 | E112 49'10" /N29 30'53" | AV2* |
18 | QT21979 | KY225625 | T. harzianum | 莎草科莎草/水 | E112 49'10" /N29 30'53" | HZ1 |
19 | SC22026 | KY225630 | T. erinaceum | 十字花科油菜/土 | E112 46'8" /N29 27'44" | EN1* |
19 | SC22027 | KY225631 | T. brevicompactum | 十字花科油菜/土 | E112 46'8" /N29 27'44" | BV1 |
19 | SC21982 | KY225628 | T. harzianum | 十字花科油菜/水 | E112 46'8" /N29 27'44" | HZ6 |
19 | SC21983 | KY225629 | T. hamatum | 十字花科油菜/水 | E112 46'8" /N29 27'44" | HM2* |
20 | QT22028 | KY225632 | T. virens | 豆科南苜蓿、伞形科蛇床/土 | E112 46'8" /N29 27'44" | VE5* |
20 | QT22060 | KY225633 | T. harzianum | 豆科南苜蓿、伞形科蛇床/土 | E112 46'8" /N29 27'44" | HZ6 |
21 | SC22030 | KY225634 | T. virens | 十字花科油菜/土 | E112 44'17" /N29 24'50" | VE1 |
24 | QT22066 | KY225636 | T. capillare | 豆科大巢菜、禾本科双穗雀稗、莎草科莎草/土 | E112 42'55" /N29 11'13" | CP2* |
24 | QT22071 | KY225635 | T. harzianum | 豆科大巢菜、禾本科双穗雀稗、莎草科莎草/水 | E112 42'55" /N29 11'13" | HZ6 |
25 | QT22032 | KY225637 | T. brevicompactum | 禾本科稗草、莎草科莎草/土 | E112 42'55" /N29 11'13" | BV1 |
25 | QT22033 | KY225638 | T. harzianum | 禾本科稗草、莎草科莎草/土 | E112 42'55" /N29 11'13" | HZ4* |
26 | TW22035 | KT792972 | T. ghanense | 禾本科水稻/土 | E112 42'8" /N29 7'34" | GA1* |
26 | QT22036 | KY225639 | T. harzianum | 禾本科水稻/土 | E112 42'8" /N29 7'34" | HZ4 |
27 | SC22038 | KY225640 | T. saturnisporum | 豆科蚕豆/土 | E112 41'56" /N29 6'36" | ST1 |
27 | SC22068 | KY225641 | T. koningiopsis | 豆科蚕豆/土 | E112 41'56" /N29 6'36" | KN1 |
28 | QT22076 | KY225642 | T. harzianum | 禾本科双穗雀稗/土 | E112 41'56" /N29 6'36" | HZ6 |
29 | QT22077 | KY225643 | T. erinaceum | −/土 | E112 42'59" /N29 3'45" | EN1 |
30 | QT22079 | KY225644 | T. erinaceum | 菊科牛蒡/土 | E112 42'59" /N29 3'45" | EN3* |
31 | QT22087 | KY225645 | T. erinaceum | 唇形科益母草/土 | E112 42'59" /N29 3'45" | EN4* |
32 | SD22088 | KY225647 | T. koningiopsis | 禾本科水稻/土 | E112 47'37" /N29 0'5" | KN2* |
32 | SD22090 | KY225648 | T. pleuroticola | 禾本科水稻/土 | E112 47'37" /N29 0'5" | PU2* |
32 | SD22073 | KY225646 | T. atroviride | 禾本科水稻/水 | E112 47'37" /N29 0'5" | AV4* |
33 | QT22092 | KY225649 | T. harzianum | 牻牛儿苗科牻牛儿苗、豆科大巢菜、禾本科稗草/土 | E113 5'40" /N29 23'2" | HZ1 |
33 | QT22093 | KY225650 | T. hamatum | 牻牛儿苗科牻牛儿苗、豆科大巢菜、禾本科稗草/土 | E113 5'40" /N29 23'2" | HM5 |
34 | QT22094 | KY225651 | T. ovalisporum | 莎草科莎草/土 | E113 5'40" /N29 23'2" | OL1* |
34 | QT22095 | KY225652 | T. harzianum | 莎草科莎草/土 | E113 5'40" /N29 23'2" | HZ3 |
34 | QT22096 | KY225653 | T. saturnisporum | 莎草科莎草/土 | E113 5'40" /N29 23'2" | ST1 |
35 | QT22098 | KY225654 | T. harzianum | −/土 | E113 5'40" /N29 23'2" | HZ3 |
35 | QT22099 | KY225655 | T. capillare | −/土 | E113 5'40" /N29 23'2" | CP1 |
36 | QT22104 | KY225656 | T. asperellum | 蓼科酸模叶蓼/土 | E113 5'7" /N29 21'1" | AP6* |
37 | QT22107 | KY225657 | T. virens | −/土 | E113 5'7" /N29 21'1" | VE2* |
38 | QT22110 | KY225658 | T. asperellum | 莎草科莎草/土 | E113 5'7" /N29 21'1" | AP4* |
38 | QT22111 | KY225659 | T. longibrachiatum | 莎草科莎草/土 | E113 5'7" /N29 21'1" | LB1 |
39 | QT22112 | KY225660 | T. asperellum | 豆科南苜蓿/土 | E113 5'7" /N29 21'1" | AP1 |
39 | QT22115 | KY225661 | T. virens | 豆科南苜蓿/土 | E113 5'7" /N29 21'1" | VE3 |
40 | SC22119 | KY225662 | T. atroviride | 十字花科萝卜/土 | E113 5'7" /N29 21'1" | AV5* |
41 | QT22121 | KY225663 | T. hamatum | 禾本科稗草/土 | E113 5'8" /N29 18'10" | HM3* |
41 | QT22122 | KY225664 | T. virens | 禾本科稗草/土 | E113 5'8" /N29 18'10" | VE4 |
41 | QT22124 | KY225665 | T. harzianum | 禾本科稗草/土 | E113 5'8" /N29 18'10" | HZ3 |
42 | QT22125 | KY225666 | T. hamatum | 莎草科莎草/土 | E113 5'8" /N29 18'10" | HM6* |
42 | QT22126 | KY225667 | T. asperellum | 莎草科莎草/土 | E113 5'8" /N29 18'10" | AP4 |
43 | QT22128 | KY225668 | T. saturnisporum | 蓼科酸模叶蓼/土 | E113 5'8" /N29 18'10" | ST2 |
43 | QT22130 | KY225669 | T. hamatum | 蓼科酸模叶蓼/土 | E113 5'8" /N29 18'10" | HM5 |
43 | QT22131 | KY225670 | T. asperellum | 蓼科酸模叶蓼/土 | E113 5'8" /N29 18'10" | AP1 |
44 | QT22132 | KY225672 | T. saturnisporum | 毛茛科小毛茛/土 | E113 4'48" /N29 14'39" | ST4* |
44 | QT22133 | KY225673 | T. koningiopsis | 毛茛科小毛茛/土 | E113 4'48" /N29 14'39" | KN2 |
44 | QT22039 | KY225671 | T. harzianum | 毛茛科小毛茛/水 | E113 4'48" /N29 14'39" | HZ3 |
45 | QT22135 | KY225674 | T. virens | 唇形科荔枝草/土 | E113 4'48" /N29 14'39" | VE3 |
45 | QT22136 | KY225675 | T. harzianum | 唇形科荔枝草/土 | E113 4'48" /N29 14'39" | HZ4 |
46 | QT22137 | KY225676 | T. brevicompactum | 大戟科泽漆/土 | E113 4'48" /N29 14'39" | BV1 |
47 | TW22141 | KU847972 | T. brevicompactum | 菊科鼠麴草、十字花科播娘蒿/土 | E113 6'24" /N29 10'59" | BV1* |
47 | QT22143 | KY225677 | T. saturnisporum | 菊科鼠麴草、十字花科播娘蒿/土 | E113 6'24" /N29 10'59" | ST1 |
47 | QT22144 | KY225678 | T. harzianum | 菊科鼠麴草、十字花科播娘蒿/土 | E113 6'24" /N29 10'59" | HZ2* |
47 | QT22145 | KY225679 | T. virens | 菊科鼠麴草、十字花科播娘蒿/土 | E113 6'24" /N29 10'59" | VE4 |
47 | QT22146 | KY225680 | T. asperellum | 菊科鼠麴草、十字花科播娘蒿/土 | E113 6'24" /N29 10'59" | AP1 |
48 | QT22148 | KY225681 | T. harzianum | 蓼科酸模叶蓼/土 | E113 6'24" /N29 10'59" | HZ6* |
48 | QT22149 | KY225682 | T. atroviride | 蓼科酸模叶蓼/土 | E113 6'24" /N29 10'59" | AV3* |
48 | QT22150 | KY225683 | T. saturnisporum | 蓼科酸模叶蓼/土 | E113 6'24" /N29 10'59" | ST1 |
49 | QT22152 | KY225584 | T. hamatum | 禾本科菵草/土 | E113 6'24" /N29 10'59" | HM5* |
49 | QT22153 | KY225585 | T. brevicompactum | 禾本科菵草/土 | E113 6'24" /N29 10'59" | BV1 |
49 | QT22155 | KY225586 | T. saturnisporum | 禾本科菵草/土 | E113 6'24" /N29 10'59" | ST2 |
49 | QT22156 | KY225587 | T. asperellum | 禾本科菵草/土 | E113 6'24" /N29 10'59" | AP1* |
50 | QT22160 | KY225588 | T. virens | 牻牛儿苗科牻牛儿苗、豆科大巢菜、禾本科稗草/土 | E113 6'24" /N29 10'59" | VE3* |
51 | QT22161 | KY225589 | T. koningiopsis | 菊科马兰头/土 | E113 0'27" /N29 9'19" | KN1* |
51 | QT22162 | KY225590 | T. saturnisporum | 菊科马兰头/土 | E113 0'27" /N29 9'19" | ST1 |
51 | QT22164 | KY225591 | T. longibrachiatum | 菊科马兰头/土 | E113 0'27" /N29 9'19" | LB2* |
52 | QT22043 | KY225592 | T. asperellum | 禾本科看麦娘/土 | E113 0'27" /N29 9'19" | AP5 |
52 | QT22165 | KY225593 | T. ovalisporum | 禾本科看麦娘/土 | E113 0'27" /N29 9'19" | OL1 |
52 | TW22166 | KT862523 | T. capillare | 禾本科看麦娘/土 | E113 0'27" /N29 9'19" | CP3* |
注:*:菌株单倍型用于构建图 1的系统进化树;−:无植被类型. Note: The group of strains possessing identical alleles in the locus of ITS, and analyzed in the present study with symbol * in Figure 1; −: No vegetation form. |
2.2 木霉种类鉴定
通过ITS序列比对和形态特征分析,共鉴定出16个木霉种类(表 2)。其中15个为已知木霉种类,1个为未知木霉种类。15个已知木霉种类包括:哈茨木霉T. harzianum Rifai、绿木霉T. virens (Miller, Giddens & Foster) Arx、刺孢木霉T. asperellum Samuels, Lieckfeldt & Nirenberg、土星孢木霉T. saturnisporum Hammill、钩状木霉T. hamatum (Bonord) Bainier、拟康宁木霉T. koningiopsis Samuels, Suárez & Evans、短密木霉T. brevicompactum Kraus, Kubicek & Gams、深绿木霉T. atroviride Karsten、猥木霉T. erinaceum Bissett, Kubicek & Szakacs、毛细木霉T. capillare Bissett & Kubicek、长枝木霉T. longibrachiatum Rifai、卵孢木霉T. ovalisporum Samuels & Schroers、侧耳木霉T. pleuroticola Yu & Park、加纳木霉T. ghanense Doi, Abe & Sugiyama、厚木霉T. crassum Bissett。T. capillare为中国新记录种[8],未知菌株Trichoderma sp. CK-2016的ITS序列与NCBI中其他木霉的相似性最高为94.0%,在ISTH中未鉴定到种(The query sequence belongs to an unidentified species of Hypocrea/Trichoderma),可能为疑似新种(另文发表)。T. harzianum为洞庭湖湿地中的优势种,占总菌株数量的19.30%;其次为T. virens和T. asperellum,分别占总菌株数量的13.16%和12.28%。
木霉种类 Species |
菌株数量 Quantity |
百分比 Percent(%) |
T.harzianum | 22 | 19.30 |
T.virens | 15 | 13.16 |
T.asperellum | 14 | 12.28 |
T.saturnisporum | 13 | 11.40 |
T.hamatum | 9 | 7.89 |
T.koningiopsis | 8 | 7.02 |
T.brevicompactum | 7 | 6.14 |
T.atroviride | 7 | 6.14 |
T.erinaceum | 5 | 4.39 |
T.capillare | 4 | 3.51 |
T.longibrachiatum | 3 | 2.63 |
T.ovalisporum | 2 | 1.75 |
T.pleuroticola | 2 | 1.75 |
T.ghanense | 1 | 0.88 |
T.crassum | 1 | 0.88 |
Trichoderma sp. | 1 | 0.88 |
洞庭湖湿地木霉种类具有多样性,从表 1可以看出,土样中共分离到15个木霉种类:T. harzianum、T. virens、T. asperellum、T. saturnisporum、T. hamatum、T. koningiopsis、T. brevicompactum、T. atroviride、T. erinaceum、T. capillare、T. longibrachiatum、T. ovalisporum、T. pleuroticola、T. ghanense和Trichoderma sp.,水样中只分离到5个木霉种类:T. harzianum、T. hamatum、T. atroviride、T. pleuroticola和T. crassum,土样中木霉种类多样性远高于水样。
不同样品中分离到的木霉种类不同,单个样品中分离到的木霉种类为0−5种,一般为2−3种,未分离到木霉菌株的样品有2个(22#和23#,表 1中未列出),分离到木霉种类最多的样品为47#土样,有5种木霉:T. brevicompactum、T. saturnisporum、T. harzianum、T. virens和T. asperellum。
样品的植被类型对木霉的种类和数量影响较大,洞庭湖湿地样品植被共13个科,从木霉种类上来看,禾本科和莎草科根际中分离到的种类较多,分别为14种和11种,大戟科中分离到的木霉种类最少,只有1种。从木霉菌株数量上来看,禾本科和豆科根际分离到的木霉菌株数量较多,分别为40株和22株,占全部木霉总数的35.09%和19.30%,大戟科中分离到的木霉数量最少,只有1株,占全部木霉总数的0.88%,禾本科根际中分离到的木霉种类和数量均最多,结果见表 3。
2.4 系统发育进化分析以粉红粘帚霉Gliocladium roseum (AJ309334)为外族群,以表 1中*标注单倍型菌株的ITS序列构建系统发育进化树,结果见图 1。16个种类的木霉在发育树中归于7个进化支:Harzianum clade包括T. harzianum和T. pleuroticola;Virens clade包括T. virens和T. crassum;Lutea clade包括T. brevicompactum;Unknown clade包括Trichoderma sp.;Longibrachiatum clade包括T. ghanense、T. longibrachiatum、T. saturnisporum和T. capillare;Hamatum clade包括T. asperellum和T. hamatum;Viride clade包括T. atroviride、T. koningiopsis、T. erinaceum和T. ovalisporum。不同分支中包含的木霉种类不等,有的分支只包含1种木霉,有的分支则包含4种木霉。
2.5 木霉生物学功能评价 2.5.1 平板抑菌能力及水解酶活性测定: 供试114株木霉菌株在PDA平板上对4种供试植物病原真菌均有一定的抑制作用,不同木霉菌株对不同病原真菌的抑制能力不同,通过初筛得到21株抑菌效果较好的木霉菌株(对2种及以上病原真菌抑制率不低于70%),并对该21株木霉进行了4种水解酶活性检测,根据测定结果,确定了木霉菌株的理想值组成参考菌株Reference strain (表 4)。菌株编号 Strains |
抑制率 Inhibition rate (%) |
水解带宽度 Hydrolysis radius (mm) |
|||||||
终极腐霉 P.ultimum |
尖孢镰孢 F.oxysporum |
立枯丝核菌 R.solani |
灰葡萄孢 B.cinerea |
几丁质酶 Chitinase |
蛋白酶 Protease |
纤维素酶 Cellulase |
葡聚糖酶 Glucanase |
||
TW21990 | 92.6 | 100.0 | 78.3 | 95.7 | 5.0 | 9.5 | 3.5 | 5.0 | |
QT21969 | 69.4 | 100.0 | 74.7 | 70.9 | 0.0 | 5.0 | 3.0 | 4.0 | |
QT21973 | 72.2 | 100.0 | 74.7 | 72.8 | 0.0 | 8.5 | 2.5 | 3.5 | |
QT21978 | 88.9 | 41.2 | 61.3 | 84.5 | 3.5 | 12.0 | 7.0 | 3.5 | |
QT21979 | 69.4 | 100.0 | 74.7 | 63.1 | 0.0 | 7.0 | 3.0 | 1.5 | |
SC21982 | 44.4 | 100.0 | 70.7 | 55.3 | 0.0 | 7.0 | 5.0 | 3.5 | |
QT22000 | 72.2 | 100.0 | 78.7 | 78.6 | 0.0 | 7.0 | 4.0 | 4.5 | |
QT22033 | 70.8 | 100.0 | 70.7 | 80.6 | 0.0 | 6.0 | 2.0 | 4.5 | |
TW22035 | 80.6 | 81.2 | 54.7 | 51.5 | 4.0 | 11.0 | 8.0 | 3.0 | |
QT22040 | 78.3 | 100.0 | 52.0 | 74.8 | 5.0 | 18.0 | 5.5 | 4.5 | |
QT22066 | 70.8 | 100.0 | 49.3 | 43.7 | 5.0 | 13.5 | 7.0 | 1.5 | |
HB22070 | 72.2 | 78.8 | 72.0 | 95.1 | 0.0 | 4.5 | 6.0 | 4.0 | |
QT22087 | 75.0 | 41.2 | 70.7 | 72.8 | 3.0 | 8.0 | 9.0 | 2.5 | |
QT22094 | 79.2 | 100.0 | 69.3 | 80.6 | 4.0 | 10.0 | 6.5 | 4.0 | |
QT22098 | 76.4 | 100.0 | 78.7 | 94.2 | 0.0 | 5.5 | 4.0 | 4.0 | |
QT22124 | 52.8 | 100.0 | 57.3 | 92.2 | 0.0 | 10.0 | 3.0 | 0.0 | |
QT22133 | 88.9 | 55.3 | 58.7 | 100.0 | 0.0 | 0.0 | 5.0 | 0.0 | |
QT22135 | 66.7 | 100.0 | 56.0 | 82.5 | 0.0 | 10.0 | 1.5 | 1.5 | |
QT22144 | 80.6 | 45.9 | 77.3 | 61.2 | 4.0 | 10.0 | 7.0 | 3.5 | |
QT22161 | 80.6 | 57.6 | 62.7 | 100.0 | 0.0 | 8.0 | 7.5 | 3.5 | |
QT22165 | 77.8 | 52.9 | 60.0 | 88.3 | 2.5 | 0.0 | 7.5 | 2.0 | |
Reference strain | 95.0 | 100.0 | 80.0 | 100.0 | 5.0 | 18.0 | 9.0 | 5.0 |
排序 Order |
菌株 Strains |
灰色关联度 Grey relation degree |
1 | TW21990 | 0.849 5 |
2 | QT22040 | 0.798 6 |
3 | QT22094 | 0.732 6 |
4 | QT22098 | 0.690 4 |
5 | QT22066 | 0.684 3 |
6 | QT22000 | 0.679 4 |
7 | QT21978 | 0.666 6 |
8 | QT22144 | 0.663 6 |
9 | TW22035 | 0.658 1 |
10 | QT22161 | 0.648 6 |
11 | QT22033 | 0.647 6 |
12 | HB22070 | 0.646 2 |
13 | QT22087 | 0.643 9 |
14 | QT21973 | 0.632 5 |
15 | QT21969 | 0.631 3 |
16 | QT22165 | 0.595 5 |
17 | SC21982 | 0.595 2 |
18 | QT21979 | 0.592 1 |
19 | QT22124 | 0.582 2 |
20 | QT22135 | 0.580 9 |
21 | QT22133 | 0.574 5 |
我国已被列为世界上12个高度生物多样性的国家和地区之一,但作为生物重要组成部分的真菌多样性的研究远落后于许多国家,目前很难准确地阐明我国或任何一个地区的真菌物种种类的分布和生态坏境[13]。木霉是重要的真菌资源,在工业、农业及环境保护等领域有着广泛的应用价值,对木霉资源的系统调查及深入研究显得尤为重要。
近年来国内外相继开展了对木霉资源的收集和整理工作,木霉已知种和新种的报道呈急速增长趋势。如Blaszczyk等从波兰分离的170株木霉中鉴定了14个种类[14];Jaklitsch等从南欧及马卡罗尼西亚等地区中分离的650株木霉中鉴定出90个种类,其中17个为新种[15];Kamala等从印度分离的193株木霉中鉴定了22个种类[16];Sun等从中国各地分离的1 910株木霉中鉴定了23个种类,其中3个为中国新记录种[17];Saravanakumar等从中国南方滩涂湿地分离的254株木霉中鉴定了13个种类,其中2个为未知种类[18]。可见木霉是世界性分布真菌,种类繁多,发现新种的可能性也较大。相比以上研究,本研究只对中国湖南省洞庭湖湿地中的木霉资源进行了调查,从采集的52个样品中分离得到114株木霉,鉴定了16个种类,其中一个为中国新记录种(T. capillare),一个为疑似新种。虽然采集样品数量相比其他大型调查较少,但其中包含的木霉种类却较多,说明该地区木霉资源较为丰富。
土壤真菌多样性受到很多因素的影响,其中最主要的影响因素是植被和土壤类型[19]。植物可以给真菌提供特殊的碳源和能量来源,土壤类型会影响真菌在土壤中的定殖,进而影响真菌的生态位。洞庭湖位于中国湖南省北部,是中国第二大淡水湖,相比于农田及森林等其他生态系统,土壤中水分含量较高,植被受人为因素影响较小,具有更为天然的湿地生态环境。洞庭湖土样中木霉检出率为96.2%,水样中木霉检出率为50.0%,说明木霉在洞庭湖湿地的分布较为普遍,土壤湿地环境更适合木霉的生长。
植被类型对木霉的影响也较大,洞庭湖样品植被共分为13个科,从禾本科和豆科根际分离到的木霉数量较多,占全部木霉总数的35.09%和19.30%,从大戟科中分离到的木霉数量最少,只占0.88%,说明禾本科和豆科根际更适合木霉的定殖,该研究同前人的结果基本一致[20-22],原因可能是该类作物一般种植周期长,农事操作少,农药和化肥用量也较少,其根际环境更有利于木霉的生长和定殖。
研究发现,T. harzianum为洞庭湖湿地中的优势种,占总菌株数量的19.30%,T. harzianum在欧洲、美洲、非洲和亚洲等都有分布,且大都属于较为优势的种,具有世界性分布的特点[14-16, 20-22],这可能与T. harzianum生长温度范围宽,在低温和高温条件下均能较好生长有关,也可能与T. harzianum是一个复合种有关[14, 23-24]。
木霉是重要的植物病害生物防治菌株,具有重寄生、产生抗生性代谢产物及降解病原真菌细胞壁等作用。本研究将灰色关联度理论应用到优良菌株的筛选中,使筛选拮抗性菌株的准确性和效率大幅提高。通过对初筛21株木霉的8个生防性状的评价,得到综合效果较好的3株木霉:T. harzianum TW21990、T. longibrachiatum QT22040和T. ovalisporum QT22094,为保护和合理利用木霉资源提供了依据。其中T. harzianum既是洞庭湖湿地的优势种,又是优良菌株,一般来说优势种是具有高度的生态适应性、个体数量多和有竞争优势的一类种群,可能有更高的拮抗活性、重寄生能力和抗生性代谢产物产生能力,具有更好的应用前景。
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