微生物学通报  2017, Vol. 44 Issue (10): 2307−2320

扩展功能

文章信息

陈凯, 李纪顺, 王贻莲, 李玲, 扈进冬, 魏艳丽, 赵忠娟, 杨合同
CHEN Kai, LI Ji-Shun, WANG Yi-Lian, LI Ling, HU Jin-Dong, WEI Yan-Li, ZHAO Zhong-Juan, YANG He-Tong
洞庭湖湿地木霉多样性及生防活性
Species diversity and biocontrol activity of Trichoderma in Dongting Lake wetland
微生物学通报, 2017, 44(10): 2307-2320
Microbiology China, 2017, 44(10): 2307-2320
DOI: 10.13344/j.microbiol.china.170021

文章历史

收稿日期: 2017-01-09
接受日期: 2017-04-20
优先数字出版日期(www.cnki.net): 2017-05-09
洞庭湖湿地木霉多样性及生防活性
陈凯Δ, 李纪顺Δ, 王贻莲, 李玲, 扈进冬, 魏艳丽, 赵忠娟, 杨合同     
山东省科学院生态研究所 山东省应用微生物重点实验室    山东 济南    250014
摘要【目的】 了解湖南省洞庭湖湿地木霉种类及分布,丰富我国的木霉种质资源,为功能菌株筛选应用奠定基础。【方法】 利用ITS序列比对分析结合形态学特征对分离到的木霉菌株进行种类鉴定,构建系统发育进化树分析其亲缘关系。通过菌丝生长速率法测定菌株的平板抑菌能力,根据水解带大小检测菌株的水解酶活性,利用灰色关联度分析筛选综合生防效果较好的木霉菌株。【结果】 从52个土样和18个水样中分离得到114株木霉菌株,经鉴定分属16个木霉种类:哈茨木霉、绿木霉、刺孢木霉、土星孢木霉、钩状木霉、拟康宁木霉、短密木霉、深绿木霉、猥木霉、毛细木霉(中国新记录种)、长枝木霉、卵孢木霉、侧耳木霉、加纳木霉、厚木霉及一个疑似新种;哈茨木霉为洞庭湖湿地中的优势种,占总菌株数量的19.30%;16种木霉在系统发育树中归于7个进化支:Harzianum Clade、Virens Clade、Longibrachiatum Clade、Lutea Clade、Viride Clade、Hamatum Clade、Unknown Clade。灰色关联度分析表明,菌株TW21990、QT22040和QT22094的灰色关联度较高,分别为0.849 5、0.798 6和0.732 6,综合生防性状较好。【结论】 洞庭湖湿地木霉具有种类多样性和分布多样性,发现了一个中国新记录种毛细木霉和一个疑似新种,哈茨木霉TW21990、长枝木霉QT22040和卵孢木霉QT22094是潜在的优良生防菌株。
关键词木霉     洞庭湖湿地     种类鉴定     系统发育     生防活性    
Species diversity and biocontrol activity of Trichoderma in Dongting Lake wetland
CHEN KaiΔ, LI Ji-ShunΔ, WANG Yi-Lian, LI Ling, HU Jin-Dong, WEI Yan-Li, ZHAO Zhong-Juan, YANG He-Tong     
Ecology Institute of Shandong Academy of Sciences, Shandong Provincial Key Laboratory of Applied Microbiology, Jinan, Shandong 250014, China
Received: January 09, 2017; Accepted: April 20, 2017; Published online (www.cnki.net): May 09, 2017
Foundation item: Key Research and Development Project of Shandong Province (No. 2015GNC113003); Special Fund for Agro-scientific Research in the Public Interest of China (No. 201303025); The Special Foundation for the Basic Work of Science and Technology of China (No. 2014FY120900); Agricultural Application Technology Innovation of Shandong Province; The 13th Five-Year National Key Research Project of China (No. 2017YFD0201102)
ΔThese authors equally contributed to this work
*Corresponding author: YANG He-Tong, Tel: 86-531-82605625; E-mail: yanght@sdas.org.
Abstract: [Objective] Investigated the distribution and species of Trichoderma in Dongting Lake wetland, Hunan province, supplemented Trichoderma resources of China, and farther more use of functional strains screening and applied. [Methods] Species were identified by analysis of internal transcribed spacer regions of the rRNA gene cluster (ITS) and morphological characteristics, and analyzed the genetic relationship based on ITS sequences phylogenetic tree. The antifungal activity were determined by mycelial growth rate method, and hydrolase activity were determined by hydrolyzation radius, screening the superior comprehensive biocontrol Trichoderma strains by gray correlative degree analysis. [Results] Total 114 Trichoderma strains were isolated from 52 soil samples and 18 water samples, 15 known species were identified as followed: T. harzianum, T. virens, T. asperellum, T. saturnisporum, T. hamatum, T. koningiopsis, T. brevicompactum, T. atroviride, T. erinaceum, T. capillare, T. longibrachiatum, T. ovalisporum, T. pleuroticola, T. ghanense, T. crassum, among them T. capillare was Chinese new record, besides Trichoderma sp. CK-2016 was an uncertain new species. T. harzianum was the dominant species with 19.30% quantity among them. All these Trichoderma species belonged to 7 Clade as followed: Harzianum Clade, Virens Clade, Longibrachiatum Clade, Lutea Clade, Viride Clade, Hamatum Clade, Unknown Clade. Gray correlative degree analysis showed that the grey relation degree of three strains TW21990, QT22040 and QT22094 were 0.849 5, 0.798 6 and 0.732 6, respectively, and were better comprehensive biocontrol Trichoderma strains among primary twenty-one strains. [Conclusion] The Trichoderma species in Dongting Lake wetland, Hunan province have diversity with a new China record of T. capillare and an uncertain new species among them, T. harzianum strain TW21990, T. longibrachiatum strain QT22040 and T. ovalisporum strain QT22094 are potential biocontrol agents.
Key words: Trichoderma     Dongting Lake wetland     Species identification     Phylogeny     Biocontrol activity    

木霉Trichoderma Pers.是世界性分布真菌,主要存在于土壤、腐烂的木材及杂草中,因其在工业酶制剂、抗生素及生物防治等方面的应用价值而得到广泛关注和研究[1-2]。目前该属真菌已知250余种(http://www.indexfungorum.orghttp://www.isth.info/tools/molkey/index.php)[3],国内近几年也展开了木霉属资源和系统分类研究,已知木霉属真菌的数量迅速增长,截止2016年共有中国新记录种117种[4-7],充分展示了我国该类群丰富的物种多样性。

洞庭湖位于中国湖南省北部,北纬27东经111之间,是中国第二大淡水湖,周边的湿地是一个处于动态变化中的海陆过渡带,具有极其丰富的生物资源,是珍贵的自然资源,也是重要的生态系统,具有不可替代的综合功能。但目前对洞庭湖微生物资源的研究较少,特别是木霉的研究更为欠缺。因此,系统开展其生境中木霉的遗传及生物多样性研究,可进一步丰富木霉的菌种资源,扩展木霉的应用空间,更有效地服务于工农业生产。

1 材料与方法 1.1 供试菌株

供试植物病原真菌:立枯丝核菌Rhizoctonia solani、终极腐霉Pythium ultimum、尖孢镰孢Fusarium oxysporum、灰葡萄孢Botrytis cinerea,均为本实验室保藏。

1.2 培养基、主要试剂和仪器

菌株培养与分离培养基为PDA和PDAm,4种水解酶活性测定培养基为葡聚糖酶培养基、蛋白酶培养基、纤维素酶培养基及几丁质酶培养基[8],上述培养基于0.1 MPa灭菌20 min后备用。

Fungal DNA Mini Kit试剂盒,OMEGA公司;TaKaRa TaqTM聚合酶,宝生物工程(大连)有限公司。CX31显微镜,Olympus公司;MyCycler PCR仪,Bio-Rad公司;GenoSens 1880凝胶成像分析系统,上海勤翔科学仪器有限公司。

1.3 样品采集

于2015年4月沿洞庭湖湿地采集土样和水样,水样直接用干净的塑料瓶盛取约50 mL,封口保存;土样采用五点采样法,首先在采集地块的对角线选5等分点,然后去掉表层土1−2 cm,用深度25 cm的采土器在每点采取深度20 cm左右的土样,再将5份土混合均匀,取500 g装入干净自封袋中封好。选择52个采样点,采集土样52份,水样18份。

1.4 菌种分离

称取10 g土样,倒入100 mL灭菌生理盐水中,25 ℃摇床振荡1 h,进行梯度稀释,每稀释度取1 mL放入平板中,加入45 ℃左右的PDAm混匀,25℃培养7−14 d。对于水样,直接取1 mL混入培养基中。待木霉长出后,挑取不同形态的木霉菌落转接PDA平板,25℃培养,并经单孢纯化后保存备用。

1.5 种类鉴定

主要利用ITS序列比对分析结合形态特征进行种类鉴定[9]。利用Fungal DNA Mini Kit试剂盒提取木霉基因组DNA,采用引物ITS1-F/ITS4进行扩增[10],PCR产物交生工生物工程(上海)股份有限公司测序,结果提交NCBI (https://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi)和ISTH (http://www.isth.info/tools/molkey/index.php)网站进行比对分析。在PDA平板上25℃培养单孢纯化的各木霉菌株,定期观察菌株的平板形态和分生孢子梗分枝等特征,通过综合分析确定菌株的种类。

1.6 系统发育进化分析

选取部分代表菌株的ITS序列(单倍型),利用MEGA 6.0构建系统发育进化树,采用邻接法Neighbor-Joining,分析模型Kimura 2-parameter model和Gamma Distributed,自展数据集Bootstrap replications为1 000次。

1.7 生物学功能评价

1.7.1 平板抑菌实验: PDA平板直径两端距中心35 mm处分别接种直径5 mm的木霉菌株和病原真菌,以只接种病原真菌为对照,25 ℃培养3−5 d,记录病原真菌对峙方向生长半径,计算抑制率(%)。

抑制率(%)=100%×(对照病菌生长半径−处理病菌生长半径)/对照病菌生长半径。

1.7.2 水解酶活性检测: 选取1.7.1中抑制率效果较好的木霉菌株进行酶活检测。主要检测蛋白酶、纤维素酶、β-1, 3-葡聚糖酶及几丁质酶的活性大小。配制各水解酶活性检测培养基平板,平板中央接种直径5 mm的木霉菌株培养物,25℃培养6 d,记录水解带宽度。

1.7.3 灰色关联度分析: 利用灰色关联度分析法对初筛得到的木霉菌株进行综合评价[11-12]。视所有供试菌株为一个灰色系统,每一菌株都是系统中的一个元素。以“参考菌株”各项性状指标构成的数列作为参考数列x0,以供试菌株各项性状指标构成的数列作为比较数列xi (i=1、2、3……),将参考数列x0与比较数列xi进行量化后比较,由二者的相似程度来判断二者的关联度(ri),关联度越大,综合效果越好。具体的分析步骤如下:

确定参考菌株:根据生防木霉菌株的测定性状确定生防木霉菌株的理想值组成参考菌株。

数据的无量化处理:由于各性状量纲不一致,因此需要在分析之前将原始数据进行无量纲化处理,常用的方法有初值化和均值化等,本研究采用初值化方式进行处理。

计算关联系数ξi(k):公式为ξi(k)=(Δmin+Δmaxk)/ [Δtij(tk)+Δmaxk],其中Δmin=miniminj|xi(tk)–xj(tk)|,Δmax=maximaxj|xi(tk)–xj(tk)|。

计算关联度ri:公式为ri=Σξi(k)×ωj,其中ri为比较数列xi与参考数列x0的关联度,ωj是j个性状的加权系数。

2 结果与分析 2.1 木霉菌株分离结果

从洞庭湖湿地采集的52个土样和18个水样中,共分离到114株木霉,菌株鉴定种类及登录信息等见表 1。供试的52个土样中,有50个土样中分离到了木霉菌株,检出率为96.2%;18个水样中,有9个水样中分离到了木霉菌株,检出率为50.0%。将各个种中ITS区域完全相同的菌株命名为1个单倍型,共得到52个单倍型。

表 1 木霉菌株分离信息 Table 1 List of Trichoderma strains included in this study
样品号
Sample No.
菌株号
Strains
登录号
GenBank accession No.
种类
Species
来源
Source
经纬度
Longitude/Latitude
单倍型
Allelic group
1 QT21984 KY209917 T.asperellum 禾本科菵草/土 E113 8'34" /N29 26'15" AP2*
1 QT22040 KY209918 T. longibrachiatum 禾本科菵草/土 E113 8'34" /N29 26'15" LB1*
1 QT21969 KY209915 T. harzianum 禾本科菵草/水 E113 8'34" /N29 26'15" HZ1
1 QT21970 KY209916 T. atroviride 禾本科菵草/水 E113 8'34" /N29 26'15" AV1*
2 QT21987 KY209920 T. crassum 菊科马兰头/水 E113 6'9" /N29 24'3" CR1*
2 QT21988 KY209921 T. virens 菊科马兰头/土 E113 6'9" /N29 24'3" VE4*
2 QT22069 KY209919 T. atroviride 菊科马兰头/水 E113 6'9" /N29 24'3" AV1
3 TW21990 KY209922 T. harzianum 禾本科双穗雀稗/土 E113 6'9" /N29 24'3" HZ1*
3 TW21990-1 KY189312 Trichoderma sp. 禾本科双穗雀稗/土 E113 6'9" /N29 24'3" SP1*
3 QT21993 KY209923 T. capillare 禾本科双穗雀稗/土 E113 6'9" /N29 24'3" CP1*
4 QT21995 KY209924 T. saturnisporum 豆科南苜蓿/土 E113 6'9" /N29 24'3" ST1
4 QT21996 KY225594 T. virens 豆科南苜蓿/土 E113 6'9" /N29 24'3" VE4
5 QT21998 KY225596 T. asperellum 豆科大巢菜/土 E113 3'23" /N29 26'35" AP1
5 QT22000 KY225597 T. harzianum 豆科大巢菜/土 E113 3'23" /N29 26'35" HZ1
5 QT22001 KY225598 T. saturnisporum 豆科大巢菜/土 E113 3'23" /N29 26'35" ST2*
5 QT21973 KY225595 T. harzianum 豆科大巢菜/水 E113 3'23" /N29 26'35" HZ3
6 QT22002 KY225599 T. asperellum 豆科大巢菜、禾本科双穗雀穗/土 E113 3'23" /N29 26'35" AP1
6 QT22003 KY225600 T. harzianum 豆科大巢菜、禾本科双穗雀穗/土 E113 3'23" /N29 26'35" HZ3
6 QT22004 KY225601 T. saturnisporum 豆科大巢菜、禾本科双穗雀穗/土 E113 3'23" /N29 26'35" ST1
7 QT22006 KY225602 T. virens 蓼科羊蹄/土 E113 5'58" /N29 26'12" VE1
7 QT22007 KY225603 T. koningiopsis 蓼科羊蹄/土 E113 5'58" /N29 26'12" KN2
8 QT22008 KY225604 T. brevicompactum 禾本科马唐/土 E113 5'58" /N29 26'12" BV1
8 QT22010 KY225605 T. atroviride 禾本科马唐/土 E113 5'58" /N29 26'12" AV1
8 QT22013 KY225606 T. saturnisporum 禾本科马唐/土 E113 5'58" /N29 26'12" ST1*
9 QT22045 KY225607 T. virens 玄参科通泉草、莎草科莎草/土 E113 2'51" /N29 24'20" VE1
9 QT22046 KY225608 T. asperellum 玄参科通泉草、莎草科莎草/土 E113 2'51" /N29 24'20" AP5*
10 KY22016 KY225609 T. virens 杨柳科柳树/土 E113 0'32" /N29 21'34" VE4
11 QT22047 KY225610 T. hamatum 伞形科天胡荽/土 E113 0'32" /N29 21'34" HM4*
12 HB22049 KY225611 T. asperellum 禾本科竹/土 E113 0'32" /N29 21'34" AP3*
12 HB22052 KY225612 T. koningiopsis 禾本科竹/土 E113 0'32" /N29 21'34" KN4*
13 QT22017 KY225613 T. saturnisporum 玄参科通泉草/土 E113 0'32" /N29 21'34" ST3*
13 QT22019 KY225614 T. koningiopsis 玄参科通泉草/土 E113 0'32" /N29 21'34" KN3*
14 QT22021 KY225615 T. koningiopsis 禾本科双穗雀稗、豆科大巢菜/土 E113 0'32" /N29 21'34" KN4
14 QT22053 KY225616 T. harzianum 禾本科双穗雀稗、豆科大巢菜/土 E113 0'32" /N29 21'34" HZ5*
15 HB22055 KY225618 T. hamatum −/土 E113 0'28" /N29 23'3" HM1
15 HB22075 KY225619 T. hamatum −/土 E113 0'28" /N29 23'3" HM1*
15 HB22070 KY225617 T. harzianum −/土 E113 0'28" /N29 23'3" HZ3*
16 KY22056 KY225620 T. erinaceum 杨柳科杨树/土 E112 49'10" /N29 30'53" EN2*
16 KY22057 KY225621 T. brevicompactum 杨柳科杨树/土 E112 49'10" /N29 30'53" BV1
17 QT22022 KY225622 T. virens −/土 E112 49'10" /N29 30'53" VE1*
18 QT22024 KY225626 T. virens 莎草科莎草/土 E112 49'10" /N29 30'53" VE3
18 QT22025 KY225627 T. asperellum 莎草科莎草/土 E112 49'10" /N29 30'53" AP3
18 QT21977 KY225623 T. pleuroticola 莎草科莎草/水 E112 49'10" /N29 30'53" PU1*
18 QT21978 KY225624 T. atroviride 莎草科莎草/水 E112 49'10" /N29 30'53" AV2*
18 QT21979 KY225625 T. harzianum 莎草科莎草/水 E112 49'10" /N29 30'53" HZ1
19 SC22026 KY225630 T. erinaceum 十字花科油菜/土 E112 46'8" /N29 27'44" EN1*
19 SC22027 KY225631 T. brevicompactum 十字花科油菜/土 E112 46'8" /N29 27'44" BV1
19 SC21982 KY225628 T. harzianum 十字花科油菜/水 E112 46'8" /N29 27'44" HZ6
19 SC21983 KY225629 T. hamatum 十字花科油菜/水 E112 46'8" /N29 27'44" HM2*
20 QT22028 KY225632 T. virens 豆科南苜蓿、伞形科蛇床/土 E112 46'8" /N29 27'44" VE5*
20 QT22060 KY225633 T. harzianum 豆科南苜蓿、伞形科蛇床/土 E112 46'8" /N29 27'44" HZ6
21 SC22030 KY225634 T. virens 十字花科油菜/土 E112 44'17" /N29 24'50" VE1
24 QT22066 KY225636 T. capillare 豆科大巢菜、禾本科双穗雀稗、莎草科莎草/土 E112 42'55" /N29 11'13" CP2*
24 QT22071 KY225635 T. harzianum 豆科大巢菜、禾本科双穗雀稗、莎草科莎草/水 E112 42'55" /N29 11'13" HZ6
25 QT22032 KY225637 T. brevicompactum 禾本科稗草、莎草科莎草/土 E112 42'55" /N29 11'13" BV1
25 QT22033 KY225638 T. harzianum 禾本科稗草、莎草科莎草/土 E112 42'55" /N29 11'13" HZ4*
26 TW22035 KT792972 T. ghanense 禾本科水稻/土 E112 42'8" /N29 7'34" GA1*
26 QT22036 KY225639 T. harzianum 禾本科水稻/土 E112 42'8" /N29 7'34" HZ4
27 SC22038 KY225640 T. saturnisporum 豆科蚕豆/土 E112 41'56" /N29 6'36" ST1
27 SC22068 KY225641 T. koningiopsis 豆科蚕豆/土 E112 41'56" /N29 6'36" KN1
28 QT22076 KY225642 T. harzianum 禾本科双穗雀稗/土 E112 41'56" /N29 6'36" HZ6
29 QT22077 KY225643 T. erinaceum −/土 E112 42'59" /N29 3'45" EN1
30 QT22079 KY225644 T. erinaceum 菊科牛蒡/土 E112 42'59" /N29 3'45" EN3*
31 QT22087 KY225645 T. erinaceum 唇形科益母草/土 E112 42'59" /N29 3'45" EN4*
32 SD22088 KY225647 T. koningiopsis 禾本科水稻/土 E112 47'37" /N29 0'5" KN2*
32 SD22090 KY225648 T. pleuroticola 禾本科水稻/土 E112 47'37" /N29 0'5" PU2*
32 SD22073 KY225646 T. atroviride 禾本科水稻/水 E112 47'37" /N29 0'5" AV4*
33 QT22092 KY225649 T. harzianum 牻牛儿苗科牻牛儿苗、豆科大巢菜、禾本科稗草/土 E113 5'40" /N29 23'2" HZ1
33 QT22093 KY225650 T. hamatum 牻牛儿苗科牻牛儿苗、豆科大巢菜、禾本科稗草/土 E113 5'40" /N29 23'2" HM5
34 QT22094 KY225651 T. ovalisporum 莎草科莎草/土 E113 5'40" /N29 23'2" OL1*
34 QT22095 KY225652 T. harzianum 莎草科莎草/土 E113 5'40" /N29 23'2" HZ3
34 QT22096 KY225653 T. saturnisporum 莎草科莎草/土 E113 5'40" /N29 23'2" ST1
35 QT22098 KY225654 T. harzianum −/土 E113 5'40" /N29 23'2" HZ3
35 QT22099 KY225655 T. capillare −/土 E113 5'40" /N29 23'2" CP1
36 QT22104 KY225656 T. asperellum 蓼科酸模叶蓼/土 E113 5'7" /N29 21'1" AP6*
37 QT22107 KY225657 T. virens −/土 E113 5'7" /N29 21'1" VE2*
38 QT22110 KY225658 T. asperellum 莎草科莎草/土 E113 5'7" /N29 21'1" AP4*
38 QT22111 KY225659 T. longibrachiatum 莎草科莎草/土 E113 5'7" /N29 21'1" LB1
39 QT22112 KY225660 T. asperellum 豆科南苜蓿/土 E113 5'7" /N29 21'1" AP1
39 QT22115 KY225661 T. virens 豆科南苜蓿/土 E113 5'7" /N29 21'1" VE3
40 SC22119 KY225662 T. atroviride 十字花科萝卜/土 E113 5'7" /N29 21'1" AV5*
41 QT22121 KY225663 T. hamatum 禾本科稗草/土 E113 5'8" /N29 18'10" HM3*
41 QT22122 KY225664 T. virens 禾本科稗草/土 E113 5'8" /N29 18'10" VE4
41 QT22124 KY225665 T. harzianum 禾本科稗草/土 E113 5'8" /N29 18'10" HZ3
42 QT22125 KY225666 T. hamatum 莎草科莎草/土 E113 5'8" /N29 18'10" HM6*
42 QT22126 KY225667 T. asperellum 莎草科莎草/土 E113 5'8" /N29 18'10" AP4
43 QT22128 KY225668 T. saturnisporum 蓼科酸模叶蓼/土 E113 5'8" /N29 18'10" ST2
43 QT22130 KY225669 T. hamatum 蓼科酸模叶蓼/土 E113 5'8" /N29 18'10" HM5
43 QT22131 KY225670 T. asperellum 蓼科酸模叶蓼/土 E113 5'8" /N29 18'10" AP1
44 QT22132 KY225672 T. saturnisporum 毛茛科小毛茛/土 E113 4'48" /N29 14'39" ST4*
44 QT22133 KY225673 T. koningiopsis 毛茛科小毛茛/土 E113 4'48" /N29 14'39" KN2
44 QT22039 KY225671 T. harzianum 毛茛科小毛茛/水 E113 4'48" /N29 14'39" HZ3
45 QT22135 KY225674 T. virens 唇形科荔枝草/土 E113 4'48" /N29 14'39" VE3
45 QT22136 KY225675 T. harzianum 唇形科荔枝草/土 E113 4'48" /N29 14'39" HZ4
46 QT22137 KY225676 T. brevicompactum 大戟科泽漆/土 E113 4'48" /N29 14'39" BV1
47 TW22141 KU847972 T. brevicompactum 菊科鼠麴草、十字花科播娘蒿/土 E113 6'24" /N29 10'59" BV1*
47 QT22143 KY225677 T. saturnisporum 菊科鼠麴草、十字花科播娘蒿/土 E113 6'24" /N29 10'59" ST1
47 QT22144 KY225678 T. harzianum 菊科鼠麴草、十字花科播娘蒿/土 E113 6'24" /N29 10'59" HZ2*
47 QT22145 KY225679 T. virens 菊科鼠麴草、十字花科播娘蒿/土 E113 6'24" /N29 10'59" VE4
47 QT22146 KY225680 T. asperellum 菊科鼠麴草、十字花科播娘蒿/土 E113 6'24" /N29 10'59" AP1
48 QT22148 KY225681 T. harzianum 蓼科酸模叶蓼/土 E113 6'24" /N29 10'59" HZ6*
48 QT22149 KY225682 T. atroviride 蓼科酸模叶蓼/土 E113 6'24" /N29 10'59" AV3*
48 QT22150 KY225683 T. saturnisporum 蓼科酸模叶蓼/土 E113 6'24" /N29 10'59" ST1
49 QT22152 KY225584 T. hamatum 禾本科菵草/土 E113 6'24" /N29 10'59" HM5*
49 QT22153 KY225585 T. brevicompactum 禾本科菵草/土 E113 6'24" /N29 10'59" BV1
49 QT22155 KY225586 T. saturnisporum 禾本科菵草/土 E113 6'24" /N29 10'59" ST2
49 QT22156 KY225587 T. asperellum 禾本科菵草/土 E113 6'24" /N29 10'59" AP1*
50 QT22160 KY225588 T. virens 牻牛儿苗科牻牛儿苗、豆科大巢菜、禾本科稗草/土 E113 6'24" /N29 10'59" VE3*
51 QT22161 KY225589 T. koningiopsis 菊科马兰头/土 E113 0'27" /N29 9'19" KN1*
51 QT22162 KY225590 T. saturnisporum 菊科马兰头/土 E113 0'27" /N29 9'19" ST1
51 QT22164 KY225591 T. longibrachiatum 菊科马兰头/土 E113 0'27" /N29 9'19" LB2*
52 QT22043 KY225592 T. asperellum 禾本科看麦娘/土 E113 0'27" /N29 9'19" AP5
52 QT22165 KY225593 T. ovalisporum 禾本科看麦娘/土 E113 0'27" /N29 9'19" OL1
52 TW22166 KT862523 T. capillare 禾本科看麦娘/土 E113 0'27" /N29 9'19" CP3*
注:*:菌株单倍型用于构建图 1的系统进化树;−:无植被类型.
Note: The group of strains possessing identical alleles in the locus of ITS, and analyzed in the present study with symbol * in Figure 1; −: No vegetation form.

图 1 基于ITS序列构建的木霉系统发育进化树 Figure 1 Phylogenetic tree of Trichoderma strains inferred by analysis of ITS sequences 注:括号内为GenBank登录号,符号(HZ、PU、AV等)代表同一种类木霉的单倍型,具体见表 1;Gliocladium roseum (AJ309334)为外族群;节点左边的数值是基于邻接法1 000次重复取样数据集的Bootstrap支持率( > 70%);比例尺表示100个核苷酸中有2个被替换. Note: The GenBank accession numbers are shown in parenthese, the symbols such as HZ, PU, AV, etc indicate the allelic groups of Trichoderma species, and see in table 1; Gliocladium roseum (AJ309334) is the out group; Bootstrap values ( > 70%) are given at the left of nodes based on neighbour-joining analyses of 1 000 replications; The scale bar represents 0.02 substitutions per nucleotide positions.
2.2 木霉种类鉴定

通过ITS序列比对和形态特征分析,共鉴定出16个木霉种类(表 2)。其中15个为已知木霉种类,1个为未知木霉种类。15个已知木霉种类包括:哈茨木霉T. harzianum Rifai、绿木霉T. virens (Miller, Giddens & Foster) Arx、刺孢木霉T. asperellum Samuels, Lieckfeldt & Nirenberg、土星孢木霉T. saturnisporum Hammill、钩状木霉T. hamatum (Bonord) Bainier、拟康宁木霉T. koningiopsis Samuels, Suárez & Evans、短密木霉T. brevicompactum Kraus, Kubicek & Gams、深绿木霉T. atroviride Karsten、猥木霉T. erinaceum Bissett, Kubicek & Szakacs、毛细木霉T. capillare Bissett & Kubicek、长枝木霉T. longibrachiatum Rifai、卵孢木霉T. ovalisporum Samuels & Schroers、侧耳木霉T. pleuroticola Yu & Park、加纳木霉T. ghanense Doi, Abe & Sugiyama、厚木霉T. crassum Bissett。T. capillare为中国新记录种[8],未知菌株Trichoderma sp. CK-2016的ITS序列与NCBI中其他木霉的相似性最高为94.0%,在ISTH中未鉴定到种(The query sequence belongs to an unidentified species of Hypocrea/Trichoderma),可能为疑似新种(另文发表)。T. harzianum为洞庭湖湿地中的优势种,占总菌株数量的19.30%;其次为T. virensT. asperellum,分别占总菌株数量的13.16%和12.28%。

表 2 洞庭湖湿地分离木霉种类及数量分布 Table 2 Species and amount of Trichoderma in Dongting Lake
木霉种类
Species
菌株数量
Quantity
百分比
Percent(%)
T.harzianum 22 19.30
T.virens 15 13.16
T.asperellum 14 12.28
T.saturnisporum 13 11.40
T.hamatum 9 7.89
T.koningiopsis 8 7.02
T.brevicompactum 7 6.14
T.atroviride 7 6.14
T.erinaceum 5 4.39
T.capillare 4 3.51
T.longibrachiatum 3 2.63
T.ovalisporum 2 1.75
T.pleuroticola 2 1.75
T.ghanense 1 0.88
T.crassum 1 0.88
Trichoderma sp. 1 0.88
2.3 木霉多样性分析

洞庭湖湿地木霉种类具有多样性,从表 1可以看出,土样中共分离到15个木霉种类:T. harzianumT. virensT. asperellumT. saturnisporumT. hamatumT. koningiopsisT. brevicompactumT. atrovirideT. erinaceumT. capillareT. longibrachiatumT. ovalisporumT. pleuroticolaT. ghanenseTrichoderma sp.,水样中只分离到5个木霉种类:T. harzianumT. hamatumT. atrovirideT. pleuroticolaT. crassum,土样中木霉种类多样性远高于水样。

不同样品中分离到的木霉种类不同,单个样品中分离到的木霉种类为0−5种,一般为2−3种,未分离到木霉菌株的样品有2个(22#和23#表 1中未列出),分离到木霉种类最多的样品为47#土样,有5种木霉:T. brevicompactumT. saturnisporumT. harzianumT. virensT. asperellum

样品的植被类型对木霉的种类和数量影响较大,洞庭湖湿地样品植被共13个科,从木霉种类上来看,禾本科和莎草科根际中分离到的种类较多,分别为14种和11种,大戟科中分离到的木霉种类最少,只有1种。从木霉菌株数量上来看,禾本科和豆科根际分离到的木霉菌株数量较多,分别为40株和22株,占全部木霉总数的35.09%和19.30%,大戟科中分离到的木霉数量最少,只有1株,占全部木霉总数的0.88%,禾本科根际中分离到的木霉种类和数量均最多,结果见表 3

表 3 木霉在不同种类植物根际的数量分布 Table 3 Trichoderma distribution in different plant rhizosphere
2.4 系统发育进化分析

以粉红粘帚霉Gliocladium roseum (AJ309334)为外族群,以表 1中*标注单倍型菌株的ITS序列构建系统发育进化树,结果见图 1。16个种类的木霉在发育树中归于7个进化支:Harzianum clade包括T. harzianumT. pleuroticola;Virens clade包括T. virensT. crassum;Lutea clade包括T. brevicompactum;Unknown clade包括Trichoderma sp.;Longibrachiatum clade包括T. ghanenseT. longibrachiatumT. saturnisporumT. capillare;Hamatum clade包括T. asperellumT. hamatum;Viride clade包括T. atrovirideT. koningiopsisT. erinaceumT. ovalisporum。不同分支中包含的木霉种类不等,有的分支只包含1种木霉,有的分支则包含4种木霉。

2.5 木霉生物学功能评价

2.5.1 平板抑菌能力及水解酶活性测定: 供试114株木霉菌株在PDA平板上对4种供试植物病原真菌均有一定的抑制作用,不同木霉菌株对不同病原真菌的抑制能力不同,通过初筛得到21株抑菌效果较好的木霉菌株(对2种及以上病原真菌抑制率不低于70%),并对该21株木霉进行了4种水解酶活性检测,根据测定结果,确定了木霉菌株的理想值组成参考菌株Reference strain (表 4)。

表 4 初筛21株木霉菌株的生防性状测定结果 Table 4 The biocontrol characters of Trichoderma strains
菌株编号
Strains
抑制率
Inhibition rate (%)
水解带宽度
Hydrolysis radius (mm)
终极腐霉
P.ultimum
尖孢镰孢
F.oxysporum
立枯丝核菌
R.solani
灰葡萄孢
B.cinerea
几丁质酶
Chitinase
蛋白酶
Protease
纤维素酶
Cellulase
葡聚糖酶
Glucanase
TW21990 92.6 100.0 78.3 95.7 5.0 9.5 3.5 5.0
QT21969 69.4 100.0 74.7 70.9 0.0 5.0 3.0 4.0
QT21973 72.2 100.0 74.7 72.8 0.0 8.5 2.5 3.5
QT21978 88.9 41.2 61.3 84.5 3.5 12.0 7.0 3.5
QT21979 69.4 100.0 74.7 63.1 0.0 7.0 3.0 1.5
SC21982 44.4 100.0 70.7 55.3 0.0 7.0 5.0 3.5
QT22000 72.2 100.0 78.7 78.6 0.0 7.0 4.0 4.5
QT22033 70.8 100.0 70.7 80.6 0.0 6.0 2.0 4.5
TW22035 80.6 81.2 54.7 51.5 4.0 11.0 8.0 3.0
QT22040 78.3 100.0 52.0 74.8 5.0 18.0 5.5 4.5
QT22066 70.8 100.0 49.3 43.7 5.0 13.5 7.0 1.5
HB22070 72.2 78.8 72.0 95.1 0.0 4.5 6.0 4.0
QT22087 75.0 41.2 70.7 72.8 3.0 8.0 9.0 2.5
QT22094 79.2 100.0 69.3 80.6 4.0 10.0 6.5 4.0
QT22098 76.4 100.0 78.7 94.2 0.0 5.5 4.0 4.0
QT22124 52.8 100.0 57.3 92.2 0.0 10.0 3.0 0.0
QT22133 88.9 55.3 58.7 100.0 0.0 0.0 5.0 0.0
QT22135 66.7 100.0 56.0 82.5 0.0 10.0 1.5 1.5
QT22144 80.6 45.9 77.3 61.2 4.0 10.0 7.0 3.5
QT22161 80.6 57.6 62.7 100.0 0.0 8.0 7.5 3.5
QT22165 77.8 52.9 60.0 88.3 2.5 0.0 7.5 2.0
Reference strain 95.0 100.0 80.0 100.0 5.0 18.0 9.0 5.0

2.5.2 灰色关联度分析: 表 4中的结果进行灰色关联度分析,得到了每个菌株的灰色关联度和排序(表 5),可以看出,菌株TW21990、QT22040和QT22094的灰色关联度较高,分别为0.849 5、0.798 6和0.732 6,因此这3个菌株的综合生防性状较好。

表 5 21株初筛木霉菌株的灰色关联度及排序 Table 5 The grey related degree and relative important order of Trichoderma strains
排序
Order
菌株
Strains
灰色关联度
Grey relation degree
1 TW21990 0.849 5
2 QT22040 0.798 6
3 QT22094 0.732 6
4 QT22098 0.690 4
5 QT22066 0.684 3
6 QT22000 0.679 4
7 QT21978 0.666 6
8 QT22144 0.663 6
9 TW22035 0.658 1
10 QT22161 0.648 6
11 QT22033 0.647 6
12 HB22070 0.646 2
13 QT22087 0.643 9
14 QT21973 0.632 5
15 QT21969 0.631 3
16 QT22165 0.595 5
17 SC21982 0.595 2
18 QT21979 0.592 1
19 QT22124 0.582 2
20 QT22135 0.580 9
21 QT22133 0.574 5
3 讨论

我国已被列为世界上12个高度生物多样性的国家和地区之一,但作为生物重要组成部分的真菌多样性的研究远落后于许多国家,目前很难准确地阐明我国或任何一个地区的真菌物种种类的分布和生态坏境[13]。木霉是重要的真菌资源,在工业、农业及环境保护等领域有着广泛的应用价值,对木霉资源的系统调查及深入研究显得尤为重要。

近年来国内外相继开展了对木霉资源的收集和整理工作,木霉已知种和新种的报道呈急速增长趋势。如Blaszczyk等从波兰分离的170株木霉中鉴定了14个种类[14];Jaklitsch等从南欧及马卡罗尼西亚等地区中分离的650株木霉中鉴定出90个种类,其中17个为新种[15];Kamala等从印度分离的193株木霉中鉴定了22个种类[16];Sun等从中国各地分离的1 910株木霉中鉴定了23个种类,其中3个为中国新记录种[17];Saravanakumar等从中国南方滩涂湿地分离的254株木霉中鉴定了13个种类,其中2个为未知种类[18]。可见木霉是世界性分布真菌,种类繁多,发现新种的可能性也较大。相比以上研究,本研究只对中国湖南省洞庭湖湿地中的木霉资源进行了调查,从采集的52个样品中分离得到114株木霉,鉴定了16个种类,其中一个为中国新记录种(T. capillare),一个为疑似新种。虽然采集样品数量相比其他大型调查较少,但其中包含的木霉种类却较多,说明该地区木霉资源较为丰富。

土壤真菌多样性受到很多因素的影响,其中最主要的影响因素是植被和土壤类型[19]。植物可以给真菌提供特殊的碳源和能量来源,土壤类型会影响真菌在土壤中的定殖,进而影响真菌的生态位。洞庭湖位于中国湖南省北部,是中国第二大淡水湖,相比于农田及森林等其他生态系统,土壤中水分含量较高,植被受人为因素影响较小,具有更为天然的湿地生态环境。洞庭湖土样中木霉检出率为96.2%,水样中木霉检出率为50.0%,说明木霉在洞庭湖湿地的分布较为普遍,土壤湿地环境更适合木霉的生长。

植被类型对木霉的影响也较大,洞庭湖样品植被共分为13个科,从禾本科和豆科根际分离到的木霉数量较多,占全部木霉总数的35.09%和19.30%,从大戟科中分离到的木霉数量最少,只占0.88%,说明禾本科和豆科根际更适合木霉的定殖,该研究同前人的结果基本一致[20-22],原因可能是该类作物一般种植周期长,农事操作少,农药和化肥用量也较少,其根际环境更有利于木霉的生长和定殖。

研究发现,T. harzianum为洞庭湖湿地中的优势种,占总菌株数量的19.30%,T. harzianum在欧洲、美洲、非洲和亚洲等都有分布,且大都属于较为优势的种,具有世界性分布的特点[14-16, 20-22],这可能与T. harzianum生长温度范围宽,在低温和高温条件下均能较好生长有关,也可能与T. harzianum是一个复合种有关[14, 23-24]

木霉是重要的植物病害生物防治菌株,具有重寄生、产生抗生性代谢产物及降解病原真菌细胞壁等作用。本研究将灰色关联度理论应用到优良菌株的筛选中,使筛选拮抗性菌株的准确性和效率大幅提高。通过对初筛21株木霉的8个生防性状的评价,得到综合效果较好的3株木霉:T. harzianum TW21990、T. longibrachiatum QT22040和T. ovalisporum QT22094,为保护和合理利用木霉资源提供了依据。其中T. harzianum既是洞庭湖湿地的优势种,又是优良菌株,一般来说优势种是具有高度的生态适应性、个体数量多和有竞争优势的一类种群,可能有更高的拮抗活性、重寄生能力和抗生性代谢产物产生能力,具有更好的应用前景。

参考文献
[1]
Kubice CP, Harman GE. Trichoderma and Gliocladium. Volume 1: Basic Biology, Taxonomy and Genetics[M]. London: Taylor and Francis Ltd., 1998: 3-8
[2]
Ghisalberti EL. Anti-infective agents produced by the hyphomycetes genera Trichoderma and Gliocladium[J]. Current Medicinal Chemistry, 2002, 1(4): 343-374.
[3]
Qin WT, Chen K, Zhuang WY. Five Trichoderma species new to China and notes on two other widespread species[J]. Mycosystema, 2016, 35(8): 994-1007.
秦文韬, 陈凯, 庄文颖. 木霉属5个中国新记录种及2种木霉在中国的新分布[J]. 菌物学报, 2016, 35(8): 994-1007.
[4]
Zhu ZX, Zhuang WY. Current understanding of the genus Trichoderma (Hypocreales, Ascomycota)[J]. Mycosystema, 2014, 33(6): 1136-1153.
朱兆香, 庄文颖. 木霉属研究概况[J]. 菌物学报, 2014, 33(6): 1136-1153.
[5]
Zhu ZX, Li Y. Three new Chinese records of Trichoderma (Hypocreaceae)[J]. Mycosystema, 2016, 35(11): 1406-1415.
朱兆香, 李玉. 木霉属3个中国新记录种[J]. 菌物学报, 2016, 35(11): 1406-1415.
[6]
Zhang GZ, Zhang XJ, Li CY, et al. Seven Chinese new records of the genus Trichoderma[J]. Mycosystema, 2016, 35(8): 984-993.
[7]
Qin WT, Zhuang WY. Four new species of Trichoderma with hyaline ascospores in the Brevicompactum and Longibrachiatum clades[J]. Mycosystema, 2016, 35(11): 1317-1336.
[8]
Chen K, Li JS, Zhang GZ, et al. Chinese new record Trichoderma capillare and its functional assessment[J]. Shandong Science, 2016, 29(1): 93-97, 109.
陈凯, 李纪顺, 张广志, 等. 中国新记录种毛细木霉Trichoderma capillare及功能评价[J]. 山东科学, 2016, 29(1): 93-97, 109. DOI:10.3976/j.issn.1002-4026.2016.01.016
[9]
Yang HT. Trichoderma Classification and Identification[M]. Beijing: China Land Press, 2009, 19-59.
杨合同. 木霉分类与鉴定[M]. 北京: 中国大地出版社, 2009, 19-59.
[10]
Zhu XT, Zhao Y, Wang K, et al. Cloning of a novel chitinase gene TlChi46 from Trichoderma longibrachiatum parasitizing on Meloidogyne incognita eggs[J]. Acta Phytopathologica Sinica, 2016, 46(1): 72-83.
朱先婷, 赵洋, 王凯, 等. 寄生于南方根结线虫卵的长梗木霉几丁质酶基因TlChi46的克隆[J]. 植物病理学报, 2016, 46(1): 72-83.
[11]
Xu WF, Mao ZQ, Sun HT, et al. The application of the gray related degree analysis in screening Trichoderma spp.[J]. Journal of Shandong Agricultural University: Natural Science, 2012, 43(2): 189-192, 196.
徐文凤, 毛志泉, 孙海涛, 等. 灰色关联度分析法在拮抗丝核菌木霉菌株筛选中的应用[J]. 山东农业大学学报:自然科学版, 2012, 43(2): 189-192, 196.
[12]
He ZD, Ji ZX, Gao YF, et al. Study on screening fermentation condition of biocontrol Trichoderma by grey relational analysis[J]. Acta Agriculturae Boreali-Occidentalis Sinica, 2015, 24(3): 163-169.
贺字典, 吉志新, 高玉峰, 等. 灰色关联分析筛选抗逆生防木霉发酵条件的研究[J]. 西北农业学报, 2015, 24(3): 163-169. DOI:10.7606/j.issn.1004-1389.2015.03.025
[13]
Xia CH. Biodiversity research of the genus Trichoderma from Yunnan province: data from morphology and ITS sequence[D]. Kunming: Master's Thesis of Southwest Forestry University, 2009: 1-2 (in Chinese)
夏长虹. 云南省部分地区木霉属真菌多样性及ITS序列分析[D]. 昆明: 西南林学院硕士学位论文, 2009: 1-2
[14]
Błaszczyk L, Popiel D, Chełkowski J, et al. Species diversity of Trichoderma in Poland[J]. Journal of Applied Genetics, 2011, 52(2): 233-243. DOI:10.1007/s13353-011-0039-z
[15]
Jaklitsch WM, Voglmayr H. Biodiversity of Trichoderma (Hypocreaceae) in southern Europe and Macaronesia[J]. Studies in Mycology, 2015, 80: 1-87. DOI:10.1016/j.simyco.2014.11.001
[16]
Kamala T, Devi SI, Sharma KC, et al. Phylogeny and taxonomical investigation of Trichoderma spp. from Indian region of indo-Burma biodiversity hot spot region with special reference to Manipur[J]. BioMed Research International, 2015, 2015: 285261. DOI:10.1155/2015/285261
[17]
Sun RY, Liu ZC, Fu KH, et al. Trichoderma biodiversity in China[J]. Journal of Applied Genetics, 2012, 53(3): 343-354. DOI:10.1007/s13353-012-0093-1
[18]
Saravanakumar K, Yu CJ, Dou K, et al. Biodiversity of Trichoderma community in the tidal flats and wetland of southeastern China[J]. PLoS One, 2016, 11(12): e0168020. DOI:10.1371/journal.pone.0168020
[19]
Hagn A, Pritsch K, Schloter M, et al. Fungal diversity in agricultural soil under different farming management systems, with special reference to biocontrol strains of Trichoderma spp.[J]. Biology and Fertility of Soils, 2003, 38(4): 236-244. DOI:10.1007/s00374-003-0651-0
[20]
Jiang Y. Biodiversity and agricultural functional assessment of Trichoderma from agricultural ecosystem in Zhejiang, Anhui, Jiangsu, Shandong and Shanxi province[D]. Hangzhou: Master's Thesis of Zhejiang University, 2016: 35-48 (in Chinese)
姜远. 浙皖苏鲁晋五省农田生态系统木霉菌多样性及其农业功能评价[D]. 杭州: 浙江大学硕士学位论文, 2016: 35-48
[21]
Li GJ. Study of diversity of Trichoderma isolated from east China[D]. Shanghai: Master's Thesis of Shanghai Jiao tong University, 2011: 29-33 (in Chinese)
李广记. 华东地区木霉菌多样性研究[D]. 上海: 上海交通大学硕士学位论文, 2011: 29-33
[22]
Lin RZ. Northeast farmland Trichoderma collect identification, evaluation and cellulose activity optimization of fermentation conditions[D]. Shenyang: Master's Thesis of Shenyang Agricultural University, 2016: 32-40 (in Chinese)
林润泽. 东北农田木霉菌的鉴定、酶活评价及其纤维素酶发酵工艺[D]. 沈阳: 沈阳农业大学硕士学位论文, 2016: 32-40
[23]
Druzhinina IS, Kubicek CP, Komoń-Zelazowska M, et al. The Trichoderma harzianum demon: complex speciation history resulting in coexistence of hypothetical biological species, recent agamospecies and numerous relict lineages[J]. BMC Evolutionary Biology, 2010, 10(1): 94. DOI:10.1186/1471-2148-10-94
[24]
Chaverri P, Castlebury LA, Samuels GJ, et al. Multilocus phylogenetic structure within the Trichoderma harzianum/ Hypocrea lixii complex[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 2003, 27(2): 302-313. DOI:10.1016/S1055-7903(02)00400-1