灵芝(Ganodema lingzhi)在我国历史悠久，是一种药用价值很高的中药材。近年来的分子生物学证据表明，我国的栽培灵芝是模式产地属于中国的灵芝新种Ganodema lingzhi Sheng H. Wu, Y. Cao & Y.C. Dai^[1-2]，属于真菌界担子菌门伞菌纲多孔菌目灵芝科灵芝属的成员^[3]，俗称“仙草”、“还魂草”，一直被视为滋补强身、延年益寿的珍贵药材。现代医学表明，灵芝具有调节免疫力、抗肿瘤、抗衰老、保肝、提高机体耐缺氧能力等活性^[4-5]，对于治疗高血压、高血脂、肝病、心血管疾病等具有良好的临床疗效^[6]。

灵芝具有多种活性物质。三萜类化合物是其主要的活性物质之一。灵芝中三萜类化合物种类很多，目前统计，国内外研究人员已分离出一百多种三萜成分^[7-8]。灵芝酸A和灵芝酸B是1982年首次从灵芝中分离出的三萜类化合物^[9]。药理研究表明，灵芝三萜具有解毒、保肝、抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗组织胺释放、抑制血管紧张素、调节免疫力等功效^[10-11]。比色法^[12-13]和高效液相色谱法^[14-20]是灵芝三萜定量分析的主要方法，其中比色法用齐墩果酸或熊果酸为对照品，测得总三萜的含量往往与实际含量有较大差别，HPLC法具有分离效果好、重现性好、灵敏度高等优点，目前广泛用于灵芝三萜的测定方法中。但由于灵芝酸的标准品难以分离纯化，国内HPLC法测定灵芝三萜成分的文献中，所建方法测定一种三萜酸或几种三萜酸的较多，王筱婧等^[20]建立了测定灵芝酸C₂的HPLC方法，董虹玲^[14]等、姚松君^[21]建立了同时测定灵芝酸C₂、灵芝酸G和灵芝酸A三种三萜酸的方法，李保明^[16]等建立了同时测定9种三萜酸的方法等。灵芝三萜类化合物的测定方法有两个标准：NY/SJ 339-2001和NY/T 2278-2012。NY/SJ 339-2001标准具有误差大、试剂干扰等不足；NY/T 2278-2012标准仅适用于灵芝酸A和灵芝酸B的HPLC方法测定。本文在实验室分离纯化多种三萜标准品的基础上，建立了同时测定灵芝三萜中包括酸性部分和中性部分的12种三萜标准品高效液相色谱梯度洗脱的方法，通过方法学检验，该方法简单、精密度高、重复性好，并用此方法测定了不同产地及品种灵芝子实体三萜类成分的含量。

1 材料与方法 1.1 材料

福建省产地：菌草鹿角状灵芝(FJ)国家菌草工程技术研究中心提供；浙江省产地：生产119 (ZJ)；安徽省产地：黄山1号(AH)；吉林省产地：赤芝(JL-1)，野生灵芝1 (JL-2)，野生灵芝2 (JL-3)。

1.2 主要试剂

灵芝酸C₂、灵芝酸B、灵芝酸A、灵芝酮三醇、灵芝酸DM、灵芝酸T、灵芝醇B、灵芝酸S、灵芝酸G、灵芝酸F、灵芝酸D、灵芝稀酸B等三萜标准品购自美国Sigma公司；色谱纯乙腈，美国Dikma公司；甲醇、冰醋酸，国药集团药业股份有限公司；水为超纯水。

1.3 主要仪器

Waters 600型高效液相色谱仪系统：在线脱气，四元泵，Waters 717 plus自动进样器，柱温箱，Waters 2996型二极管阵列检测器，Empower色谱工作站及数据处理系统，美国Waters公司；KQ-600B型超声清洗器，昆山市超声仪器有限公司；ELGA PURELAB Ultra超纯水仪，威立雅水处理技术(上海)有限公司；5415D微型离心机，德国Eppendorf公司；MS105DU电子分析天平，瑞士Metter Toledo公司；小型粉碎机，上海淀九中药机械制造有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 高效液相色谱条件: 选用Agilent ZORBAX SB-Aq (4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，以乙腈-醋酸(0.01%)水溶液为流动相进行梯度洗脱，流速1.0 mL/min，190 nm−400 nm 3D数据采集，柱温30，进样量20 μL，分析波长为252 nm，梯度洗脱程序：乙腈(A)-醋酸(0.01%)水溶液(B)：0→25 min，A：28%→30%；25→50 min，A：30%→39%；50→60 min，A：39%→60%；60→85 min，A：60%→100%；85→100 min，A：100%；100→ 101 min，A：100%→28%；101→110 min，A：28%。

1.4.2 标准品溶液的制备: (1)单标溶液的配制：精密称取干燥至恒重的12种三萜标准品：灵芝酸C₂、灵芝酸B、灵芝酸A、灵芝酮三醇GT-2、灵芝酸DM、灵芝酸T、灵芝醇B、灵芝酸S、灵芝酸G、灵芝酸F、灵芝酸D、灵芝稀酸B各适量，分别加入甲醇配制成1 g/L的标准品储备液，备用。 (2)系列混合标准品溶液的制备：精密量取上述单一标准品溶液各适量，置于25 mL容量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，制成含灵芝酸C₂ (100 mg/L)、灵芝酸B (100 mg/L)、灵芝酸A (100 mg/L)、灵芝酮三醇GT-2 (105 mg/L)、灵芝酸DM (100 mg/L)、灵芝酸T (95 mg/L)、灵芝酸B (100 mg/L)、灵芝酸S (105 mg/L)、灵芝酸G (112 mg/L)、灵芝酸F (130 mg/L)、灵芝酸D (106 mg/L)、灵芝稀酸B (100 mg/L)的混合标准品溶液，并稀释成6个系列浓度混合标准品溶液，备用。

1.4.3 样品溶液的制备: 分别取粉碎后的样品0.5 g，置于10 mL带塞的试管中，精确加入10 mL无水乙醇，密塞，摇匀，连续超声(功率600 W，频率40 kHz)提取1 h，冷却至室温，补足失重，摇匀，移取2.0 mL于离心管中，13 200 r/min离心2 min，移取上清液，过0.22 μm微孔有机相滤膜，滤液供HPLC分析用。 2 结果与分析 2.1 三萜类标准样品的定性分析

将三萜类成分的单一标准品溶液与1.4.2(2)项中的混合标准品溶液分别进样分析，根据三萜类成分的保留时间定性，三萜混合标准品图谱及样品(菌草鹿角状灵芝)的分析图谱，结果如图 1所示。由图 1可知，在上述色谱条件下，各色谱峰分离度良好，12种三萜类标准样品的保留时间分别为灵芝酸C₂：24.43±0.01 min；灵芝酸G：24.42±0.01 min；灵芝稀酸B：30.90±0.00 min；灵芝酸B：33.71±0.01 min；灵芝酸A：41.22±0.01 min；灵芝酸D：49.12±0.01 min；灵芝酸F：58.16±0.02 min；灵芝酮三醇：70.88±0.01 min；灵芝酸DM：74.17±0.01 min；灵芝酸S：78.75±0.01 min；灵芝酸T：78.01±0.01 min；灵芝醇B：81.04±0.01 min。

2.2 方法学验证

2.2.1 线性关系考察: 将1.4.2(2)项中6个系列浓度混合标准品溶液按照2.1项中的色谱条件进行HPLC检测分析，测定峰面积，以标准品溶液浓度为X轴，色谱峰面积Y轴绘制标准曲线，得回归方程、相关系数，结果见表 1。

2.2.2 精密度实验: 取1.4.2(2)项中同一混合标准品溶液，连续进样6次，记录每种核苷类成分峰面积并计算峰面积的RSD，结果见表 1，表明仪器精密度良好。

2.2.3 重复性实验: 精确称取同一灵芝样品6份，按照1.4.3项方法平行制备样品溶液，并分别进样测定，计算每种三萜类成分的含量，并分别计算出含量的RSD，结果见表 1，表明测定方法的重复性良好。

2.2.4 稳定性实验: 取同一样品溶液，分别于0、2、4、8、12 h进样，按照1.4.1项的色谱条件进行测定，分别计算每种三萜类成分峰面积，分别求出RSD，结果见表 1，表明样品溶液在12 h内稳定性良好。

2.2.5 加样回收率实验: 精密称取同一已知含量的灵芝样品6份，按1.4.3项制备供试样品溶液，分别准确加入一定量的混合标准品溶液，进行HPLC测定分析，计算回收率。结果见表 2。 2.3 样品含量测定

精确称取待测样品各两份，按1.4.3项方法制备样品溶液，按上述色谱条件进行测定，通过样品HPLC色谱图洗脱峰的保留时间与标准样对比，得出待测样品所含三萜的种类，外标曲线法计算各样品中所含三萜的含量，结果见表 3和图 2。

通过对不同产地中12种三萜成分含量测定发现，不同产地中所含三萜类成分在组成和含量上有显著差异。以福建的菌草鹿角状灵芝中的灵芝酸含量最高，野生灵芝中灵芝酸含量较低；栽培灵芝12种灵芝酸中灵芝酸A所占比例最高，FJ、ZJ、AH、JL-1灵芝品种中灵芝酸A分别占灵芝酸总量的23.69%、39.06%、33.78%、28.25%；同时比较了从吉林省收集的野生灵芝中三萜的含量，结果发现，所收集的野生灵芝中仅含有少量的灵芝酸F、灵芝酮三醇、灵芝酸DM、灵芝酸S、灵芝酸T、灵芝酸B，JL-2中检测出少量的灵芝酸A。

3 讨论

目前，国内外文献对灵芝酸D、灵芝酸F、灵芝酮三醇的HPLC测定报道较少。本文在张圣龙^[22]实验方法的基础上开发了包含这3种三萜成分在内同时测定灵芝酸C₂、灵芝酸B、灵芝酸A、灵芝酮三醇GT-2、灵芝酸DM、灵芝酸T、灵芝醇B、灵芝酸S、灵芝酸G、灵芝酸F、灵芝酸D、灵芝稀酸B等12种三萜成分的高效液相色谱法。此方法涉及到中草药与食药用菌中12种常见的三萜类成分，与目前关于灵芝子实体中三萜类成分测定的高效液相色谱法相比，本研究测定的三萜类成分种类多、分离度高、覆盖面广，具有较强的代表性、参考性和实用价值。方法学考察结果显示，该方法灵敏度高、重复性与稳定性好，适用于灵芝子实体中12种三萜类成分的测定分析，为评价灵芝子实体的质量提供了测定方法和手段。

三萜类成分是评价灵芝质量的指标之一，通过分析比较发现不同来源的灵芝三萜含量差别较大，高达3倍以上，这可能与多种因素有关。开发保健食品等新产品要选择活性较高的原料，本文可为新产品的开发提供借鉴。同时我们发现吉林长白山上采集的野生灵芝与吉林的栽培灵芝相比，三萜含量远远低于栽培灵芝，总三萜的含量仅为栽培灵芝的十分之一。所测原料中，如果从三萜含量来评定灵芝的质量，野生灵芝的价值要低于栽培灵芝，是否野生灵芝在其他成分方面有差异，还需进行进一步的研究。