单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，以下简称Lm)是一种短小的革兰氏阳性无芽胞兼性厌氧杆菌，属于李斯特菌属，是人畜共患传染病李斯特菌病(Listeriosis)的主要病原菌，能引起人和动物脑膜炎、败血症、流产和单核细胞增多等症状^[1]。Lm在自然界分布广泛，并能在多数固体表面(如食品及食品加工运输和储藏的接触面，甚至非食品加工接触面)形成高度组织化和系统化的生物被膜(Biofilm)结构，从而具有更强的抗逆性，常规杀菌方法不能有效杀灭它们，严重威胁食品卫生安全^[2]。虽然到目前为止Lm对绝大多数常见的抗生素都是敏感的，临床上也通常使用氨苄西林、利福平、盘尼西林或者与庆大霉素结合治疗李斯特菌病，但越来越多的文献报道显示Lm耐药性已逐渐增强^[3-4]。因此深入研究Lm对抗生素的耐受性机制不仅具有重要的基础科研意义，而且具有潜在的临床应用价值。

细胞壁是细菌赖以生存的重要结构基础。细菌细胞壁的结构和成分与机体对细菌的特异性反应，以及自然因素对细菌的选择性作用(抗生素、噬菌体等)等密切相关^[5]。L-鼠李糖(Rhamnose)是一种6-脱氧己糖，广泛存在于许多病原菌的细胞壁及荚膜中。合成该糖的4种关键酶分别由rmlA、rmlB、rmlC、rmlD四个基因所形成的操纵子编码，其核苷酸组成在不同细菌中较为保守^[6]。由于人体内不存在L-鼠李糖，针对L-鼠李糖合成中相关酶系的药物可能具有较好的选择毒性，因此，以dTDP-L-鼠李糖的合成途径作为潜在的药物靶点是近几年病原菌的研究热点^[6]。Lm中也存在编码鼠李糖合成途径所需酶的基因，但其对于细菌的生存和致病力方面的研究报道并不多见。本研究通过同源重组的方法构建了Lm中L-鼠李糖合成过程关键酶dTDP-D-葡萄糖-4, 6-脱氢酶的编码基因rmlB的缺失突变株，并对其生物学特征、生物被膜形成能力、抗生素耐受性和毒力基因的转录表达等进行分析，证实了rmlB基因在Lm生物被膜的形成、耐受作用位点位于细胞壁和细胞膜的抗生素以及细菌毒力等方面具有重要作用。

1 材料与方法 1.1 实验材料

1.1.1 菌株、质粒及引物: 单核细胞增生李斯特菌野生菌株EGDe (血清型1/2a；全基因组序列已知^[7])和温度敏感型穿梭整合质粒pLSV101为德国维尔茨堡大学微生物系Werner Goebel教授馈赠。引物(表 1)由天一辉远生物科技有限公司合成。

1.1.2 主要试剂和仪器: 限制性内切酶、Prime STAR Max、DNA连接酶、RNA反转录试剂盒，TaKaRa公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒，爱思进生物技术有限公司；DNA纯化试剂盒，天根生化科技有限公司；2×EsTaqMaster Mix，康为世纪生物科技有限公司；PCR仪，Applied Biosystems；分光光度计，HACH；酶标仪，BioTek。

1.1.3 培养基和培养条件: BHI培养基(g/L)：脑心浸液37；LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 10.0。Lm菌株于37 180 r/min振荡培养。 1.2 EGDe∆rmlB缺失突变株的构建

采用SOEing PCR方法(即PCR-mediated recombination method^[8])构建缺失菌株：以EGDe基因组DNA为模板用引物P1和P2、P3和P4分别扩增rmlB基因ORF上下游同源臂A (452 bp)和B (406 bp)片段；PCR产物经纯化后作为模板，以P1和P4为引物进行再一次PCR，从而获得含有BamH Ⅰ和EcoR I酶切位点的AB融合片段rmlB (A+B) (987 bp)。PCR反应体系：EGDe基因组2 μL，Prime STAR Max 25 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，超纯水补足至50 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，30个循环；72 ℃ 10 min。

用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ对融合片段rmlB(A+B)和质粒pLSV101进行双酶切，将酶切并纯化后的融合片段rmlB(A+B)连接到质粒pLSV101上，构建重组穿梭质粒pLSV101-rmlB(A+B)，然后将其电转入EGDe感受态细胞中，按照张强等的方法^[8]进行同源重组和筛选rmlB基因缺失的突变子EGDe∆rmlB。所得突变子经PCR (以rmlB基因上下游引物对P5和P6 PCR扩增EGDe∆rmlB中的rmlB基因片段，以EGDe基因组为对照来验证rmlB基因的缺失)和测序验证。

1.3 细菌鞭毛运动性试验

采用半固体琼脂穿刺法观察细菌鞭毛的运动性^[9]：将待测菌株培养至OD₆₀₀达0.8−1.0，用直的接种针挑取菌液后穿刺接种于半固体BHI培养基中，24鞭毛蛋白的表达受到温度严格调控，30以上鞭毛蛋白不表达)静置培养1−2周，每天观察。如果细菌由穿刺线向四周云雾状扩散，则判定该细菌有运动性。

1.4 细菌抗生素敏感性实验

1.4.1 最低抑菌浓度法(Minimal inhibitory concentration, MIC): 将待测菌株培养至对数期(OD₆₀₀达0.5)，在96孔微孔板中加入含有两倍倍比稀释抗生素的BHI培养基，取适量菌液加入96孔微孔板中使其终浓度约5×10⁵CFU/mL。同时设置2种对照：(1) 培养物对照，接种同数量的菌液，不加抗生素；(2) 培养基对照，不接种菌液，不加抗生素。将微孔板置于37 ℃，静置培养18−22 h后取出在酶标仪(BioTek，Synergy 2)下测定其OD₆₀₀值，以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC，每次试验重复3次^[10]。

1.4.2 K-B纸片琼脂扩散法(Disc agar diffusion method): 将待测菌株培养至对数期(OD₆₀₀达0.5)稀释至5×10⁶CFU/mL后，取固定量菌液0.35 mL均匀涂布于BHI平板^[11]。将含有待测抗生素的药敏纸片(Oxoid)均匀贴在涂好菌的平板表面，37 ℃培养22−24 h后，测量纸片周围没有细菌生长的完全抑制区直径，统计数据，每种抗生素重复3次。

1.4.3 抗生素耐受试验(The tolerance assay): 将待测菌株培养至稳定期(OD₆₀₀达2.5)，1:50接种于新鲜的含有32 mg/L Penicillin G^[12-13]的BHI培养基中，37振荡培养至相应时间后(0、0.3、3、6、9、12、24 h)，取菌液稀释至适当倍数后涂布于BHI平板，37培养约22 h后，计数平板中菌落数，绘制细菌存活曲线，每次试验重复3次。 1.5 微孔板法检测菌株的生长和生物被膜的形成

具体方法参照冯飞飞等^[14]和Djordjevic等^[15]的报道进行：将待测菌株培养至对数期早期(OD₆₀₀达0.2)稀释后加入96孔微孔板。37静置培养至相应时间(1、2、3、5、7 d)后，先用酶标仪测定其生长情况(OD₆₀₀)，然后弃去各孔培养基，经草酸铵结晶紫染色，95%乙醇溶液脱色后，用酶标仪测定其OD₅₉₅值。将脱色并干燥后的生物被膜直接放在倒置显微镜下(重光COIC XDS-1B)观察，选取最佳视野拍照。所获得实验数据使用Origin 6.1和SPSS进行分析处理。

1.6 细菌溶血活性检测

取1 mL无菌脱纤维绵羊血，2 600 r/min离心5 min，弃上清。用生理盐水洗涤血细胞沉淀，清洗3次。用50倍体积生理盐水重悬血细胞，并以每支1 mL分装于1.5 mL离心管中。将待测菌培养至OD₆₀₀达1.0左右，取待测菌液10、20、30、50、100 μL不同量的菌液加入含有血细胞的离心管中，37 ℃静置培养30 min后，2 600 r/min离心5 min，收集上清，在分光光度计上检测543 nm处吸光度值。以只含有血细胞的上清作为阴性对照，加入了等量无菌水的上清作为阳性对照。试验重复3次。

1.7 RT-PCR检测基因的转录表达水平

将离心收集的细菌在液氮中充分地研磨成粉，之后采用Trizol法提取细菌总RNA^[16]。按照反转录试剂盒(TaKaRa)操作说明将总RNA反转录成cDNA。应用PrimerPremier 5.0软件设计目的基因引物(见表 1)，以cDNA为模板，PCR扩增目的基因(以管家基因rpoB为内参基因)。试验重复3次。PCR反应体系：cDNA 1.6 μL，2×EsTaqMaster Mix 10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，超纯水补足至20 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，62 ℃ to 52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，20个循环；95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，10个循环；72 ℃ 10 min。用Quantity One软件分析RT-PCR凝胶电泳图灰度值。所有数据采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析并作图。

2 结果与分析 2.1 EGDe∆rmlB缺失突变株的构建及其生物学特性

2.1.1 EGDe∆rmlB缺失突变株的构建: 如图 1所示：用rmlB基因两端引物P5和P6进行PCR扩增，以EGDe∆rmlB为模板所得片段比EGDe为模板短约790 bp，其长度与预期结果一致。表明EGDe∆rmlB成功缺失了rmlB基因，同时DNA测序结果也进一步证明EGDe∆rmlB构建成功。

2.1.2 缺失菌株EGDe∆rmlB的生物学特性: 如图 2A所示，野生株EGDe和缺失株EGDe∆rmlB在营养丰富的BHI培养基中生长快速且生物量较高，而在营养相对贫瘠的LB培养基中生长较为缓慢，但是两种菌株的生长趋势基本一致。在24条件下两种菌株均能形成鞭毛，致使其都能够在半固体培养基中扩散，从而形成了伞状结构(图 2B)；两种菌株在油镜下均为短杆状，大小约0.5 μm−2.0 μm，形态和大小没有明显区别(图 2C)。 以上结果表明，缺失rmlB基因并未对单核细胞增生李斯特菌的生长、细胞形态及其运动性造成影响。 2.2 rmlB基因缺失对单核细胞增生李斯特菌生物被膜形成的影响

如图 3A所示：在1、2、3、5、7 d的培养过程中，野生菌株和EGDe∆rmlB在各时间段的生长量无明显差异；与野生菌株EGDe相比，EGDe∆rmlB形成的生物被膜量显著降低，在1、2、3、5、7 d分别下降了27.10%、37.52%、46.42%、37.97%和38.85% (图 3B)。

显微镜下两种菌株形成的生物被膜结构显示(图 3C)：野生型菌株EGDe形成的链网状生物被膜结构致密，孔隙很小；而EGDe∆rmlB虽然能形成完整的链网状生物被膜，但其结构疏散、孔隙较大。该结果与上述微孔板定量检测结果相符合，表明rmlB基因的缺失降低了Lm生物被膜形成的能力。

2.3 rmlB基因缺失对单核细胞增生李斯特菌耐药性的影响

2.3.1 比较EGDe和EGDe∆rmlB对抗生素的敏感性: 如表 2所示，与EGDe相比，EGDe∆rmlB对盘尼西林(Penicillin G)、氨苄西林(Ampicillin)和红霉素(Erythromycin)的MIC值以及对利福平(Rifampicin)的抑菌圈直径大小没有显著差异(P≥0.05)，但对杆菌肽(Bacitracin)的MIC值显著下降，抑菌圈直径显著增加(P≤0.01)。同时，EGDe∆rmlB对头孢菌素类(头孢呋辛Cefuroxime、头孢噻肟Cefotaxime、头孢吡肟Cefepime)的抑菌圈直径明显增大(P≤0.01)。由于杆菌肽、头孢菌素、盘尼西林和氨苄西林都是常用的作用位点在细菌细胞壁和细胞膜的抗生素，而红霉素和利福平则是作用于细菌蛋白质合成的抗生素，因此，上述结果暗示rmlB基因的缺失可能专一性地影响细菌对作用位点在细胞壁和细胞膜的抗生素的敏感性。由于EGDe∆rmlB对盘尼西林和氨苄西林的MIC与野生株EGDe相比没有差异，因此，我们以盘尼西林为例，进一步比较了EGDe与EGDe∆rmlB对高浓度盘尼西林的耐受性。如图 4所示：在含有致死浓度盘尼西林(32 mg/L)的BHI培养基中，与EGDe相比，EGDe∆rmlB在3 h后出现明显迟滞，活菌数快速下降，在6 h时活菌数降低最为显著；之后，EGDe活菌数也快速下降，12 h后两菌死亡速率逐渐趋同。以上结果表明，尽管EGDe∆rmlB与野生株EGDe相比对盘尼西林的MIC没有差异，但是缺失rmlB后，细菌对高浓度盘尼西林的耐受性显著降低。

2.3.2 比较青霉素结合蛋白在EGDe和EGDe∆rmlB中的转录表达差异: 青霉素结合蛋白(Penicillin-binding proteins，PBPs)是参与细菌细胞壁肽聚糖生物合成的酶。它们的正常存在是细菌保持正常形态及功能的必需条件^[17]。头孢菌素类和青霉素类等β-内酰胺类抗生素，主要通过作用于细菌表面的PBPs而产生抗菌活性。不同细菌PBPs的种类及含量各不相同。PBPs结构与数量的改变是细菌产生耐药性的一个重要机制^[18]。在Lm中，PBPs及其类似物共有7种，其编码基因分别是lmo0441、lmo2229、lmo0540、lmo1438、lmo2754、lmo1892和lmo2039。为了探究rmlB缺失后，细菌对β-内酰胺抗生素敏感性增加的具体机制，我们比较了以上7种PBPs在EGDe和EGDe∆rmlB中的转录表达差异。结果如图 5所示，7种PBPs里，只有lmo2229在EGDe∆rmlB中的转录表达显著降低(P≤0.01)，暗示lmo2229表达量的降低可能是EGDe∆rmlB对β-内酰胺类抗生素以及杆菌肽敏感性增加的原因。 2.4 rmlB基因缺失对单核细胞增生李斯特菌毒力的影响

2.4.1 比较主要毒力基因在EGDe和EGDe∆rmlB中的转录表达差异: Lm的致病机制主要与毒力岛1 (LIPI-1)中的基因表达相关^[19]。该毒力岛由基因hly、plcA、plcB、mpl、actA及主要毒力基因调控蛋白编码基因prfA共同组成的一段9 kb长的基因簇组成。缺失该基因簇将导致Lm毒力完全丧失^[19]。为探究rmlB基因的缺失对Lm毒力的影响，比较了EGDe和EGDe∆rmlB中主要毒力基因prfA、plcA、plcB、actA、mpl和hly的转录表达。结果如图 6所示，hly基因在EGDeΔrmlB中的转录表达显著下降。由hly基因编码的李斯特菌溶血素(Listeriolysin O，LLO)能裂解宿主吞噬体的双层膜，帮助细菌从吞噬体逃逸到宿主细胞胞质，是细菌得以在宿主细胞内繁殖所必需的最重要的毒力因子^[19]。hly转录表达水平的下降暗示EGDeΔrmlB的致病性也可能随之降低。

2.4.2 rmlB基因缺失对单核细胞增生李斯特菌溶血活性的影响: 如前所述，rmlB基因缺失后导致主要毒力基因hly的转录表达显著降低。为确定hly基因编码蛋白LLO的活性是否也因此降低，进行了细菌溶血活性检验。结果如图 7所示，随着细菌菌液含量的增加，细菌中LLO的浓度升高，溶血活性也随之上升。但与EGDe相比，EGDeΔrmlB的溶血活性明显降低，当细菌接菌量为100 μl时，差异最为显著(P≤0.01)。该结果与hly转录水平的检测结果相一致，说明rmlB基因的缺失造成Lm主要毒力基因hly转录和翻译水平下降，从而导致Lm毒力降低。 3 讨论

L-鼠李糖是广泛存在于许多病原菌的细胞壁及荚膜中的六碳糖。细胞壁和荚膜对于细菌的存活至关重要。在感染阶段，细菌通过细胞壁和荚膜与宿主细胞相互作用。L-鼠李糖合成途径在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中都是普遍存在且高度保守的。迄今为止，在人体内还没有发现L-鼠李糖及其合成相关基因。因此，以dTDP-L-鼠李糖的合成途径作为潜在的药物靶点是近几年病原菌的研究热点^[6]。然而，研究发现，敲除保守的L-鼠李糖合成途径中的关键基因后，不同细菌的表征并不完全相同。在结核分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)中，敲除rmlB和(或) rmlC后，细菌不再生长^[20]；在变异链球菌(Streptococcus mutans)中，敲除操纵子中任何一个基因都将抑制细菌细胞壁多糖的合成，导致细菌毒性的降低^[21]；但是在大肠杆菌(Escherichia coli O2:K1)中，缺失rmlB基因后细菌的生长并不受任何影响，突变菌株中的O抗原仍然含有L-鼠李糖，作者认为该菌株中可能存在RmlB的同工酶或者L-鼠李糖的其它合成途径^[22]。

Lm中也存在L-鼠李糖合成途径rmlACBD操纵子的基因位点^[23]。当该操纵子缺失后，细菌壁磷壁酸(Wall teichoic acids)中就缺少L-鼠李糖成分，说明在Lm中rmlACBD操纵子对于L-鼠李糖的合成是必不可少的^[24]。但Lm的13个血清型里只有血清型1/2a、1/2b、1/2c、3c和7菌株中具有该基因位点，而且在3c和7菌株中因rmlACBD操纵子具有碱基突变而不能合成L-鼠李糖，因此只有血清型1/2a、1/2b、1/2c菌株的壁磷壁酸的主要成分是L-鼠李糖^[23]。由此我们推测，尽管壁磷壁酸是革兰氏阳性菌细胞壁的特殊组分，在细菌形态、分裂和耐药性等方面起着重要作用^[25]，但是，L-鼠李糖合成并不是Lm形态和生长所必需的细胞功能途径。事实上，当我们构建rmlB基因缺失菌株(EGDe∆rmlB)后，发现EGDe∆rmlB的生长及表型都没有明显的变化，该结果与预期高度一致。同时，由于血清型1/2a、1/2b等菌株常在食品中检出，是除血清型4b外导致李斯特菌病的主要血清型^[26]，因此，EGDe∆rmlB生物被膜形成能力显著下降，暗示鼠李糖的合成尽管对于细菌生长和形态没有重要意义，但可能对细菌适应千变万化的食品以及食品加工运输和储藏环境具有重要作用。

Lm对于单环β-内酰胺类(monobactams)及β-内酰胺类抗生素具有天然的抵抗力。例如甲氧西林及广谱头孢菌素类(包括头孢噻肟和头孢他啶)。而李斯特菌的这一特性具有重要的临床意义，因为医院在治疗不明病原菌所引起的发热时首先会选用头孢菌素类抗生素进行治疗^[27]，因此研究李斯特菌耐药性产生的分子机制具有重要意义。我们的实验证明，当缺失合成鼠李糖的关键基因rmlB后，细菌对作用于细胞壁和细胞膜的抗生素(如杆菌肽和头孢菌素等)的耐药性显著降低，其可能机制与lmo2229 (Lm青霉素结合蛋白PBP4的编码基因)表达量降低相关。研究表明，lmo2229基因突变后可导致Lm对β-内酰胺类抗生素敏感性增加^[4]。同时，在肺炎链球菌中，Smith等^[28]和Zhao等^[29]已证明lmo2229同系物PBP2A编码基因序列的变异可降低与β-内酰胺类抗生素的亲和性，从而极大地提高细菌的耐药性和致病力。以上研究说明，lmo2229基因对于Lm抵抗β-内酰胺类抗生素具有重要作用，但其与鼠李糖合成关键酶的相互作用尚未见文献报道，这将会是我们今后研究的重点。

最近，Carvalho等^[24]发现：缺失EGDe的rmlACBD操纵子后，细菌的毒力下降，感染小鼠的肝脏及脾脏中细菌数降低。我们的实验也证明缺失rmlB后，Lm主要毒力因子溶血素LLO的编码基因hly的转录表达及细菌溶血活性显著降低，但是包括毒力基因转录调控蛋白PrfA在内的其它主要毒力因子的表达都没有受到明显影响。该结果一方面验证了Lm壁磷壁酸中的L-鼠李糖对于细菌的致病性具有重要作用，另一方面也暗示其致病机制与hly基因的转录表达相关，因此，阐明其作用途径和方式也成为了我们今后研究的方向。

综上所述，我们的研究结果表明，rmlB基因在Lm生物被膜形成和耐受作用位点在细胞壁和细胞膜的抗生素及细菌毒力方面具有重要作用。