2010年美国生物学家Gibson等^[1]在Science杂志发表了由化学合成的基因组控制的细胞的文章，对最小基因组的研究引起了广泛的关注。最小基因组(Minimal genome)是指在最适宜的条件下，仅仅拥有维持细胞生长繁殖所必需的最少数目的基因。在最小基因组中，敲除任何基因后细胞将无法生存。在研究最小基因组的探索过程中，主要有两种研究思路：一种是“自下而上”地从头合成基因组，例如Smith等^[2]和Gibson等^[3]小组成功报道人工设计和化学合成目前最小基因组；另一种是“自上而下”地逐步敲除冗余基因获取最小基因组，例如Kolisnychenko等^[4]敲除了包括前噬菌体、转座子和未知功能基因片段，使基因组减小了8.1%。由于必需基因精确预测和基因组装的高难度，所以目前对于最小基因组的研究探索中以“自上而下”地逐步敲除冗余基因获取最小基因组为代表的基因组简化(Reduced-genome)是该领域研究的热点之一。

基因组简化是指基因组被适度删除，复杂程度相对减小，并削弱某些非必需基因的代谢影响，从而获得代谢途径相对简单，且对能量的利用效率明显提高的简化细胞。其作为理想的宿主细胞，在生物合成和生产微生物药物中得以广泛的应用。基因组简化的技术策略通常采用染色体大片段缺失。该操作技术主要包括两种：以Red同源重组和Cre/LoxP重组为代表的定点敲除和利用转座子^[5]或者是T-DNA随机插入或切离引发的重组实现DNA片段的随机缺失。Komatsu等^[6]利用Cre/LoxP重组系统对阿维链霉菌进行删减，获得基因组减少1.4 Mb的突变株。Murakami等^[7]通过PCR介导染色体分裂技术，获得了染色体片段缺失531.5 kb的酿酒酵母突变株。Pósfai等^[8]通过大片段基因敲除成功将Escherichia coli K-12基因组减少了15%。除了染色体大片段缺失外，染色体外的质粒消除也是基因组简化研究中的一个重要方向。对于质粒消除的方法并不统一，主要包括物理方法、化学方法和分子生物学方法。如Heery等^[9]第一次报道了用高压电穿孔方法成功消除大肠杆菌DH1的内源质粒pUG2；Patrignani等^[10]利用SDS结合高温成功消除5株乳杆菌属的内源质粒；Imre等^[11]报道了基于转座子两步法消除肠炎沙门氏菌毒性质粒的方法。除列举之外还有如利用中药^[12]、吖啶类^[13]与EB^[14]等诱变剂和冻融法^[15]以及质粒不相容^[16]等方法。

线性质粒普遍存在于链霉菌中^[17]，一般比环形质粒大，有的可以高达1.8 Mb^[18]，而现在已知的抗生素70%以上是由链霉菌产生的，所以质粒消除遗传育种在链霉菌中具有一定的应用潜力。但是，链霉菌线性质粒拷贝数低，非常稳定，常见的质粒消除方法对于环形质粒比较有效，据我们所知，以前还没有使用NTG消除链霉菌线性质粒用于遗传育种的报道。

本研究选用链霉菌FR-008不仅是因为FR-008具有简便的遗传操作，而且其有生长迅速、发酵条件宽松、抗生素产量高等诸多优势^[19-20]，同时肖湘等^[21]报道链霉菌FR-008具有两条明显的线性质粒(pHZ227和pHZ228)，Wang等^[22]将FR-008的砷抗性基因簇定位在大线性质粒pHZ227上。FR-008基因组测序显示pHZ227大小为142 kb (又名pSSFR1，登录号：CP009803.1)，pHZ228大小为24 kb (又名pSSFR2，登录号：CP009804.1)。本研究首次使用NTG诱变来消除FR-008的线性质粒，其丢失频率为4%，并获得了两个杀念菌素产量提高的突变株，是一种有效的遗传育种方法。

1 材料与方法 1.1 实验材料

1.1.1 菌株: 链霉菌FR-008(Streptomycessp. FR-008)、清酒酵母(Saccharomyces sake)与变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)由上海交通大学分子微生物学实验室保存。

1.1.2 培养基^[23]: 链霉菌FR-008和变铅青链霉菌固体培养基为SFM，链霉菌FR-008液体培养基为TSBY，清酒酵母固体培养基为PDA，清酒酵母液体培养基为YEME^[1]。

1.1.3 试剂和仪器: 细胞悬浮液：蔗糖0.3 mol/L，EDTA (pH 8.0) 25 mmol/L，Tris (pH 8.0) 25 mmol/L。蛋白酶K缓冲液：EDTA 93.0 g，Tris碱0.605 g，十二烷基肌氨酸钠5.0 g，蒸馏水定容至500 mL (pH 9.5)。TBE缓冲液：浓贮存液5×：Tris碱54.0 g，硼酸27.5 g，0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 20 mL；使用液(0.5×)：0.045 mol/L Tris−硼酸，0.002 mol/L EDTA。TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA (pH 8.0)。Tris-Maleic acid (Tris-马来酸)溶液：Tris-碱与马来酸的终浓度各为0.25 mol/L (pH 8.0)。1.5%低熔点琼脂糖(Sigma公司)：1.5 g低熔点琼脂糖溶于100 mL TE缓冲液中。1%琼脂糖(Sigma公司)：10 g琼脂糖溶于1 000 mL TBE缓冲液中。NaAsO₂、NTG，购于上海试一化学试剂有限公司。 脉冲场凝胶电泳仪(CHEF-DR Ⅲ system)，伯乐生命医学产品(上海)有限公司；生化培养箱(SPX-250B-Z)，上海博迅实业有限公司医疗设备厂。 1.2 实验方法

1.2.1 链霉菌FR-008孢子悬浮液制备: 链霉菌FR-008在SFM培养基于30培养4 d后，用无菌棉签轻轻地将孢子刮下悬浮在TES溶液中，振荡混匀，用孢子过滤器过滤，收集滤液，离心去上清并用无菌水将孢子悬浮。

1.2.2 NTG诱变链霉菌FR-008孢子悬浮液: 将孢子悬浮液分别加上1 ml不同浓度的NTG溶液(0、1.6、2.0 g/L)，在30 ℃恒温箱中反应12 h后，用无菌水洗涤孢子3遍以终止NTG的诱变作用。将诱变后的孢子悬浮液稀释成不同的浓度梯度涂布于SFM平板上，30 ℃恒温箱培养3 d后观察结果。计算致死率并将诱变后存活的诱变株保种于20%甘油的菌种管并置于−20 ℃。

1.2.3 砷抗性筛选丧失抗砷能力突变株: 链霉菌FR-008的大线性质粒pSSFR1含有砷抗性基因^[22]，所以本研究通过砷敏感筛选丧失抗砷能力的突变株。本研究直接将250 μmol/L亚砷酸钠溶液加到20 mL SFM培养基中，混合均匀，以不加砷盐的SFM培养基作对照，其背面画格一一对应标记并接种诱变株，30培养1−2 d后观察结果。

1.2.4 筛选线性质粒消除突变株: 突变株不抗砷并不能完全说明大线性质粒pSSFR1的消除，也可能是抗砷基因发生了突变导致功能丧失。PFGE可以直接观测质粒的消除情况，找到突变株砷敏感的原因。PFGE技术是基于不同长度的DNA长链大分子在电场中所经历的构型变化不同，通过变换电场方向的变化及间隔时间，从而达到分离大片段DNA的目的。操作过程如下^[24]：(1) Plug的制备：将收集到的菌体用细胞悬浮液清洗2遍，然后按下列比例混合：菌体悬浮液500 μL，l.5%低熔点琼脂糖500 μL。迅速混匀并加入制胶模孔中，置于4 ℃冰箱中使菌体和琼脂糖凝固形成Plug；(2) Plug的处理：将Plug转入溶菌酶溶液中(终浓度2 g/L)，37 ℃水浴8 h后，去除溶菌酶溶液，用TE缓冲液清洗至少3遍，再用终浓度为1%的SDS 50 ℃水浴2 h，用TE缓冲液清洗至少3遍，再用蛋白酶K缓冲液清洗一遍后加入蛋白酶K溶液(终浓度为1 g/L)，50 ℃水浴16 h；(3) Plug的电泳：将清洗后的Plug整齐置于电泳梳子上，固定制胶槽，缓慢倒入熔化后的琼脂糖凝胶(浓度为1%，用0.5×TBE配制)，待凝胶凝固后拔除梳子，将凝胶连同制胶板一同放入电泳槽进行脉冲场凝胶电泳。本研究数据设置如下：电压：6 V/cm；起始时间：1 s；最终时间：50 s；温度：14 ℃；电泳时间：20 h；电场夹角：120°。

1.2.5 链霉菌FR-008特异性引物设计: 为验证突变株来源于链霉菌FR-008，设计了3条特异性引物。引物合成由上海杰李生物技术有限公司完成。primer1_-F：5′-TCTTCTTCGTCACCGGGACGAT-3′；primer1_-R：5′-ATGTCGTTGAGGTCCCAGCCGT-3′；primer2_-F：5′-AAATCTAGAGAGCCCGCATTCAC GCACTTTCG-3′；primer2_-R：5′-AAAGGATCCTTCC AGTCCTCGCTGTCGGTGTTGTT-3′；primer3_-F：5′-AAAGAATTCTACCTCTGGTTCGTCCTCGCCTCCC-3′；primer3_-R：5′-AAAAAGCTTCCGATGCT GCCGTCGTCGTTGAT-3′。

1.2.6 线性质粒消除突变株生物活性测定: FR-008具有较好的抗真菌活性^[25]，本研究选择清酒酵母(Saccharomyces sake)作为生测的指示菌。首先在PDA平板上划线分离清酒酵母单克隆，接种至YEME (10.3%蔗糖)培养基中，30 ℃、220 r/min培养约24 h，离心收集菌体，用LB培养基洗涤一次，熔化PDA培养基并冷却至50 ℃左右，每20 mL培养基中加入20 μL新鲜指示菌，立即混匀后倒入培养皿，待其凝固。从FR-008野生型和突变株的菌坪上(30 ℃培养5−7 d)接种于SFM固体培养基平板上，用蓝枪头将培养物打成一圆形菌块。在含有指示菌平板的合适的位置上摆好待测的菌块，30 ℃培养1−2 d后观察抑菌圈的大小。

1.2.7 HPLC检测各线性质粒消除突变株的抗生素产量: 将各突变株及链霉菌FR-008野生型等量孢子接种到40 mL TSBY液体培养基的摇瓶(250 mL)中，30 ℃培养2 d制备种子发酵液。再将等量种子液接种到40 mL YEME (10.3%蔗糖)液体培养基的摇瓶(250 mL)中，30 ℃、220 r/min培养3−4 d得到发酵液。各突变株取等湿重的菌体，加入甲醇溶液重复萃取2次，收集萃取液，并用0.25 μm有机相滤膜过滤后，用于HPLC分析。HPLC使用的是安捷伦公司的Agilent 1100 series LC/MSD trap system。色谱柱为Agilent SB-C₁₈ (5 μm，4.6 mmx250 mm)反向柱，流动相为HPLC级乙腈：5.5 mmol/L NH₄AC (pH 4.5)=50׃50 (体积比)，流速为0.3 mL/min，检测波长为380 nm，柱温为25 ℃。 2 结果与分析 2.1 NTG诱变链霉菌FR-008孢子悬浮液

采用不同浓度的NTG处理(NTG溶液与孢子悬浮液共培养)，无菌水处理之后(终止NTG的诱变作用)十倍稀释法均匀平铺于SFM固体培养基，培养3 d得到以下结果(图 1)。

实验结果表明链霉菌FR-008孢子悬浮液对于NTG比较敏感，能够达到比较高的致死率而且随着NTG浓度的增加致死率上升。1.6 g/L和2 g/L的NTG诱变处理后，致死率分别为96.2%和99.8%。本研究采用2 g/L的浓度用于线性质粒的消除。

2.2 砷抗性筛选的结果

收集经2 g/L NTG处理后的103个诱变株。由于链霉菌FR-008的大线性质粒pSSFR1上具有抗砷的基因，因此将103个诱变株30 ℃培养在含有有砷(3价)的SFM固体培养基上3 d。观察是否能够生长。理论上在含有有砷(3价)的SFM固体培养基上不能生长的诱变株有可能其大线性质粒pSSFR1发生消除。实验结果如图 2所示。

将经2 g/L NTG处理后的103个诱变株依次接种含250 μmol/L亚砷酸钠溶液的SFM固体培养基上。从103个突变株中筛选到了10#、59#、115# 3个砷敏感的突变株，暗示其对应的pSSFR1大线性质粒(142 kb，砷抗性基因簇)可能被消除了。为消除实验偶然误差，对砷敏感的突变株进行了复证，图 2左边是SFM培养基上均可以生长，图 2右边是SFM培养基上添加250 μmol/L亚砷酸钠溶液，10#、59#、115#不能生长，其中以对砷有抗性的FR-008和S. lividans作为阳性对照。

2.3 PFGE检测的结果

为了检测这些砷敏感的突变株是否丢失了大线性质粒，以及小线性质粒丢失的情况，对这103个突变株进行了PFGE检测。结果见图 3。

PFGE检测结果显示：10#、59#和115#经NTG诱变后丢失了142 kb的大线性质粒pSSFR1，但是该3株突变株中24 kb的线性质粒pSSFR2仍然保留。42#突变株丢失了pSSFR2但是保留了pSSFR1。综合起来，在致死率为99.8%的情况下，NTG消除线性质粒的效率约为4%，因而是一种有效的线性质粒消除剂。为了证实两个线性质粒是否可能同时被消除，NTG继续处理42#突变株，获得了大小线性质粒均丢失的双突变株XYS1 (图 4A)。我们使用了3套链霉菌FR-008特异性的PCR引物(泳道1、2所用的引物扩增2 871 bp，泳道3、4所用的引物扩增2 654 bp，泳道5、6所用的引物扩增2 368 bp)，证明XYS1的确是衍生于42#的突变株(图 4B)。

2.4 生物活性定性比较突变株产杀念菌素的能力

链霉菌FR-008能够产生杀念菌素，该类化合物(杀念菌素具有多个组分，有效组分是Candicidin Ⅲ)具有抗真菌活性，通常利用酵母来检测其产抗生素的能力。本研究要比较各质粒消除突变株同野生型的差异，因此采用酿酒酵母作为生测菌来比较各个菌株的产素能力。

图 5结果表明各线性质粒消除突变株仍然能够合成抗真菌的杀念菌素，对指示菌清酒酵母具有一定的抑菌效果。其中，10#和115#突变株相比较野生型其抑菌圈较大，暗示产生杀念菌素的能力比野生型强。而42#和59#与野生型相比，其抑菌圈似乎要小些。

2.5 HPLC定量检测突变株杀念菌素的产量

测定了这些突变株及野生型液体发酵(TSBY培养基)产杀念菌素的产量，利用HPLC检测了这些突变株发酵产物中的杀念菌素有效组分Ⅲ的产量。结果以相对值(野生型为标准值1)显示如下(图 6)。

图 6数据表明和链霉菌FR-008野生型一样，各个被消除线性质粒的突变株依然能够产生杀念菌素，但对产量影响却不尽相同。总体结果与生测一致：两株消除了pSSFR1线性大质粒的10#和115#突变株相比较链霉菌FR-008野生型，杀念菌素有效组分Ⅲ的产量分别提高了40%和30%。然而42#和59#相比较链霉菌FR-008野生型，抗生素的产量反而下降了。

3 讨论

链霉菌FR-008隶属于白色链霉菌亚种，它可以产生多烯类抗真菌抗生素杀念菌素，加上FR-008菌株野生型生长迅速、产孢快、接合转移效率高，因而有潜力发展成为一个异源表达宿主。质粒消除作为一种有效的微生物遗传育种手段，已经有许多早期的应用报道^[26-27]，一般是加热和SDS多轮处理，但是一般应用于环形质粒的消除，比较繁琐。链霉菌中的线性质粒比较大，和环形质粒不同的是：它的拷贝数低，较为稳定而不易消除，大小通常都在20 kb−1.8 Mb之间。由于质粒上通常携带非必需基因，因而大线性质粒的消除在基因组简化方面具有较好的应用潜力。NTG作为诱变剂，主要引起碱基的转换，至今尚未有研究者用它来消除链霉菌的线性质粒。FR-008包含两个线性质粒pSSFR1和pSSFR2，前者包括了抗砷基因簇，这为利用NTG诱变消除质粒的检测提供了很好的条件，只需测试砷的敏感性，就能轻易筛到砷敏感的菌株(可能的大线性质粒消除突变株)。

本研究中当NTG致死率达到99.8%以上时，线性质粒消除率约为4%，远高于链霉菌自然突变的频率。对于线性质粒之所以能够被NTG消除，猜测可能是因为和它的质粒结构有关系，链霉菌线性质粒的末端通常有端粒结构^[28]，NTG处理可能影响了端粒的功能而使复制过程受阻，从而被消除。结合抗砷筛选和PFGE证实FR-008野生型两个线性质粒的存在，同时表明抗砷基因确实是位于大线性质粒pSSFR1上。这种研究模式可以推广，即为选择质粒上不同于染色体某个特性作为质粒消除与否的证据。可以人为将某个抗性基因克隆到质粒上作为一种标记，运用于质粒功能的研究。根据质粒消除的结果，不管是pSSFR1还是pSSFR2，两者均不含有宿主生长代谢所必需的基因。而Ye等^[29]发现不能将极端嗜盐古生菌质粒pHH205消除。同时Nindita等^[30]发现可以分别单独消除Streptomyces rochei中pSLA2-L (211 kb)和pSLA2-M (113 kb)，但同时消除两者会使线性染色体环化。说明不同种属的菌株质粒上携带基因组不同的信息。质粒与染色体既可以“共生”也可以“寄生”。这可能是由于进化过程不同而造成的差异。

根据生测和HPLC的结果，获得了2株相对链霉菌FR-008野生型更高产量抗生素的优势突变株。链霉菌FR-008大线性质粒除了砷抗性基因簇、质粒转移复制相关蛋白、CRISPR相关蛋白之外，编码了两个可能的调节蛋白，一个注释为LuxR家族的调节蛋白(基因编号：SFR_7012，218个氨基酸残基)，另外一个是可能的调节蛋白(377个氨基酸残基)。然而杀念菌素合成基因簇中4个LuxR家族调节蛋白^[31-32]FscRⅠ、FscRⅡ、FscRⅢ和FscRⅣ多属于正调节。同时59#菌株的有效组分Ⅲ的产量相对于野生型下降。因此推测：大线性质粒消除突变株中杀念菌素有效组分Ⅲ的提高可能和质粒上编码的基因没有关系，猜测是因为NTG作用质粒外其他部分引起的突变造成的。当然这些假设还需实验证实。对于被消除线性质粒的突变株，其基因组大小相应减少一部分，是否会增强某个部分的代谢通路，该突变株是否可以作为生产某一代谢通路产物的生产菌株，并在此突变株的基础上改造，使其更有利于某一代谢通路产物的积累。