微生物学通报  2017, Vol. 44 Issue (1): 133−140

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熊康丽, 浦天宁, 梁晶丹, 汪志军
XIONG Kang-Li, PU Tian-Ning, LIANG Jing-Dan, WANG Zhi-Jun
变铅青链霉菌广谱胁迫蛋白对氧化压力响应的研究
Response of universal stress protein from Streptomyces lividans 1326 to oxidative stress
微生物学通报, 2017, 44(1): 133-140
Microbiology China, 2017, 44(1): 133-140
DOI: 10.13344/j.microbiol.china.160255

文章历史

收稿日期: 2016-03-29
接受日期: 2016-06-03
优先数字出版日期(www.cnki.net): 2016-06-21
变铅青链霉菌广谱胁迫蛋白对氧化压力响应的研究
熊康丽, 浦天宁, 梁晶丹, 汪志军     
上海交通大学生命科学技术学院 微生物代谢国家重点实验室    上海    200030
摘要【目的】 广谱胁迫蛋白(USP)是一种古老的蛋白家族,在链霉菌属细菌中其功能研究尚未报道。以变铅青链霉菌USP蛋白为对象对其功能进行解析。 【方法】 使用序列比对的方法分析同源性及保守结构域。纯化USP蛋白,用圆二色谱分析蛋白与环腺苷酸(cAMP)的结合对usp (SLI_7517)进行基因中断。检测野生型和usp基因缺失株对偶氮二甲酰胺造成的氧化压力的耐受能力。使用qPCR荧光定量分析技术,检测野生型菌株与usp缺失株在氧化环境中谷胱甘肽过氧化物酶及巯基过氧化物酶基因转录量的差异。 【结果】 同源序列分析表明链霉菌属来源的USP蛋白序列相互之间相似性较高,USP-like结构域高度保守。USP蛋白在体外结合cAMP引起CD谱的变化。usp基因缺失株对偶氮二甲酰胺更耐受,同时菌株中谷胱甘肽过氧化物酶基因转录量上升。 【结论】 变铅青链霉菌中USP蛋白能够结合cAMP。usp参与菌体应对氧化环境的调控,对谷胱甘肽过氧化物酶基因的转录有阻遏作用。
关键词变铅青链霉菌     广谱胁迫蛋白     环腺苷酸     谷胱甘肽过氧化物酶    
Response of universal stress protein from Streptomyces lividans 1326 to oxidative stress
XIONG Kang-Li, PU Tian-Ning, LIANG Jing-Dan, WANG Zhi-Jun     
State Key Laboratory of Microbial Metabolism, School of Life Science and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200030, China
Received: March 29, 2016; Accepted: June 03, 2016; Published online(www.cnki.net): June 21, 2016
Foundation item: The Tang Berkeley Scholarship; National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2015CB554203, 2012CB721004); National Natural Science Foundation of China (No. 31470830, 31121064); Natural Science Foundation of Shanghai (No. 14ZR1421500); National Program of Development of Transgenic New Species of China; Shanghai Pujiang Program (No. 14PJD019); International Cooperation and Exchange Program of Shanghai Jiao Tong University
*Corresponding author: WANG Zhi-Jun, Tel: 86-21-62932943; E-mail: wangzhijun@sjtu.edu.cn.
Abstract: [Objective] Universal stress protein (USP) belongs to an ancient protein family. In Streptomyces, its physiological function has not been reported yet. This work focused on the protein particularly. [Methods] Sequence alignment was performed. The association between cAMP and USP was detected using circular dichroism spectroscopy. The usp gene (SLI_7517) was also disrupted. Susceptibility of wild-type and the usp disruption mutant strains to the thiol oxidant, diamide, was analyzed. qPCR was conducted to detect the expression differences of glutathione peroxidase and thiol peroxidase genes between the wild-type and usp disruption mutant strains. [Results] USP from different Streptomyces species shares 90% similarity, with the highly conserved USP-like domain. The alteration of USP CD spectra was observed when USP was mixed with cAMP. Tolerance to diamide increased after usp was knocked out. The transcription level of glutathione peroxidase gene was up-regulated in the usp disruption mutant. [Conclusion] USP protein from Streptomyces lividans 1326 can bind to cAMP. It might be involved in the regulation process, that suppresses the transcription of glutathione peroxidase when the bacteria exposed to oxidative environment.
Key words: Streptomyces lividans 1326     Universal stress protein     cAMP     Glutathione peroxidase    

广谱胁迫蛋白(universal stress proteins,USPs)是一类进化上比较保守和古老的蛋白家族,广泛存在于细菌、古菌及真核生物中[1-3]。对大肠杆菌(Eschrichia coli)中的6种同源USP蛋白功能研究发现,当细菌遭遇多种外界压力,如热休克、饥饿环境、氧化环境以及紫外暴露时[4],会触发USP的表达,进而通过多种分子机制调节菌体在这些环境下的生存能力。大肠杆菌的USP蛋白分别应对不同压力环境,同时也与细菌的运动性、离子清除以及附着性有关[5-6]。在结核分枝杆菌中,USP过表达后菌体表现出对于异烟肼(常用于治疗肺结核的药物)的敏感性[7-8],且多种调控蛋白表达量升高[8]。此外,USP对cAMP (环腺苷酸)这一信号分子表现出很高的亲和性。USP蛋白可以通过结合cAMP对其起到蓄积作用,进而调节细胞内cAMP浓度的平衡[3, 9]。因此,USP蛋白将信号传导与转录调控联系起来,其功能对于微生物的代谢可能起到至关重要的作用[10]

链霉菌中USP蛋白生理功能的研究鲜有报道。链霉菌作为一种主要的抗生素产生菌[11],是非常重要的微生物资源,其研究价值不言而喻。研究选取变铅青链霉菌1326 (Streptomyces lividans 1326)中一种USP蛋白(GenBank登录号:EOY52220.1)作为研究对象,进行了USP蛋白同源性分析,经圆二色谱分析检测,USP与cAMP相互作用。对该蛋白的usp基因(SLI_7517)进行中断,使用偶氮二甲酰胺(Diamide,硫醇氧化剂)处理菌株。比较usp缺失对细菌在氧化压力环境下存活率的影响,并定量分析清除氧化压力相关的谷胱甘肽过氧化物酶和硫醇过氧化物酶基因转录水平的差异。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒: 详见表 1
表 1 菌种和质粒 Table 1 Strains and plasmids used in this study
菌株或质粒
Strains or plasmids
特征
Characteristics
来源
Source
Streptomyces lividans 1326 Wild type Our lab
XKL1 usp deletion, aac (3)Ⅳ This work
Eschrichia coli DH10B F-, recA, lacZ, Δm15 Our lab
Eschrichia coli BL21 (DE3) F-, ompT, hsdS (rBB-mB-), gal, dcm (DE3) Our lab
Eschrichia coli ET12567 (pUZ8002) cml, kan, dam, dcm, hsds, Tra+, pUZ8002 [12]
pET-28a N-His, N-Thrombin, N-T7, C-His, kan Our lab
pJTU1278 oriT, repA, amp, lacZ [13]
pXKL derivated from pJTU1278, aac (3)Ⅳ This work

1.1.2 主要试剂和仪器: 限制性内切酶、反转录试剂盒、Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix荧光定量试剂盒购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司;卡那霉素(50 g/L)、氯霉素(25 g/L)、安普霉素(50 g/L)、氨苄青霉素(100 g/L)、萘啶酮酸(25 g/L)以及IPTG (1 mmol/L)购于福建省福抗药业股份有限公司;胶回收试剂盒购于美国Omega Bio-Tek公司;KOD酶购于纽英伦生物技术(北京)有限公司;rTaq酶购于宝生物工程(大连)有限公司;RNA提取试剂盒购于北京赛百盛基因技术有限公司;天冬酰胺、半胱氨酸、甲硫氨酸以及谷氨酸购于上海生工生物股份有限公司;cAMP及偶氮二甲酰胺购于西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司;Bradford蛋白浓度测定试剂盒购于北京天根生化科技有限公司。其余生化试剂和药品均为分析纯。3 kD超滤管,美国默克密理博(Merck millipore)公司;J-810型圆二色谱仪,日本分光株式会社(JASCO);7500实时定量PCR仪,美国应用生物系统公司;AH1500超高压细胞破碎机,ATS工业系统有限公司。

1.1.3 培养基: 用于细菌常规培养的LB培养基(g/L):胰蛋白胨10.0,酵母提取物5.0,NaCl 10.0,pH 7.2。用于链霉菌种子培养的TSBY培养基(g/L):胰胨豆汤粉30.0,蔗糖340.0,酵母抽提物5.0,pH 7.8[13]。用于链霉菌预萌发的培养基(g/100 mL):Difco水解酪蛋白氨基酸1.0,调pH至8.0。用于配制MMT培养基的MM培养基(g/L):L-天冬酰氨0.5,K2HPO4·3H2O 0.638,MgSO4·7H2O 0.2,FeSO4·7H2O 0.01,pH 7.2;配置好后,分装并加入琼脂2 g/200 mL。用于链霉菌存活率测定的MMT固体培养基:MM培养基1 L,补加葡萄糖(50%) 4 mL,酪氨酸(0.7%) 10 mL,水解酪蛋白氨基酸(30%) 4 mL,CuCl2·2H2O (10 g/L) 0.2 mL,L-甲硫氨酸(149 g/L) 1 mL。链霉菌预萌发培养基(g/100 mL):酵母抽提物1.0,Difco水解酪蛋白氨基酸1.0。大肠杆菌培养基1.1×105 Pa灭菌30 min。所有链霉菌培养基以及MMT培养基补加成分,0.95×105 Pa灭菌30 min后使用。

1.1.4 引物: 研究所用引物均由上海杰李生物技术有限公司合成,见表 2
表 2 PCR引物及其序列 Table 2 PCR primers and sequence
引物
Primers
碱基序列
Base sequence (5′→3′)
usp-Nde Ⅰ-F* GGGAATTCCATATGATGACGCGCCCGATCACGGC
usp-Xho Ⅰ-R* CCGCTCGAGTCACCTGTGCGGGACCACCG
usp-L-arm-BamH Ⅰ-F* CGCGGATCCGCACCCGGATGTTGG
usp-L-arm-Hind Ⅲ-R* CCCAAGCTTGCGGGTCCCTCCCTG
usp-R-arm-Hind Ⅲ-F AAAAAGCTTGCGGTGCTCCAGCAGC
usp-R-arm-Kpn Ⅰ-R CGGGGTACCACCACCTGCCCGACGCCGGGGT
16S rRNA-F AGTAACACGTGGGCAACTGC
16S rRNA-R CTCAGACCAGTGTGGCCGGT
qPCR-Thiol peroxidase-F ATGAGCGAGCGACTCCAGCC
qPCR-Thiol peroxidase-R CTGCTTCGTGCAGCCGGGGG
qPCR-Glutathione peroxidase-F TCAACCGGCGAGGCGTTCCT
qPCR-Glutathione peroxidase-R GACGCCGAGGGCCACAGCGG
注:标有下划线的碱基序列为限制酶切位点.
Note:Underline sequences are cleavage sites of restriction enzyme.
1.2 实验方法

1.2.1 变铅青链霉菌1326的培养: (1) 孢子培养:接种孢子液到SFM平板,在30 ℃倒置培养5 d至完全产孢后用棉签刮下孢子,保存至20%甘油冻存到−30 ℃。(2) 菌丝体液体培养:将适量孢子接种到TSBY培养基中,30 ℃、200 r/min振荡培养24 h至对数期得到菌丝体菌液。

1.2.2 变铅青链霉菌1326的USP蛋白异源表达及纯化: usp基因N端和C端设计引物usp-Nde Ⅰ-F和usp-Xho Ⅰ-R分别引入Nde Ⅰ及Xho I酶切位点,经PCR扩增得到带有酶切位点的目的基因。酶切回收后与同样酶切处理的载体pET-28a连接得到重组质粒,使得USP蛋白N端带有His标签[14]。测序验证(技术服务由上海杰李生物技术有限公司提供)正确后转化到大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白表达。以1:100体积比接种到LB培养基,37 ℃、200 r/min培养至对数生长期以1:1 000体积比加入20% IPTG诱导表达,16 ℃培养16 h。5 000 r/min离心10 min收集过表达菌株。以Ni buffer A (50 mmol/L咪唑、150 mmol/L NaCl、25 mmol/L Hepes和10%甘油,pH 8.0)重悬菌体。用细胞破碎机在800 Mpa压力下破碎5 min。15 000 r/min离心30 min收集上清液。上清加到经Ni buffer A平衡后的Ni柱中。用Ni buffer A冲洗未结合Ni柱的蛋白质,然后用Ni buffer B (500 mmol/L咪唑、150 mmol/L NaCl、 25 mmol/L Hepes和10%甘油,pH 8.0)洗脱目标蛋白[15]。将目标蛋白洗脱液再加载到Heparin柱上,用Heparin buffer A (150 mmol/L NaCl、25 mmol/L Hepes和1%甘油,pH 8.0)冲洗未特异性结合填料的蛋白以及Heparin buffer B (2 mol/L NaCl、 25 mmol/L Hepes和1%甘油,pH 8.0)洗脱目标蛋白。目标蛋白溶液在透析液(50 mmol/L Hepes和50 mmol/L NaCl,pH 8.0)透析3 h后用3 kD超滤管超滤浓缩至终浓度1 g/L,用蛋白浓度测定试剂盒进行浓度测定[15]

1.2.3 USP蛋白与cAMP结合的圆二色谱检测: 将200 μL的USP蛋白溶液(0.8 g/L)与200 μL的cAMP溶液(50 μmol/L)混匀,在4 ℃条件下反应5 h。取200 μL加入到石英检测皿中,放入圆二色光谱仪。扫描190−300 nm紫外波长,得到相应波长处对应的CD值,可信范围为±100 mdge[16-17]。将样品进行10倍梯度稀释直到出现稳定的CD信号图谱。

1.2.4 变铅青链霉菌1326中usp基因中断: 以变铅青链霉菌1326基因组DNA为模板,PCR扩增得到usp基因左右各1.5 kb长的同源臂[13]usp左边1.5 kb为左臂,引入酶切位点BamH Ⅰ及Hind Ⅲ,引物为usp-L-arm-BamH Ⅰ-F和usp-L-arm-Hind Ⅲ-R;usp右边1.5 kb为右臂,引入Hind Ⅲ及Kpn Ⅰ,引物为usp-R-arm-Hind Ⅲ-F和usp-R-arm-Kpn Ⅰ-R。PCR并酶切回收,与经BamH I及Kpn I酶切处理回收的pJTU1278连接,转化至大肠杆菌DH10B扩增质粒。将测序正确的质粒进行Hind Ⅲ酶切处理并回收后与经Hind Ⅲ酶切的安普霉素抗性片段aac (3)Ⅳ连接。再转化到大肠杆菌DH10B扩增带有同源臂以及抗性筛选标记的重组质粒pXKL1。将质粒pXKL1转化到大肠杆菌ET12567/pUZ8002中[18]。转化后的大肠杆菌ET12567/pUZ8002与变铅青链霉菌1326新鲜孢子混匀涂板。30 ℃培养12 h后加入萘啶酮酸及安普霉素覆盖。30 ℃培养3 d后挑取单克隆。以单克隆菌落为模板,在usp上下游200 bp处设计验证引物usp-delF和usp-delR,进行PCR筛选出发生双交换的单克隆,命名为XKL1。

1.2.5 偶氮二甲酰胺处理变铅青链霉菌1326及XKL1的存活率测定: 将变铅青链霉菌1326及XKL1新鲜孢子用TES缓冲液清洗,使孢子数量达到(1.0−4.0)×107 CFU/mL。将孢子吹吸混匀后,放入50 ℃水浴锅中热激10 min。取1 ml热激后的孢子溶液,加入1 ml链霉菌预萌发培养基,2 μL 5 mol/L CaCl2混合,放入37 ℃、200 r/min培养2.5 h。预萌发后洗涤3次,连续10倍稀释两次,第2次10倍稀释使得最后体积为900 μl,分别加入100 μL不同浓度的偶氮二甲酰胺(15、30、45 mmol/L)溶液[19-20],混匀后放入30 ℃、200 r/min培养1 h。将处理后的孢子溶液连续3次10倍稀释,涂布于MMT平板上。放置30 ℃培养3 d后菌落计数,以处理后的菌落总数除以空白对照组菌落总数,即为该处理浓度下菌体存活率。

1.2.6 偶氮二甲酰胺处理变铅青链霉菌1326及XKL1后qPCR检测过氧化物酶基因表达量: 将变铅青链霉菌1326及XKL1菌株培养至对数期,进行偶氮二甲酰胺处理,处理终浓度为1.5 mmol/L和3 mmol/L[19-20]。30 ℃、200 r/min培养1 h后4 ℃、15 000 r/min离心15 min收集菌体。用总RNA提取试剂盒提取RNA。以此RNA为模板,用反转录试剂盒反转录合成cDNA。反转录20 μL体系:RNA样品11 μL,随机引物(10 μmol/L) 1 μL,dNTPs (10 mmol/L) 2 μL,5×RT buffer 4 μL,Ribolock RI (RNA酶抑制剂) 1 μL,RevertAidH Mimus RT (RNA反转录酶) 1 μL。反转录反应条件:25 ℃ 5 min (随机引物与模板结合),42 ℃ 60 min (cDNA合成),72 ℃ 10 min (终止反应)。选择16s rRNA基因作为内参基因,设计PCR产物长150 bp的引物16S rRNA-F和16S rRNA-R。取谷胱甘肽过氧化物酶和巯基过氧化物酶基因150 bp序列,设计各自荧光定量引物qPCR-Glutathione peroxidase-F和qPCR-Glutathione peroxidase-R,以及qPCR-Thiol peroxidase-F和qPCR-Thiol peroxidase-R (表 2)。用SYBR Green/ROX荧光定量试剂盒,以cDNA为模板进行荧光定量PCR (ABI 7500型实时荧光定量PCR系统)。荧光定量PCR反应体系(25 μl):Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2×) 12.5 μl,正向引物(1.25 μmol/L)与反向引物(1.25 μmol/L)混合物1 μl,cDNA模板1 μl,去离子水10.5 μl。荧光定量PCR反应条件:50 ℃ 2 min;95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,40个循环[21-22]2 结果与分析 2.1 变铅青链霉菌USP蛋白序列分析及功能预测

在变铅青链霉菌1326中共有14个USP的同源蛋白质,相互之间相似性为40%−45%。选择其中一种USP同源蛋白(EOY52220.1)进行分析,该蛋白与其他链霉菌来源的USP蛋白相似性高达90%以上。因此认为该蛋白可能是链霉菌属中较为保守的USP蛋白。在变铅青链霉菌1326中,该usp基因开放阅读框大小为873 bp,编码291个氨基酸,预测蛋白质大小为30.0 kD。

NCBI Protein Blast分析表明,该USP蛋白含有cd00293结构域,为广谱胁迫蛋白家族保守结构域。在不同种属间进行序列分析比对,来源于变铅青链霉菌1326与来源于天蓝色链霉菌[Streptomyces coelicolor A3(2)]以及紫色链霉菌NRRL S-12 [Streptomyces violaceoruber NRRL S-12]的USP蛋白序列相似性高达90%以上。而在结核分枝杆菌[Mycobacterium tuberculosis H37Rv]中,二者的相似性仅为45%。以上4种来源的USP蛋白共同的USP-like结构域同源性较高,这一结构域有结合cAMP的结合位点,推测变铅青链霉菌1326的USP蛋白能够结合cAMP (图 1)。

图 1 USP蛋白同源蛋白序列比对分析 Figure 1 Amino acid sequence alignment analysis for USPs from different species 注:EOY52220.1来源于变铅青链霉菌1326;WP_030866806.1来源于紫色链霉菌NRRL S-12;NP_631354.1来源于天蓝色链霉菌A3(2);NP_216521.1来源于结核分枝杆菌H37Rv. Note: EOY52220.1 from S. lividans 1326; WP_030866806.1 from S. violaceoruber NRRL S-12; NP_631354.1 from S. coelicolor A3(2); NP_216521.1 from M. tuberculosis H37Rv.
2.2 cAMP与USP蛋白的相互作用研究

在大肠杆菌中异源表达纯化后的USP蛋白溶液,加入cAMP溶液反应后,用圆二色谱仪进行检测。在远紫外区,蛋白质肽键的圆二色性可以用来分析蛋白质的二级结构。在未加入cAMP以及只加入cAMP的对照组中,CD谱在205 nm处有一负值的CD谱带,而加入cAMP后该谱带由负偏振转向正值(图 2)。说明cAMP能够结合USP并导致USP蛋白质二级结构发生变化,从而引起了CD值的偏振改变。推测变铅青链霉菌1326的这一USP蛋白同样存在环腺苷酸结合位点,能够与cAMP在体外发生结合。

图 2 圆二色谱分析USP与cAMP的结合 Figure 2 Analysis of binding between USP and cAMP by circular dichroism spectroscopy
2.3 氧化压力对变铅青链霉菌1326野生型与XKL1菌株存活率的影响

将变铅青链霉菌1326 usp基因中断后,比较野生型菌株和usp缺失菌株XKL1不同偶氮二甲酰胺处理浓度(0、1.5、3.0、4.5 mmol/L)下细菌的存活率(图 3)。对于野生型来说,细菌在1.5 mmol/L的偶氮二甲酰胺处理时并未受到较大影响,存活率与对照组相比几乎不变。而当偶氮二甲酰胺浓度升高到3 mmol/L时,细菌存活率迅速下降至对照组的30%。而同样浓度下,XKL1存活率维持在70%。偶氮二甲酰胺浓度继续升高至4.5 mmol/L,野生型存活率维持在30%,XKL1降至50%。在氧化剂处理浓度逐渐升高的过程中,野生型存活率迅速降低而XKL1则更加耐受。说明野生型的菌株相较XKL1而言对于环境中偶氮二甲酰胺更加敏感。

图 3 WT和XKL1的偶氮二甲酰胺的敏感性测试 Figure 3 Sensibility test of WT and XKL1 strains to diamide
2.4 氧化压力对变铅青链霉菌1326和XKL1中谷胱甘肽过氧化物酶以及巯基过氧化物酶基因表达的影响

根据偶氮二甲酰胺氧化巯基的氧化作用机制,选取谷胱甘肽过氧化物酶及硫醇过氧化物酶,二者可以还被氧化的巯基。使用实时荧光定量PCR比较对数期的野生型和XKL1菌株细胞内上述两种过氧化物酶基因的转录量水平(图 4)。未进行氧化剂处理时硫醇过氧化物酶和谷胱甘肽过氧化物酶在野生型及XKL1中转录量差异在1.3倍以内(p=0.004 < 0.01,p=0.017 < 0.05)。在1.5 mmol/L偶氮二甲酰胺浓度下,上述两种酶转录量差异均在1.5倍以内(p=0.002 < 0.01,p=0.006 < 0.01)。当damide浓度升至3 mmol/L时,缺失菌株XKL1中谷胱甘肽过氧化物酶转录量增加至野生型的2.8倍(p=0.0009 < 0.001)。由于谷胱甘肽过氧化物酶对氧化剂有清除作用,其转录量的提升增强了菌株抵抗氧化环境的能力。

图 4 硫醇基过氧化物酶及谷胱甘肽过氧化物酶基因转录分析 Figure 4 RNA tanscriptions of thiol peroxidase and glutathione peroxidaseof WT and XKL1 strains 注:野生型及XKL1中硫醇基过氧化物酶及谷胱甘肽过氧化物酶的转录量在偶氮二甲酰胺未处理(A、B)、1.5 (C、D)以及3.0 (E、F) mmol/L处理后的变化. *:P<0. 05;**:P<0.01;***:P<0.001. Note:Variation of RNA tanscriptions of thiol peroxidase and glutathione peroxidase of WT and XKL1 strains treated by 0 (A, B), 1.5 (C, D) and 3.0 mmol/L (E, F) diamide. *: P < 0.05; **: P < 0.01; ***: P < 0.001.
3 讨论

蛋白序列分析结果表明,不同宿主的USP蛋白结构域保守。推测细菌中USP蛋白有相似功能。cAMP引起了变铅青链霉菌1326 USP蛋白圆二色谱的偏振改变,说明二者之间发生相互作用能够影响到USP蛋白的二级结构。推测USP蛋白存在与cAMP结合的保守氨基酸残基,cAMP作为信号分子对细菌生长和繁殖调节起到重要作用,因此USP蛋白与cAMP的体内相互作用可能对这一过程产生影响。关于变铅青链霉菌的USP蛋白与cAMP结合的生物学意义需要进一步研究。

偶氮二甲酰胺浓度升高时,野生型细菌对于氧化压力的抵抗不及XKL1,导致二者存活率产生差异。同时,XKL1相比野生型,谷胱甘肽过氧化物酶基因转录量升高。因此,usp对谷胱甘肽过氧化物酶基因的转录存在阻遏作用,这可能是XKL1相对野生型菌株更加耐受偶氮二甲酰胺的原因。这一结论不同于在结核分枝杆菌等细菌中发现的USP蛋白对氧化压力应答的正向调控。由于链霉菌与结核分枝杆菌生长环境不同,二者所面对的氧化压力不同,推测链霉菌中这种阻遏可能是细菌在应对氧化压力时防止细菌过度应激的一种缓冲。在usp基因缺失后,谷胱甘肽过氧化物酶基因调控不受限制,表达量可能超过清除氧化剂所需。过度表达对于细菌而言是一种浪费,在野生型细菌中,usp基因的阻遏作用可减少这种浪费。因此,虽然USP家族存在共同的保守序列,变铅青链霉菌中USP调控细菌应对氧化压力的机制与其他宿主细菌存在差异。

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