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文章信息
- 熊康丽, 浦天宁, 梁晶丹, 汪志军
- XIONG Kang-Li, PU Tian-Ning, LIANG Jing-Dan, WANG Zhi-Jun
- 变铅青链霉菌广谱胁迫蛋白对氧化压力响应的研究
- Response of universal stress protein from Streptomyces lividans 1326 to oxidative stress
- 微生物学通报, 2017, 44(1): 133-140
- Microbiology China, 2017, 44(1): 133-140
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.160255
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文章历史
- 收稿日期: 2016-03-29
- 接受日期: 2016-06-03
- 优先数字出版日期(www.cnki.net): 2016-06-21
广谱胁迫蛋白(universal stress proteins,USPs)是一类进化上比较保守和古老的蛋白家族,广泛存在于细菌、古菌及真核生物中[1-3]。对大肠杆菌(Eschrichia coli)中的6种同源USP蛋白功能研究发现,当细菌遭遇多种外界压力,如热休克、饥饿环境、氧化环境以及紫外暴露时[4],会触发USP的表达,进而通过多种分子机制调节菌体在这些环境下的生存能力。大肠杆菌的USP蛋白分别应对不同压力环境,同时也与细菌的运动性、离子清除以及附着性有关[5-6]。在结核分枝杆菌中,USP过表达后菌体表现出对于异烟肼(常用于治疗肺结核的药物)的敏感性[7-8],且多种调控蛋白表达量升高[8]。此外,USP对cAMP (环腺苷酸)这一信号分子表现出很高的亲和性。USP蛋白可以通过结合cAMP对其起到蓄积作用,进而调节细胞内cAMP浓度的平衡[3, 9]。因此,USP蛋白将信号传导与转录调控联系起来,其功能对于微生物的代谢可能起到至关重要的作用[10]。
链霉菌中USP蛋白生理功能的研究鲜有报道。链霉菌作为一种主要的抗生素产生菌[11],是非常重要的微生物资源,其研究价值不言而喻。研究选取变铅青链霉菌1326 (Streptomyces lividans 1326)中一种USP蛋白(GenBank登录号:EOY52220.1)作为研究对象,进行了USP蛋白同源性分析,经圆二色谱分析检测,USP与cAMP相互作用。对该蛋白的usp基因(SLI_7517)进行中断,使用偶氮二甲酰胺(Diamide,硫醇氧化剂)处理菌株。比较usp缺失对细菌在氧化压力环境下存活率的影响,并定量分析清除氧化压力相关的谷胱甘肽过氧化物酶和硫醇过氧化物酶基因转录水平的差异。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株与质粒: 详见表 1。菌株或质粒 Strains or plasmids |
特征 Characteristics |
来源 Source |
Streptomyces lividans 1326 | Wild type | Our lab |
XKL1 | usp deletion, aac (3)Ⅳ | This work |
Eschrichia coli DH10B | F-, recA, lacZ, Δm15 | Our lab |
Eschrichia coli BL21 (DE3) | F-, ompT, hsdS (rBB-mB-), gal, dcm (DE3) | Our lab |
Eschrichia coli ET12567 (pUZ8002) | cml, kan, dam, dcm, hsds, Tra+, pUZ8002 | [12] |
pET-28a | N-His, N-Thrombin, N-T7, C-His, kan | Our lab |
pJTU1278 | oriT, repA, amp, lacZ | [13] |
pXKL | derivated from pJTU1278, aac (3)Ⅳ | This work |
引物 Primers |
碱基序列 Base sequence (5′→3′) |
usp-Nde Ⅰ-F* | GGGAATTCCATATGATGACGCGCCCGATCACGGC |
usp-Xho Ⅰ-R* | CCGCTCGAGTCACCTGTGCGGGACCACCG |
usp-L-arm-BamH Ⅰ-F* | CGCGGATCCGCACCCGGATGTTGG |
usp-L-arm-Hind Ⅲ-R* | CCCAAGCTTGCGGGTCCCTCCCTG |
usp-R-arm-Hind Ⅲ-F | AAAAAGCTTGCGGTGCTCCAGCAGC |
usp-R-arm-Kpn Ⅰ-R | CGGGGTACCACCACCTGCCCGACGCCGGGGT |
16S rRNA-F | AGTAACACGTGGGCAACTGC |
16S rRNA-R | CTCAGACCAGTGTGGCCGGT |
qPCR-Thiol peroxidase-F | ATGAGCGAGCGACTCCAGCC |
qPCR-Thiol peroxidase-R | CTGCTTCGTGCAGCCGGGGG |
qPCR-Glutathione peroxidase-F | TCAACCGGCGAGGCGTTCCT |
qPCR-Glutathione peroxidase-R | GACGCCGAGGGCCACAGCGG |
注:标有下划线的碱基序列为限制酶切位点. Note:Underline sequences are cleavage sites of restriction enzyme. |
在变铅青链霉菌1326中共有14个USP的同源蛋白质,相互之间相似性为40%−45%。选择其中一种USP同源蛋白(EOY52220.1)进行分析,该蛋白与其他链霉菌来源的USP蛋白相似性高达90%以上。因此认为该蛋白可能是链霉菌属中较为保守的USP蛋白。在变铅青链霉菌1326中,该usp基因开放阅读框大小为873 bp,编码291个氨基酸,预测蛋白质大小为30.0 kD。
NCBI Protein Blast分析表明,该USP蛋白含有cd00293结构域,为广谱胁迫蛋白家族保守结构域。在不同种属间进行序列分析比对,来源于变铅青链霉菌1326与来源于天蓝色链霉菌[Streptomyces coelicolor A3(2)]以及紫色链霉菌NRRL S-12 [Streptomyces violaceoruber NRRL S-12]的USP蛋白序列相似性高达90%以上。而在结核分枝杆菌[Mycobacterium tuberculosis H37Rv]中,二者的相似性仅为45%。以上4种来源的USP蛋白共同的USP-like结构域同源性较高,这一结构域有结合cAMP的结合位点,推测变铅青链霉菌1326的USP蛋白能够结合cAMP (图 1)。
2.2 cAMP与USP蛋白的相互作用研究在大肠杆菌中异源表达纯化后的USP蛋白溶液,加入cAMP溶液反应后,用圆二色谱仪进行检测。在远紫外区,蛋白质肽键的圆二色性可以用来分析蛋白质的二级结构。在未加入cAMP以及只加入cAMP的对照组中,CD谱在205 nm处有一负值的CD谱带,而加入cAMP后该谱带由负偏振转向正值(图 2)。说明cAMP能够结合USP并导致USP蛋白质二级结构发生变化,从而引起了CD值的偏振改变。推测变铅青链霉菌1326的这一USP蛋白同样存在环腺苷酸结合位点,能够与cAMP在体外发生结合。
2.3 氧化压力对变铅青链霉菌1326野生型与XKL1菌株存活率的影响将变铅青链霉菌1326 usp基因中断后,比较野生型菌株和usp缺失菌株XKL1不同偶氮二甲酰胺处理浓度(0、1.5、3.0、4.5 mmol/L)下细菌的存活率(图 3)。对于野生型来说,细菌在1.5 mmol/L的偶氮二甲酰胺处理时并未受到较大影响,存活率与对照组相比几乎不变。而当偶氮二甲酰胺浓度升高到3 mmol/L时,细菌存活率迅速下降至对照组的30%。而同样浓度下,XKL1存活率维持在70%。偶氮二甲酰胺浓度继续升高至4.5 mmol/L,野生型存活率维持在30%,XKL1降至50%。在氧化剂处理浓度逐渐升高的过程中,野生型存活率迅速降低而XKL1则更加耐受。说明野生型的菌株相较XKL1而言对于环境中偶氮二甲酰胺更加敏感。
2.4 氧化压力对变铅青链霉菌1326和XKL1中谷胱甘肽过氧化物酶以及巯基过氧化物酶基因表达的影响根据偶氮二甲酰胺氧化巯基的氧化作用机制,选取谷胱甘肽过氧化物酶及硫醇过氧化物酶,二者可以还被氧化的巯基。使用实时荧光定量PCR比较对数期的野生型和XKL1菌株细胞内上述两种过氧化物酶基因的转录量水平(图 4)。未进行氧化剂处理时硫醇过氧化物酶和谷胱甘肽过氧化物酶在野生型及XKL1中转录量差异在1.3倍以内(p=0.004 < 0.01,p=0.017 < 0.05)。在1.5 mmol/L偶氮二甲酰胺浓度下,上述两种酶转录量差异均在1.5倍以内(p=0.002 < 0.01,p=0.006 < 0.01)。当damide浓度升至3 mmol/L时,缺失菌株XKL1中谷胱甘肽过氧化物酶转录量增加至野生型的2.8倍(p=0.0009 < 0.001)。由于谷胱甘肽过氧化物酶对氧化剂有清除作用,其转录量的提升增强了菌株抵抗氧化环境的能力。
3 讨论蛋白序列分析结果表明,不同宿主的USP蛋白结构域保守。推测细菌中USP蛋白有相似功能。cAMP引起了变铅青链霉菌1326 USP蛋白圆二色谱的偏振改变,说明二者之间发生相互作用能够影响到USP蛋白的二级结构。推测USP蛋白存在与cAMP结合的保守氨基酸残基,cAMP作为信号分子对细菌生长和繁殖调节起到重要作用,因此USP蛋白与cAMP的体内相互作用可能对这一过程产生影响。关于变铅青链霉菌的USP蛋白与cAMP结合的生物学意义需要进一步研究。
偶氮二甲酰胺浓度升高时,野生型细菌对于氧化压力的抵抗不及XKL1,导致二者存活率产生差异。同时,XKL1相比野生型,谷胱甘肽过氧化物酶基因转录量升高。因此,usp对谷胱甘肽过氧化物酶基因的转录存在阻遏作用,这可能是XKL1相对野生型菌株更加耐受偶氮二甲酰胺的原因。这一结论不同于在结核分枝杆菌等细菌中发现的USP蛋白对氧化压力应答的正向调控。由于链霉菌与结核分枝杆菌生长环境不同,二者所面对的氧化压力不同,推测链霉菌中这种阻遏可能是细菌在应对氧化压力时防止细菌过度应激的一种缓冲。在usp基因缺失后,谷胱甘肽过氧化物酶基因调控不受限制,表达量可能超过清除氧化剂所需。过度表达对于细菌而言是一种浪费,在野生型细菌中,usp基因的阻遏作用可减少这种浪费。因此,虽然USP家族存在共同的保守序列,变铅青链霉菌中USP调控细菌应对氧化压力的机制与其他宿主细菌存在差异。
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