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文章信息
- 张续, 班睿, 刘露, 张然
- ZHANG Xu, BAN Rui, LIU Lu, ZHANG Ran
- 枯草芽孢杆菌基因修饰生产核黄素
- Riboflavin production by a genetically modified Bacillus subtilis
- 微生物学通报, 2017, 44(1): 59-67
- Microbiology China, 2017, 44(1): 59-67
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.160271
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文章历史
- 收稿日期: 2016-03-31
- 接受日期: 2016-05-18
- 优先数字出版日期(www.cnki.net): 2016-06-21
2. 天津医学高等专科学校 天津 300222
2. Tianjin Medical College, Tianjin 300222, China
核黄素(Riboflavin)属于B族维生素,作为药物、动物饲料营养强化剂和食品添加剂,在医药、农业和食品等行业具有重要的应用价值。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)发酵生产核黄素早已实现了产业化[1-2],但相关的理论和技术研究持续至今。野生型枯草芽孢杆菌需要经过遗传修饰才能成为核黄素生产菌,即核黄素操纵子(ribDEAHT)组成型高表达[3],大幅度降低黄素激酶活性(ribC)[4],解除嘌呤合成途径的末端产物反馈调节机制[5]。
枯草芽孢杆菌中核黄素合成途径包括7步反应,由ribDEAHT操纵子编码的4个酶催化[6]。ribA基因编码GTP环水解酶Ⅱ/3, 4-二羟基-4-磷酸丁酮合成酶是核黄素合成途径的限速酶[3, 7]。单独过表达ribA基因,能够使核黄素产量提高25%。最近的动力学分析显示[8],ribH基因编码的6, 7-二甲基-8-(D-核糖醇基)二氧四氢蝶啶合成酶也可能是核黄素合成途径的限速酶,但尚无实验证据。
枯草芽孢杆菌核黄素合成的主要前体物是5-磷酸核酮糖,其胞内水平受磷酸戊糖途径代谢调控机制的控制。前体物的供给可能是核黄素合成速率的限制因素[9],或许也是导致实际核黄素合成收率远低于最大理论收率的原因[10]。在枯草芽孢杆菌中,木糖能够经过几步简单的异构和磷酸化反应生成5-磷酸核酮糖(图 1)[11-13]。木糖作为发酵碳源,可能有利于核黄素合成速率和收率的进一步提高。木糖来源于秸秆等农业废弃中半纤维素的酸水解,利用木糖作为微生物发酵原料,具有农业废弃物综合利用的重要意义。
本研究以产核黄素的枯草芽孢杆菌LXZ1为出发菌,通过对rib操纵子中各基因的单独表达、组合表达,研究枯草芽孢杆菌核黄素合成途径的限速因素;通过对木糖代谢相关基因的修饰以及木糖发酵实验,考察木糖与蔗糖共代谢对核黄素过量合成的影响。
1 材料与方法 1.1 菌株、质粒和引物菌株和质粒详见表 1,PCR引物(表 2)委托北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。
菌株Strains | 遗传标记及说明Genetic markers and instructions | 来源Source |
B. subtilisLXZ-1 | trpC2, ΔaraR::Para-neo, rib+(gsiB), ΔguaC, ΔpurA, ΔpurR, pur+(cryIIIA), ribC- | Laboratory |
B. subtilisTD-234m | trpC2, ΔaraR::Para-neo, Δhom::Pcdd-pyrH-DN-cat-araR, ΔxylR::PAE-prs-DN-cat-araR | Laboratory |
B. subtilis LXZ-2 | B. subtilis LXZ1, ΔsacB::Pcdd-ribA | This work |
B. subtilis LXZ-3 | B. subtilis LXZ1, ΔsacB::Pcdd-ribA-ribH | This work |
B. subtilis LXZ-31 | B. subtilis LXZ1, ΔsacB::Pcdd-ribE-ribA | This work |
B. subtilis LXZ-32 | B. subtilis LXZ1, ΔsacB::Pcdd-ribH | This work |
B. subtilis LXZ-4 | B. subtilis LXZ3, ΔyolA::Pcdd-araE | This work |
B. subtilis LXZ-5 | B. subtilis LXZ3, xyl+(PAE) | This work |
B. subtilis LXZ-6 | B. subtilis LXZ3, Δhom::PAE-rpe | This work |
B. subtilis LXZ-3/pMX45 | B. subtilis LXZ1, ΔsacB::Pcdd-ribA-ribH | This work |
pMX45 | rib操纵子表达质粒 | Laboratory |
Primers | Primer sequences (5′→3′) | Location |
Au1 | CTCCTCCAGCAAGATGATT | pbpE |
Au2 | CAAGAGCGTGATGTTTGTCGTGGTAGCCGTGATAGTT | sacB |
Ap1/Ap2 | GACAAACATCACGCTCTTG/GTGTAAATTCCTCCCTTACCT | pyrH |
ribA1 | AGGTAAGGGAGGAATTTACACATGTTTCATCCGATAGAAGAAG | ribA |
ribA2 | CAAGCCACATCAATGTCATT | ribH |
Ad1 | AATGACATTGATGTGGCTTGCTTGATCCTAACGATGTAACC | sacB |
Ad2 | GAAGAATCCGCTTGTGTAA | yveB |
Ac1 | TTACACAAGCGGATTCTTCTCTTCAACTAAAGCACCCAT | cat |
Ac2 | TTATTCATTCAGTTTTCGTG | araR |
Ag1 | CACGAAAACTGAATGAATAACAGCCACATTTACATCTGAC | sacB |
Ag2 | CGTAATGCCGTCAATCG | sacB |
AH2 | AGGTTACATCGTTAGGATCAAGAATGTCCAGTCTGCTATTAAC | ribT |
EA1 | AGGTAAGGGAGGAATTTACACATGTTTACAGGAATTATCGAAGA | ribE |
UPA2 | ATTCCTCCTTTTGTCCTTATTGATTAGAAATGAAGTAAATGACCTAG | ribA |
ribD1 | CAATAAGGACAAAAGGAGGAAT | ribD |
ribD2 | AGGTTACATCGTTAGGATCAAGTCGCCAAGATGAACATCC | ribA |
Aupa1 | TGTTCGTCTGTCTCTAATCTT | yraL |
araE1 | AGGTAAGGGAGGAATTTACACATGAAGAATACTCCAACTCAAT | araE |
araE2 | CCGTAGAAAGGGCTGTTT | araE |
Adcrg1 | AAACAGCCCTTTCTACGGGGACCTTGGCGATTTCAT | csn |
Adcrg2 | TTGTTCTCCTTGGCGATAG | csn |
Rupa1 | TACGGCATTCACATCAGG | yutH |
Rupa2 | GAATAGATGGAGCAACCTTTATCATTCTTTACCCTCTCCTTT | pyrH |
rpe1/rpe2 | ATAAAGGTTGCTCCATCTATTC/TGTGTTCATCCGTATAGCC | rpe/yloS |
Rdcrg1 | CGGCTATACGGATGAACACAACTGTACGCAGCACATATC | hom |
Rdcrg2 | ACTTCTTGAACGACTTCCA | hom |
Xu1/Xu2 | GCGGTAACGATGTTGAATC/GCTCAATCTCATTCCAGTTC | xylA |
Xp1 | GAACTGGAATGAGATTGAGCCATTCTTTACCCTCTCCTTT | prs |
Xp2 | ATGGAGTGGATGAAGTGGA | prs |
Xdcrg1 | TCCACTTCATCCACTCCATTGTCCTCCATTGTGATTGAT | xylR |
Xdcrg2 | CTATTCCTGTGCTGATACTTAC | xylR |
RT-ribA1/RT-ribA2 | TTGGCTCTCATCGCTGTG/TCATTGGCTTCTACGGTGTC | ribA |
RT-araE1/RT-araE2 | TCCTGTAACAAGAAGCCATT/CCACAACTCCTCCAATCATA | araE |
RT-rpe1/RT-rpe2 | AAGGTTGCTCCATCTATTCT/GGACCGCTTCTACAATCA | rpe |
RT-xylA1/RT-xylA2 | GCTCAATCTCATTCCAGTTC/TCCGCCGATTACTTCTTG | xylA |
RT-ccpA1/RT-ccpA2 | ACGAGCAGTGGCGGAAT/GATAGCGACTGACGGTGT | ccpA |
Taq酶,北京索莱宝科技有限公司;HifiDNA聚合酶,北京全式金生物技术有限公司;限制性内切酶、dNTPs和cDNA第一链合成试剂盒,Thermo scientific公司;细菌总RNA提取试剂盒,TIANGEN公司;RT-PCR试剂盒,Roche公司;核黄素标准品,Sigma公司;酵母粉YP101,安琪酵母股份有限公司;木糖等其余生化试剂为进口或国产分析纯试剂。
PCR仪,DNAEngine公司;Light Cycler 480荧光定量PCR仪,Roche公司;Thermo Scientific Q Exactive Focus Orbitrap高分辨率质谱仪,Thermo scientific公司;紫外分光光度计,Bio Quest公司;BIOTECH-2002型发酵罐,上海保兴生物设备工程有限公司。
1.3 培养基LB培养基(g/L):蛋白胨15.0,酵母粉10.0,NaCl 15.0,pH 7.5。固体培养基加入1.5%的琼脂A,需要时加入新霉素15 mg/L或氯霉素6 mg/L。
核黄素发酵种子培养基(g/L):蔗糖10.0,酵母粉20.0,MgSO4·7H2O 0.5,pH 7.2。
核黄素发酵培养基(g/L):蔗糖(或木糖,或混合糖) 80.0,酵母粉30.0,MgSO4·7H2O 0.5,尿素2.0,pH 7.2。
1.4 基因的整合过表达方法在枯草芽孢杆菌染色体指定位点,采用无标记基因修饰方法[14]整合表达目的基因。操作以ribA基因在染色体上非必需基因sacB位点整合表达为例进行说明。首先,以枯草芽孢杆菌TD-234m的染色体为模板,分别PCR扩增ribA基因编码序列(A,1 384 bp),cdd基因的串联启动子及前导区(Pcdd,232 bp)[15],sacB基因上游同源臂(U,1 078 bp)、下游同源臂(G,581 bp)、正向选择标记盒(CR,2 069 bp)和内部同源片段(D,958 bp)。PCR体系(50 μL):无菌水37.5 μL,10×Buffer 5 μL,dNTPs (2.5 mmol/L) 4 μL,染色体模板1 μL,引物(10 μmol/L)各1 μL,TransTaq HiFi DNA polymerase (5 U/μL) 0.5 μL。PCR条件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,退火温度30 s,72 ℃ 1 min/kb,30个循环;72 ℃ 10 min。最后采用重叠PCR方法[16]拼接出UPcddADCRG片段(6 302 bp)。将UPcddADCRG片段转化枯草芽孢杆菌LXZ-1感受态细胞,感受态细胞的制备及转化均采用Spizizen方法[17]。在氯霉素抗性平板上筛选抗性菌落,经PCR验证为正确转化子后,转接至装有5 mL LB培养基的试管中,37 ℃、220 r/min振荡培养4.5 h,通过枯草芽孢杆菌内部同源片段重组,使其失去抗性标记基因。上述培养液适当稀释后涂布新霉素抗性平板,筛选新霉素抗性菌落;抗性菌株经PCR扩增和DNA测序验证,得到Pcdd-ribA整合到染色体sacB基因位点的重组菌LXZ-2。
采用同样的方法,在枯草芽孢杆菌染色体sacB基因位点整合表达Pcdd-ribH基因,构建了菌株LXZ-32,分别共同表达Pcdd-ribA-ribH、Pcdd-ribE-ribA和Pcdd-ribA-ribD基因,构建了菌株LXZ-3、LXZ-31;在枯草芽孢杆菌染色体的csn位点整合表达Pcdd-araE基因,构建了菌株LXZ-4;在枯草芽孢杆菌染色体hom位点整合表达rpe基因,构建了菌株LXZ-6;在枯草芽孢杆菌LXZ-3染色体上的xyl操纵子原位,用来自枯草芽孢杆菌TD-234 m的PAE表达盒[18]替换了其原有的启动子和前导区序列,构建了xyl操纵子过表达菌株LXZ-5。
1.5 qRT-PCR分析使用罗氏公司Light Cycler 480荧光定量PCR仪,采用荧光定量PCR (qRT-PCR)方法,对目的基因的胞内mRNA相对水平进行测定,以此表征目的基因的相对表达水平。使用枯草芽孢杆菌的碳分解代谢全局调控蛋白CcpA的编码基因ccpA作为qRT-PCR的参比基因。同时对出发菌株和目的基因表达菌株的相同基因进行qRT-PCR测定,扩增片段的大小控制在100−300 bp之间。使用LB培养基进行摇瓶发酵,在发酵16、22和28 h分别取样测定。细胞总RNA的提取、cDNA第一链的扩增及qRT-PCR反应条件,均按照相应试剂盒所提供的方法进行。分别测定出发菌和重组菌的目的基因和参比基因的Ct值,根据2t−△△C方法计算重组菌相对于出发菌的目的基因mRNA的相对倍数[19]。取3个发酵时间点的相对倍数的平均值,表示目的基因的表达水平。
1.6 胞内代谢物的质谱检测方法取细胞的LB指数期培养液10 mL,迅速进行真空抽滤(−40至−50 kPa压强,0.45 μm孔径有机滤膜),并用2 mL 2.6% Nacl溶液冲洗30 s,然后用−20 ℃预冷的1.5 mL提取剂(甲醇:乙腈:水=40:40:20,体积比),将滤膜上的菌体洗下并混匀。菌悬液轮流置于液氮中和冰浴中反复冻融3次后,4 ℃、13 000 r/min离心5 min,上清移至离心管中,沉淀用0.5 mL提取剂重悬,4 ℃、13 000 r/min离心5 min,合并上清液为枯草芽孢杆菌胞内代谢物提取液,置−80 ℃冷冻保存[20]。采用Thermo Scientific Q Exactive Focus Orbitrap高分辨率质谱仪,对胞内代谢物提取液直接进样分析,得到总离子流图。依据待检测分子的质核比,在总离子流图中提取质谱图以定性分析出发菌和重组菌胞内代谢物提取液中的待测分子。
1.7 发酵方法摇瓶发酵:挑取新活化的平板单菌落接入30 mL/250 mL三角瓶种子培养基中,200 r/min、37 ℃振荡培养14 h。然后,按3%接种量转接30 mL/250 mL发酵培养基,37 ℃、220 r/min振荡培养60 h,分别在24、36、48和60 h取样0.5 mL,用于核黄素、生物量、木糖等的测定。
发酵罐发酵:用种子培养基进行种子液的摇瓶培养,培养条件与摇瓶发酵相同。然后,按5%接种量接种至发酵罐中,在37 ℃、500 r/min、通气量1.5 vvm、pH 6.5、罐压0.05 MPa的条件下发酵。
1.8 定量分析方法采用3, 5-二硝基水杨酸法(DNS法)[21]进行发酵液中木糖的定量分析。采用平板菌落计数法测定发酵液中的生物量。核黄素定量分析采用分光光度法进行,发酵液用0.05 mol/L的NaOH溶液稀释10倍后,12 000 r/min离心2 min;取上清液用乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH 5.0)稀释10倍,以乙酸-乙酸钠缓冲溶液为空白对照,测量444 nm下的吸光度值,用核黄素(g/L)=稀释倍数×(OD444−0.0057)/32.1计算核黄素浓度。
2 结果与分析 2.1 ribA和ribH基因单独表达对核黄素合成的影响以产核黄素枯草芽孢杆菌LXZ-1为受体菌,分别整合表达ribA和ribH基因构建的重组菌LXZ-2和LXZ-32,其qRT-PCR分析显示,LXZ-2菌株ribA基因mRNA胞内水平相对LXZ-1提高了34倍,LXZ-32菌株ribH基因相对提高了25倍,表明采用这种方式能够有效过表达靶基因。摇瓶发酵显示(图 2A),LXZ-2菌株发酵60 h的核黄素产量达到0.47 g/L,比LXZ-1菌株提高了99%;而LXZ-32的核黄素产量没有明显变化。结果表明,ribA基因的编码产物对于核黄素合成具有限速效应,而ribH基因编码产物则没有限速效应。摇瓶发酵的生物量测定结果显示(图 2B),LXZ-2菌株的最大生物量为9×108CFU/mL,明显低于LXZ-1和LXZ-32的1.3×109 CFU/mL。而且,在多次的重复发酵中,LXZ-2菌株发酵液会频繁出现颜色发暗的现象,根据LXZ-2生物量显著下降判断,其发酵液颜色发暗,是由于部分细胞自溶所造成。
2.2 ribA与ribH基因共表达的效应在枯草芽孢杆菌LXZ-1中分别整合共表达ribA-ribD、ribA-ribH和ribA-ribE基因,经过筛选和验证,分别得到了ribA-ribH共表达菌株LXZ-3及ribA-ribE共表达菌株LXZ-31。但是未能得到正确的ribA-ribD共表达菌株,所获得的都是ribD编码序列发生了严重突变的重组菌。这一现象说明,ribA-ribD共表达可能导致中间代谢物5-氨基-6-(D-核糖氨基)尿嘧啶的胞内水平过高,产生了致死效应。
摇瓶发酵结果显示,LXZ-3菌株的核黄素产量达到0.9 g/L,较LXZ-1提高了280%,较ribA基因单独过表达的LXZ-2菌株提高约91% (图 3A);而且最大生物量恢复到接近1.3×109 CFU/mL水平(图 3B),发酵液颜色也不再出现发暗现象。而ribA-ribE基因共表达的LXZ-31菌株,产量基本与ribA基因单独过表达相同。分别对LXZ-2和LXZ-3菌株的胞内代谢物进行了质谱分析,在负离子模式下的总离子流图中,LXZ-2菌株能够提取到与5-氨基-6-(D-核糖氨基)尿嘧啶质核比(m/z) 275.089相对应的质谱图(图 4),而LXZ-3菌株没有相应m/z的质谱图。结果表明,单独过表达ribA导致胞内5-氨基-6-(D-核糖氨基)尿嘧啶积累,并发生细胞自溶;共表达ribA-ribH基因可消除5-氨基-6-(D-核糖氨基)尿嘧啶积累和细胞自溶现象,从而进一步提高了核黄素产量。
2.3 木糖作为碳源对核黄素发酵的影响
将低拷贝rib操纵子表达质粒pMX45转化到菌株LXZ-3中,筛选出菌株LXZ-3/pMX45。分别以葡萄糖、蔗糖、木糖或不同比例的木糖和蔗糖的混合糖作为碳源,总糖加入量均为8% (质量体积比),进行60 h的摇瓶发酵。结果显示(图 5A、B),木糖作为碳源能显著提高核黄素产量。其中以1.5%蔗糖和6.5%木糖的混合糖发酵的核黄素产量最高,达到1.6 g/L。木糖作为唯一碳源,核黄素产量达到1.4 g/L,最大生物量接近1.2×109 CFU/mL,且略有生长延迟。当蔗糖加入量达到1.5%时,生物量在1.4×109 CFU/mL左右,接近蔗糖和葡萄糖作为碳源所达到的生物量水平。结果表明,蔗糖和木糖共代谢既能满足细胞生长需要,又有利于核黄素的产量提高。
2.4 木糖代谢相关基因修饰及其效应LXZ-3菌株是阻遏蛋白AraR缺陷株,其木糖吸收不受其它碳源存在的影响[22]。在蔗糖和木糖共代谢条件下,LXZ-3菌株其余木糖代谢相关基因对5-磷酸核酮糖及核黄素合成的影响尚未有研究报道。以菌株LXZ-3为受体菌,分别整合表达木糖运输蛋白基因araE和磷酸核糖表异构酶基因rpe,构建了重组菌株LXZ-4和LXZ-6,用PAE表达盒替换xyl操纵子原有启动子及前导区,构建了重组菌LXZ-5。qRT-PCR分析显示,在相应重组菌中,araE、rpe和xyl操纵子的平均表达水平分别提高了99、51和42倍。
使用1.5%蔗糖和6.5%木糖的混合碳源分别进行摇瓶发酵的结果显示,除了过表达araE基因导致木糖消耗速率及发酵液残糖量明显下降外(图 6B),araE、rpe基因和xyl操纵子的过表达均导致核黄素产量显著下降(图 6A)。因此,在AraR缺失背景下,再过表达araE、rpe基因和xyl操纵子均不利于核黄素合成。
2.5 木糖和蔗糖混合糖作为碳源的发酵罐发酵根据摇瓶实验结果,采用1.5%蔗糖和6.5%木糖混合糖作为碳源,在5 L发酵罐中进行LXZ-3/pMX45菌株的发酵,同时也进行8%蔗糖作为碳源的对比发酵。结果显示(图 7A),蔗糖发酵的过程平稳,核黄素产量高点出现在发酵60 h,产量为2 g/L。在木糖/蔗糖共代谢实验中,发酵45 h后,木糖消耗速率与核黄素合成速率同时出现加速现象;3.6 g/L的核黄素产量高点出现在发酵70 h,比蔗糖发酵提高了80%。在蔗糖/木糖共代谢发酵过程中,生物量的增长较蔗糖发酵延后约15 h,但最大生物量基本相同(图 7B)。结果表明,以木糖为主的木糖/蔗糖共代谢,对于提高核黄素发酵产量具有显著效应。
3 讨论在枯草芽孢杆菌中,ribA基因编码的GTP环水解酶Ⅱ/3, 4-二羟基-4-磷酸丁酮合成酶是核黄素合成途径的限速酶,这已有明确的研究结论[8]。但是,本研究观察到过表达ribA基因导致细胞自溶和生物量下降的现象。根据基因共表达效应以及胞内代谢物的质谱分析结果,可以证实中间代谢物5-氨基-6-(D-核糖氨基)尿嘧啶具有细胞毒性,ribA基因单独过表达容易引起5-氨基-6-(D-核糖氨基)尿嘧啶胞内积累,造成不同程度的细胞自溶。ribA-ribD基因共表达,会导致胞内的5-氨基-6-(D-核糖氨基)尿嘧啶水平进一步积累而产生致死效应。ribA-ribH基因过表达有助于将胞内的5-氨基-6-(D-核糖氨基)尿嘧啶及时转化为二氧四氢蝶啶,从而避免细胞毒性作用的发生。因此,当ribA基因过表达后,ribH基因编码的二氧四氢蝶啶合成酶成为了核黄素合成途径的下一个限速酶。
木糖作为唯一碳源或者木糖/蔗糖共代谢都能显著提高核黄素的产量,说明核黄素合成前体物5-磷酸核酮糖供给是影响核黄素产量及收率的关键因素。虽然木糖作为主要发酵碳源会导致菌株生长延迟和生物量降低,但是其吸收和转化为5-磷酸核酮糖的代谢较少受到代谢调控机制的限制,相对保障了核黄素合成前体物的供给。而蔗糖作为碳源,需要经过PP途径生成5-磷酸核酮糖,在一定程度上,PP途径的代谢调控机制限制了5-磷酸核酮糖的合成,进而限制了核黄素的合成。因此,采用木糖/蔗糖共代谢的方法,可能是解决核黄素发酵收率过低的有效手段。
枯草芽孢杆菌LXZ-3中,在调节蛋白AraR缺失的背景下,过表达araE、rpe基因和xyl操纵子均导致核黄素产量显著下降。这一现象可能暗示,无论是提高木糖吸收,还是提高5-磷酸木酮糖或5-磷酸核酮糖的胞内水平,或许都会诱导转酮酶(tkt)及转醛酶(ywjH)的活性提高,进而促进PP途径非氧化还原的碳架重排反应,将过多的磷酸戊糖转化为6-磷酸果糖或3-磷酸甘油醛,最终降低了5-磷酸核酮糖的胞内水平,从而导致核黄素产量降低。在5 L发酵罐中,木糖/蔗糖共代谢中出现的发酵45 h后核黄素产量及木糖消耗量开始增速现象,也可能与PP途径的碳架重排反应相关。曾有研究显示,缺失tkt基因能够提高核黄素产量[23]。在木糖/蔗糖共代谢条件下,转酮酶与5-磷酸核酮糖及核黄素合成的关系需要做进一步的研究。
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