合成染料广泛应用于纺织、塑料、印刷、化妆品、皮革、医药和快餐等行业，每年全世界合成染料约80-90万t，至少有10%-15%的合成染料通过废水排放到水体中，合成染料已成为世界最大的水体污染源之一^[1-2]。孔雀石绿(Malachite green，MG)是一种广泛应用于棉、木、丝、革等行业的三苯甲烷类染料，同时由于其具有抗寄生虫、真菌和细菌等功能，被广泛应用在水产养殖中^[3]。然而，MG对水生和陆生动物有广泛毒性，在环境中高残留会对动物的肝脏、鳃、肾、肠、性腺和垂体促性腺等细胞组织产生不利影响，其衍生物对人类具有潜在的致癌性。因此，包括美国、加拿大、欧洲联盟成员国等国家已经禁止在水产养殖中使用MG^[3-4]。目前用于MG废水处理的方法主要有物理、化学的方法，例如吸附法、超声法、化学催化法^[5-10]。但这些方法存在成本高、效率低、通用性差、干扰性强的缺点^[11]，因而发展有效的生物处理染料废水的方法具有重要意义^[11-12]。生物处理染料废水的方法主要是指微生物对染料废水的处理，该处理方法具有经济、环境友好等优点，包括白腐真菌脱色、细菌脱色等，它可以将染料分子进行降解或转化成无色、低毒甚至无毒的化合物，受到了学者们的极大关注^[13-16]。白腐真菌属于担子菌纲(Basidiomycetes)，腐生在树木或木材上，因引起木质白色腐烂而得此名，如黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、毛栓菌(Trametes trogii)、糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)和烟管菌(Bjerkandera adusta)等。白腐真菌因其能够产胞外、无底物特异性和立体选择性的还原酶和木质素降解酶系[包括NADH-DCIP还原酶、漆酶(Laccase，Lac)、锰过氧化物酶(Manganese peroxidase，MnP)和木质素过氧化物酶(Lignin peroxidase，LiP)等]，对多种污染物表现出广谱降解特性^[17-18]，受到越来越多的研究者关注。据我们所知，革孔菌(Coriolopsissp.)^[17]、污叉丝孔菌(Dichomitus squalens)^[19]、灵芝(Ganoderma lucidum)^[20]等虽然能够降解MG，但有降解效率低、耗时长、菌株耐受性差、需要添加诱导因子等缺点。本文报道一株具有降解MG能力的裂褶菌cfcc7252菌株，并希望通过研究该菌对MG的降解能力、降解条件以及降解产物的毒性，开发出一种经济、高效和环境友好型的生物降解菌种资源。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 供试菌株: 裂褶菌(Schizophyllum commune) cfcc7252菌株，购自中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所。

1.1.2 主要仪器和试剂: 恒温摇床，上海智城分析仪器制造公司；UV-2550分光光度计，SHIMADZU；GNO型隔水式恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；CAV电子天平，奥豪斯仪器(上海)有限公司制造；MG (C₂₃H₂₅C₁N₂，分子量364.92，λ_max=618)及其它试剂均为分析纯。MG母液(10 g/L)于4保存备用。

1.1.3 培养基: 固体培养基(g/L)：蛋白胨5.0，酵母浸粉2.5，葡萄糖20.0，琼脂粉20.0；液体培养基(g/L)：蛋白胨5.0，酵母浸粉2.5，葡萄糖20.0。 1.2 方法

1.2.1 菌株的培养: 裂褶菌cfcc7252菌株接种于固体培养基上，30培养5 d备用。

1.2.2 接种体的制备: 取200 mL液体培养基分装于500 mL锥形瓶中，接种10个直径1 cm的菌饼，于30、200 r/min振荡培养4 d，形成大小均一的菌球。以1.5% (体积比)接种于500 mL液体培养基中，30、150 r/min振荡培养，作为染料降解过程中的接种体。

1.2.3 降解MG条件优化: 将100 mL MG-液体培养基(MG终浓度为100 mg/L)装入250 mL培养瓶中，1×10⁵ Pa灭菌30 min，冷却后，以8% (体积比)的接种量加入接种体，30、150 r/min培养。所有试验均设置3个重复。以液体培养基为基础，采用单因子实验设计，依次优化裂褶菌cfcc7252菌株降解MG的条件。优化条件涉及：通气[厌氧条件：充高纯氮(99.99%) 30 min，以排尽瓶内空气，使培养体系处于厌氧状态^[21]；好氧条件：培养体系不充高纯氮]、初始ph (4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0)、温度(15、22、30、37和45)、不同碳源(蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、乳糖、D-果糖、麦芽糊精、半乳糖、麦芽糖、甘露糖)及其浓度、不同氮源(酵母浸粉、鱼粉、菜籽饼粉、黄豆饼粉、牛脑心浸粉、蛋白胨和1:1、2.5:1、5:1的蛋白胨和酵母浸粉)及其浓度。在最适pH、温度、碳源、氮源条件下，研究了金属离子(Zn²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Fe³⁺、Ba²⁺、Pb²⁺、Ni²⁺、Ca²⁺、Co²⁺、Cd²⁺、Hg²⁺和Ag⁺)及其浓度、盐度和MG浓度对裂褶菌cfcc7252菌株降解能力的影响。

1.2.4 连续降解能力测试: 优化后的培养基于1×10⁵ Pa灭菌30 min，待其冷却后，以8% (体积比)接入接种体至100 mL MG染料-液体培养基(MG终浓度为100 mg/L)的250 mL培养瓶中，30、150 r/min振荡培养48 h后测定降解率。同时取出菌体，转接于新的100 mL含MG (100 mg/L)的培养基中，继续降解48 h，重复10次，探究裂褶菌cfcc7252菌株连续降解MG的能力。

1.2.5 分析方法: 采用比色法，以加入MG的时刻为起点，每12 h取样1 mL，于10 000 r/min离心5 min，所得上清液于618 nm下测定其吸光度A₁，以不加接种物的MG染料-液体培养基的吸光度A₀为对照，其降解率用下列公式计算：

$ 降解率\left( \% \right) = \left( {{A_0}-{A_1}} \right)/{A_0} \times 100 $

1.2.6 生物毒性测试: 毒性测试以纯水为对照，探究100 mg/L的MG染料与经裂褶菌cfcc7252菌株降解36 h后的降解产物对植物和微生物的毒性，MG和降解产物均用0.22 μm微孔滤膜除菌。 植物毒性测试以红豆和豇豆为材料，种子使用前于30纯水中浸泡24 h，选取膨胀的种子用于测试。将3层滤纸铺在培养皿底部，1×10⁵ Pa灭菌30 min，待其冷却后，将10粒种子均匀置于培养皿的滤纸上面，每天喷洒3 mL相应溶液一次，以保持种子萌发所需要的湿度。种子置于30萌发，6 d后测定每个培养皿中种子的萌发率，胚根、胚轴和胚芽的长度以及湿重。每一个含有10粒种子的培养皿是一个重复，每个处理设5个重复。 微生物毒性测试以金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌和枯草芽孢杆菌为受试菌种，采用圆纸片法^[22]。所用细菌在37培养24 h后测定抑菌圈的直径，每个处理设置5个重复。

1.2.7 数据分析方法: 用GraphPad Prism 6.0软件，对实验数据进行单因素方差分析。 2 结果与分析 2.1 通气对MG降解的影响

通气对裂褶菌cfcc7252菌株降解MG的影响结果显示：无论在好氧还是厌氧条件下，裂褶菌cfcc7252菌株24 h均能够高效降解MG，降解率分别为96.82%和95.89%。Ren等^[23]研究嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila降解MG等三苯甲烷类染料时发现，在摇动和微需氧条件下其均能降解染料；然而降解体系经过厌氧处理(充氮气10 min)后，嗜水气单胞菌对MG基本没有降解效果，认为三苯甲烷类染料的降解可能要依赖于NADH/NADPH加氧酶，摇动和微需氧可以增加染料溶液的溶氧量，进而提高了加氧酶的酶活，从而促进了染料的降解。Chen等^[17]对革孔菌Coriolopsis sp.降解MG的研究结果显示：厌氧条件下的降解率(14 d: 78%)显著高于好氧条件(9 d: 52%)，其原因可能是在氧气存在的条件下，氧气和染料分子争夺电子载体，进而影响相关降解酶的活性^[24-26]。而本文研究却发现：好氧条件和厌氧条件的降解效果无明显差异，这可能是由于裂褶菌cfcc7252菌株对MG具有不同的降解机制。

2.2 pH对降解的影响

pH是微生物降解染料的重要环境影响因素之一，实验结果显示(图 1)：裂褶菌cfcc7252菌株降解MG有很宽的pH适应性，在pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0下，24 h的降解率均高于93%，在pH为4.0时，其降解率最大，为99.39%。后续实验的初始pH值设定为4.0。大多数白腐菌快速生长及染料分解的最适环境是酸性环境，但现实生活中的染料废水大多为碱性，这不利于一般真菌的脱色^[27]。然而，Chen等^[28]研究发现Pandoraea pulmonicolaYC32在略偏碱的溶液中对MG降解效果更好，何兴兵等^[29]报道烟管菌XX-2在中性培养基中对MG染料降解效果较好。而本实验所用的裂褶菌cfcc7252菌株在酸性及碱性条件下均可以高效降解MG，这些优良特性十分利于实际应用。

2.3 温度对降解的影响

降解体系在不同温度下培养24 h，探索温度对降解过程的影响，实验结果如图 2所示。结果表明：在15-30范围内，降解率随温度的升高而增大，在30时降解率最大，达到99.45%，这与吴茵等^[30]利用刺芹侧耳Pleurotus eryngii降解MG的最适温度一致。在30-45的范围内，降解率随温度的升高而降低，45时最低，为40.25%。关于温度对降解率的影响，Jasińska等^[3]、Kalpana等^[31]、韩国民等^[32]在利用真菌Myrothecium roridum、Irpex lacteus、Trichaptum abietinum 1302BG对相应染料进行降解实验时，也得出了与之相一致的结果。

2.4 不同种类碳源及浓度对降解的影响

碳源是微生物生长的重要营养元素之一，本研究在裂褶菌cfcc7252菌株对MG降解的体系中，分别使用终浓度为20 g/L的蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、乳糖、D-果糖、麦芽糊精、半乳糖、麦芽糖、甘露糖，探索不同碳源对降解过程的影响，实验结果如图 3A所示。不同碳源对裂褶菌cfcc7252菌株降解MG能力有显著影响(P < 0.05)。当以葡萄糖为碳源时，降解效果最好，24 h的降解率为96.16%，麦芽糊精和麦芽糖次之，降解率分别为80.57%和74.39%，蔗糖、可溶性淀粉、乳糖、果糖、半乳糖和甘露糖的影响较小。这一结果和已有的一些研究报道相一致，Raghukumar等^[33]研究结果显示：白腐真菌Flavodon flavus可以高效利用葡萄糖降解染料废水；林永慧等^[34]研究表明毛霉菌Mucoromycotina sp.在以葡萄糖为碳源的Kirk培养基中脱色效果最好；梁红昌等^[35]也报道泡盛曲霉Aspergillus awamori以葡萄糖为碳源的查氏培养基脱色效果最好。

为了进一步探究碳源浓度对降解过程的影响，在降解体系中分别加入终浓度为1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0和40.0 g/L的葡萄糖，实验结果如图 3B所示，其降解率的趋势与当前的一些研究结果相一致，例如 zsoy等^[36]发现真菌Fulani trogon ATCC 200800降解染料Drimarene Blue X3LR和Remazol Brilliant Blue R时，降解率随着葡萄糖浓度的增大而降低；林永慧等^[34]利用毛霉菌Mucoromycotina sp.降解苯胺蓝染料时发现葡萄糖浓度为1.0 g/L时降解率最高，9.0 g/L时降解率明显偏低。这可能是因为低浓度碳源被迅速耗尽后，微生物开始利用染料作为碳源和能源，从而有助于染料降解^[37]。在本文研究中，当葡萄糖浓度为1.0-10.0 g/L时，降解率随着浓度的增大而升高，10.0 g/L时降解率为98.90%；随后逐渐降低。基于降解效果，后续实验以10.0 g/L的葡萄糖作为碳源。

2.5 不同种类氮源及浓度对降解的影响

利用裂褶菌cfcc7252菌株对MG进行降解，分别加入终浓度为7.0 g/L的酵母浸粉、鱼粉、菜籽饼粉、黄豆饼粉、牛脑心浸粉、蛋白胨等单一氮源，以及1:1、2.5:1、5:1的蛋白胨和酵母浸粉的混合氮源，探究不同氮源的影响，实验结果如图 4A所示。7种不同的氮源均能促进裂褶菌cfcc7252菌株对MG的降解且均有较好的降解效果，当以酵母浸粉为氮源时，降解效果最好，其染料降解率为99.39%；其次为鱼粉及1:2.5的酵母粉与蛋白胨的混合物，降解率分别为97.38%、97.04%；以菜籽饼粉为氮源时的降解率最低，但降解率依然达到92.77%。Revankar等^[38]利用灵芝Ganodermasp. WR-1降解苋菜红时，发现以酵母浸粉为氮源时降解率最大。

为了进一步探究氮源浓度对降解过程的影响，在降解体系中分别加入终浓度为1.0、3.0、5.0、7.0、9.0和14.0 g/L的酵母浸粉。实验结果如图 4B所示，当酵母浸粉的浓度在0.0-5.0 g/L时，降解率随着浓度的增加而增大，5.0 g/L时，降解率最大，为97.94%；进一步提高酵母浸粉浓度，并不能显著提高该菌对MG的降解率。因此，后续实验采用5.0 g/L酵母浸粉作为氮源。

2.6 不同金属离子及浓度对降解的影响

金属离子在真菌降解染料的过程中具有重要的作用，同时大多数染料废水中含有各种各样的金属离子。因此，本文研究了终浓度为0.1 mmol/L的Zn²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Fe³⁺、Ba²⁺、Pb²⁺、Ni²⁺、Ca²⁺、Co²⁺、Cd²⁺、Hg²⁺和Ag⁺对MG降解的影响，实验结果如图 5A所示。金属离子对裂褶菌cfcc7252菌株降解MG能力具有显著影响(P < 0.05)。其中，在Zn²⁺存在的环境下，降解效果最好，24 h降解率为98.84%，其次分别是Mn²⁺、Hg²⁺，降解率分别为97.26%、97.11%；然而在Ca²⁺、Cd²⁺存在的条件下，该菌的降解率显著降低。金剑等^[39]、田启建等^[40]的研究表明：Zn²⁺能够促进染料降解，这可能是由于Zn²⁺能够提高木质素过氧化物酶的活性引起的。Du等^[41]研究表明Mn²⁺能够显著促进假单胞菌Pseudomonas sp. strain DY1降解MG。值得注意的是：裂褶菌cfcc7252菌株在重金属Hg²⁺和Ag⁺存在下，对MG的降解率仍高达97.11%、90.81%，这说明该菌株不仅在该环境条件下仍具有较强的MG降解活性，而且对这些重金属离子有较强的耐受性，这与其他有关染料降解的研究有所不同^[33]。

为了进一步探究Zn²⁺浓度对降解过程的影响，在降解体系中分别加入终浓度为0.01、0.10、0.30、0.50、0.70、1.00、1.20、1.50和2.00 mmol/L的Zn²⁺，实验结果如图 5B所示。Zn²⁺浓度对裂褶菌cfcc7252菌株降解能力具有显著影响(P < 0.05)。当浓度在0.01-0.50 mmol/L之间，降解率维持在99.25%-96.11%。随着Zn²⁺浓度的进一步增高，MG的降解率逐渐下降，2 mmol/L时降解率仅为22.00%。因此，后续实验采用0.01 mmol/L的Zn²⁺。

2.7 盐度对降解的影响

染料行业在生产过程中往往会产生大量的含盐废水，高的含盐量会影响微生物细胞的渗透压，从而使微生物降低或丧失脱色染料的能力^[42]。本文探究了盐度为4.08%的人工海水条件下，盐度对裂褶菌cfcc7252菌株降解MG能力的影响，实验结果如图 6所示。裂褶菌cfcc7252菌株降解MG有一临界盐度10.20%，低于该盐度时，降解率在99.30%-98.60%之间，高于该盐度，降解率显著降低；当盐度达到20.40%时，该菌仍有一定的降解能力，但降解率仅为21.47%。何兴兵等^[29]报道：在盐度(NaCl)低于16 g/L时，烟管菌XX-2对MG的降解率维持在88%左右；当盐度为128 g/L时，却仅为8.59%。与之相比，裂褶菌cfcc7252菌株则具有较高的盐度耐受力，在降解高盐度染料废水中相对有一定的优势。田启建等^[40]、田存萍等^[43]、郭建博等^[44]也报道了有关耐盐菌株在染料降解中的作用。

2.8 MG浓度对降解的影响

MG浓度对裂褶菌cfcc7252菌株的降解率有显著影响(P < 0.05，图 7)，浓度为50-200 mg/L时，降解率高达95%以上。虽然随着MG浓度的继续升高，该菌对MG的降解率有所下降，但在浓度为350 mg/L时，降解率仍高达62.5%。而现有研究发现：微生物在高浓度的MG废水环境中，其染料降解率会大大降低^{[17, 25, 45-46]}。因而，作为一种生物降解菌种资源，在处理高浓度工业废水染料中，裂褶菌cfcc7252菌株具有很强的开发潜力。

2.9 连续降解能力测试

菌株的连续降解能力是检验其应用能力的一个重要指标^[29]。在生物降解资源的开发中，很多菌株皆具有连续降解的能力。例如Daneshvar等^[47]利用藻类Chlorella sp.对MG进行连续脱色，显示在5个循环内脱色率不变；司静等^[48]研究绒毛栓孔菌连续脱色时发现在第2个循环时脱色率为36.48%，第3个循环却仅为9.74%；张昊等^[49]报道黄孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium在降解染料时在第3个循环脱色率为30%；Cui等^[50]以Escherichia coli为受试菌研究其对偶氮染料脱色显示4个循环后脱色率基本不变。而在本研究中发现：在第1-7个降解周期中，其降解率维持在98.07%左右；第8个降解周期降解率开始下降，为89.19%；到第10个降解周期时仍有一定降解能力，降解率达40.69% (图 8)。相对于其它真菌，裂褶菌cfcc7252菌株具有很强的连续降解能力，应用潜力巨大。

2.10 降解前后毒性测试

2.10.1 植物毒性测试: 植物毒性测试方法是常用的检测染料及其降解产物毒性的方法，通过检测种子发芽率、胚轴、胚根和胚芽等生长情况来反映染料的降解效果^[51]。该研究植物毒性测试结果如表 1所示。对红豆萌发率、胚根、胚芽、胚轴的长度及湿重进行LSD (Least significant difference)检验，结果表明：降解产物溶液、MG溶液和纯水对红豆和豇豆种子喷洒后，种子萌发率具有显著差异，降解产物处理、纯水处理2种种子的萌发率均为100%，但用MG溶液处理萌发率仅为70%，说明未降解的MG溶液对种子的萌发有一定的抑制作用，而降解产物毒性明显下降，对萌发率无明显影响。3种溶液喷洒种子萌发后的胚根、胚轴、胚芽的长度(cm)和湿重(g)也有明显的区别，与纯水处理相比，未降解的MG溶液明显抑制了红豆和豇豆的胚根、胚轴、胚芽的生长，湿重也有明显差异；而MG降解产物处理的种子各部分长度及湿重均明显高于MG溶液处理，且与纯水处理结果相近，表明裂褶菌cfcc7252菌株对MG具有一定的脱毒作用。这与许多有关染料降解的报道相一致^{[1, 51]}。

2.10.2 微生物毒性测试: 以金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞杆菌为受试微生物的抑菌试验结果显示：经MG溶液处理的滤纸片周围均有明显的透明圈，金黄色葡萄球菌透明圈直径为15.80 mm±0.49 mm，枯草芽孢杆菌为16.70mm±0.51mm，铜绿假单胞杆菌为11.60mm±0.43mm；而在纯水和经裂褶菌cfcc7252菌株降解产物处理的滤纸片周围均未发现抑菌圈，表明MG降解产物对供试微生物无抑制作用。Jasińska等^[3]和Lü等^[52]在研究丝状真菌Myrothecium roridum及Deinococcus radioduransR1降解MG时也得出类似的结论，降解产物对大肠杆菌、铜绿假单胞杆菌和金黄色葡萄球菌等微生物及L-929细胞的抑制作用很低。 3 结论

裂褶菌cfcc7252菌株降解MG的单因子优化条件为：碳源为10.0 g/L葡萄糖，氮源为5.0 g/L酵母浸粉，pH为4.0，培养温度为30，金属离子为0.01 mmol/L Zn²⁺。该菌株具有很强的适应能力，能在好氧与厌氧、酸性与碱性条件下高效降解MG。而且在Hg²⁺、Ag⁺、Ba²⁺、Pb²⁺、Cu²⁺等重金属离子存在以及高盐浓度下均有较高的降解效率。连续降解能力测试表明，该菌能够多次(至少8次)重复降解MG。另外，MG降解前后毒性测试结果表明，经该菌株降解后的MG降解产物对红豆、豇豆及金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞杆菌等植物、微生物生长基本没有毒性。表明裂褶菌cfcc7252是一株环境友好的、可用于MG处理的微生物菌种资源，在染料废水处理中具有极大的应用潜力。