作为人体和动物必需的8种氨基酸之一，L-苏氨酸被广泛应用于食品、饲料和医药等行业^[1]。苏氨酸的生产方法主要有化学合成法、蛋白质水解法和微生物发酵法，工业上大多采用微生物发酵法生产苏氨酸，一般通过传统的随机诱变或代谢工程手段，解除苏氨酸合成代谢中受到的各种反馈调控作用，选育高产菌株^[2-4]。微生物氨基酸合成途径的代谢调控复杂，很难全部解除，氨基酸的进一步合成受到残余调控作用的严重阻碍^[5]。转运系统工程通过及时分泌胞内氨基酸或者减少胞外氨基酸向胞内的运输，使胞内氨基酸浓度维持在较低水平，可以有效减弱合成途径受到的反馈调控，增加氨基酸的产量^[6]。近年来，关于多种氨基酸如色氨酸、赖氨酸和半胱氨酸的转运系统研究表明，转运系统工程是菌种改造的一种有效方法，能显著提高菌体产目的氨基酸的能力^[7-10]。

大肠杆菌(Escherichia coli)苏氨酸转运系统分为吸收系统和分泌系统，吸收载体将苏氨酸运进细胞，减少胞内的合成需要量；输出载体将高浓度的苏氨酸运出细胞，减少高浓度苏氨酸对细胞的危害^[11]。目前报道的大肠杆菌苏氨酸吸收系统有3种，分别是由tdcC基因编码的TdcC载体、sstT基因编码的SstT载体以及livJ和livHMGF基因编码的LIV-1系统^[12-13]。其中，SstT是大肠杆菌苏氨酸和丝氨酸的主要吸收蛋白^[14]。Kruse等^[15]敲除E. coli VL334PyN7的sstT基因，苏氨酸的吸收速率降低了50%。梁媛等^[16]敲除苏氨酸生产菌E. coliTRFC的sstT基因，摇瓶补料发酵36 h，苏氨酸的产量提高了4%。TdcC在厌氧条件下与苏氨酸的吸收相关^[17]，但Lee等^[18]通过转录组分析表明，在有氧条件下，苏氨酸生产菌E. coliTH07 (pBRThrABC)与对照菌E. coliW3110(pBR322)相比，tdcC基因的转录水平是上调的，敲除tdcC基因后苏氨酸的产量提高了15.6%。LIV-1系统是大肠杆菌支链氨基酸转运系统，吸收亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸进入细胞，对丙氨酸、苏氨酸和丝氨酸有较低的转运能力^[19]。LIV-1系统由周质结合蛋白和膜转运蛋白组成，livJ基因编码的周质结合蛋白结合和转运胞外的氨基酸到膜转运蛋白上，livHMGF基因编码的膜转运蛋白再将氨基酸转运到胞内^[20]。虽然LIV-1系统能吸收苏氨酸，但却没有相关的报道表明其是否能应用于苏氨酸生产菌的构建。

TdcC、SstT和LIV-1三种载体吸收苏氨酸的能力具有显著的差异，不同载体的缺失对菌体积累苏氨酸的能力会产生不同的影响。目前，3种载体的研究都是分开进行的，还没有关于比较这3种载体的报道。本研究从野生型菌株E. coli W3110出发，运用λ red重组技术构建tdcC、sstT和livJ基因单敲除和多敲除菌株，比较分析大肠杆菌TdcC、SstT和LIV-1吸收系统的缺失对胞外苏氨酸吸收能力和积累能力的影响，为苏氨酸生产菌的构建提供参考依据。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒: 本研究出发菌株为E. coli W3110。基因敲除所需的抗性打靶片段质粒pKD13、同源重组协助质粒pKD46和抗性基因消除质粒pCP20均购于美国耶鲁大学大肠杆菌菌株库(CGSC，E. coli Genetic Stock Center，New Haven，USA)^[21]。由本实验室构建和保藏的质粒pKKthrA^C1034TBC是以大肠杆菌表达质粒pKK223-3为载体，由tac强启动子控制苏氨酸操纵子编码框thrA^C1034TBC的表达，其中thrA^C1034T、thrB和thrC基因分别编码苏氨酸合成路径中的3个关键酶天冬氨酸激酶Ⅰ-高丝氨酸脱氢酶Ⅰ双功能酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶，thrA^C1034T编码的天冬氨酸激酶Ⅰ-高丝氨酸脱氢酶Ⅰ能抗苏氨酸反馈抑制，过量表达thrA^C1034TBC，能有效促进苏氨酸的合成。重组菌E. coliT01、E. coli T02、E. coli T03、E. coli T04、E. coli T05、E. coli T06和E. coli T07均为本研究构建，各菌株及质粒的具体特性见表 1。

1.1.2 工具酶及试剂: 实验用的Taq DNA聚合酶、pfu DNA聚合酶购于大连宝生物工程有限公司；pMD19-T vector购自TaKaRa公司；试剂卡那霉素、氯霉素、氨苄青霉素和L-阿拉伯糖购自Sigma公司；质粒DNA抽提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒和DNA纯化试剂盒购于北京博大泰克生物有限公司。蛋白胨、酵母粉、琼脂粉购于OXOID公司；其他试剂均为国产或进口分析纯。

1.1.3 培养基及培养条件: SOB液体培养基(g/L)：酵母粉5.0，蛋白胨20.0，NaCl 0.5，KCl 0.186，MgCl₂ 0.95，配制固体SOB培养基需加入1.5%的琼脂。 摇瓶发酵培养基(g/L)：酵母粉2.0，MgSO₄·7H₂O 2.0，KH₂PO₄4.0，(NH₄)₂SO₄14.0，甜菜碱1.0，葡萄糖30.0，CaCO₃ 10.0，0.5% (体积比)金属离子溶液，NaOH调节pH到7.2，装液量为60 mL/500 mL。金属离子溶液(g/L)：FeSO₄·7H₂O 10.0，CaCl₂ 1.35，ZnSO₄·7H₂O 2.25，MnSO₄·4H₂O 0.5，CuSO₄·5H₂O 1.0，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.106，Na₂B₄O₇·10H₂O 0.23，35% HCl 1% (体积比)。 苏氨酸分析培养基(g/L)：NaNH₄HPO₄·4H₂O 3.5，K₂HPO₄·3H₂O 12.9，(NH₄)₂SO₄ 1.0，MgSO₄·7H₂O 0.2，一水柠檬酸2.0，苏氨酸1.0，pH 7.2。装液量为50 mL/250 mL。 在菌种构建和发酵过程中，培养基中添加的卡那霉素、氯霉素和氨苄青霉素终浓度分别为36、25和100 mg/L。

1.1.4 引物: 根据GenBank中E. coli W3110的tdcC、sstT和livJ基因序列以及质粒pKD13中卡那霉素抗性基因序列信息，设计本实验所用引物。gene-FW和gene-RV用于扩增目的基因打靶片段。3对引物Ygen-FW和Ygene-RV，Ygene-FW和k1，Ygene-RV和k2用于鉴定目的基因的敲除，其中Ygen-FW和Ygene-RV分别是目的基因上下游的某段序列，k1和k2分别为kan基因内部序列。本实验所用引物的合成及有关测序由苏州金唯智生物科技有限公司完成，具体序列见表 2。 1.2 方法

1.2.1 大肠杆菌目的基因的敲除: 大肠杆菌基因敲除采用λ red同源重组技术^[21]：以质粒pKD13为模板，用引物gene-FW和gene-RV扩增含有FRT位点、同源臂和kan基因的目的基因打靶片段。将打靶片段电转入含有质粒pKD46的目的菌株，同源替换目的基因，用卡那霉素平板初步筛选阳性转化子，引物Ygene-FW、Ygene-RV和k1、k2 PCR验证挑选打靶片段与基因组成功整合的菌株。将辅助质粒pCP20电转入目的基因敲除菌株，消除kan基因，用氯霉素平板初步筛选阳性转化子，引物Ygene-FW和Ygene-RV PCR鉴定筛选kan基因成功消除的菌株，并将PCR产物TA克隆至pMD19-T载体，测序证明目的基因敲除正确。42 ℃培养kan基因消除菌株，丢失pCP20质粒，便于后续实验操作。

1.2.2 菌体生物量的测定: 发酵液的菌体浓度以分光光度计600 nm波长下的吸光值OD₆₀₀表示，细胞干重根据经验公式获得(1 OD₆₀₀=0.39 g/L DCW)。

1.2.3 葡萄糖及苏氨酸浓度的测定: 葡萄糖浓度采用生物传感仪SBA-40C测定。苏氨酸浓度采用高效液相色谱测定，取发酵液1 mL，12 000 r/min离心10 min，上清与等体积10% (质量体积比)三氯乙酸混合，4 ℃放置3 h以上，12 000 r/min离心20 min，上清用于高效液相色谱分析。高效液相色谱分离条件：Waters C₁₈ (250 mm×4.6 mm，5.0 μm)，OPA柱前衍生，流动相A和流动相B梯度洗脱，柱温40 ℃，流动相流速1 mL/min，紫外检测，波长338 nm。流动相A的配制：称取5 g无水乙酸钠，加入1 L超纯水和200μL三乙胺，乙酸调节pH至7.2，加入5 mL四氢呋喃，用0.45 μm有机滤膜抽滤，超声脱气。流动相B的配制：称取5 g无水乙酸钠，加入200 mL超纯水，乙酸调节pH至7.2，加入色谱纯甲醇和乙腈各400 mL，用0.45 μm有机滤膜抽滤，超声脱气。

1.2.4 大肠杆菌苏氨酸吸收能力分析: 向种子培养基中添加终浓度为0.5 g/L的苏氨酸，诱导菌体表达苏氨酸吸收载体，向苏氨酸分析培养基中添加终浓度为1 g/L的苏氨酸，代替葡萄糖作为碳源，检测菌体的生长和苏氨酸的消耗情况，用苏氨酸对菌体的比消耗速率来表征菌体吸收苏氨酸的能力^[22]。苏氨酸对菌体的比消耗速率定义为单位时间、单位菌体消耗的苏氨酸的量[nmol/(min·mg DCW)]。具体方法是：将菌种接入SOB液体培养基，31℃、250 r/min活化培养10 h，按OD₆₀₀为0.2的接种量转接至50 mL含有0.5 g/L苏氨酸的SOB培养基，31℃、250 r/min培养10 h，菌液冰浴30 min。4℃、4 000 r/min离心20 min收集菌体，0.9%生理盐水重悬菌体，重复该步骤3次。将菌体重悬到7−8 mL，按照OD₆₀₀为2.0的接种量接种至苏氨酸分析培养基，31 ℃、250 r/min培养，每2 h取样，测量培养液的生物量和剩余苏氨酸浓度，每组3个平行实验。

1.2.5 重组菌的摇瓶发酵: 将菌种接入SOB液体培养基，31 ℃、250 r/min活化培养10 h，按OD₆₀₀为0.2的接种量转接至50 mL SOB培养基，31 ℃、250 r/min培养12 h，按OD₆₀₀为0.5的接种量接种至发酵培养基，31 ℃、250 r/min发酵培养36 h，每隔一定时间取样，测量培养液的生物量、葡萄糖浓度和苏氨酸浓度。 2 结果与分析 2.1 突变菌株的构建

以E. coli W3110为出发菌株，按照1.2.1的方法敲除tdcC、sstT和livJ基因，分别如图 1A、B和C所示，构建tdcC、sstT和livJ基因单敲除菌株E. coli T01、E. coli T02、E. coli T03和多敲除菌株E. coli T04、E. coli T05、E. coli T06、E. coli T07。

2.2 阻断TdcC、SstT和LIV-1系统对菌株吸收苏氨酸的影响

按照1.2.4的方法对菌株W3110和重组菌T01、T02、T03、T04、T05、T06、T07进行苏氨酸吸收能力的检测。10 h内菌体的生物量和培养基苏氨酸浓度变化如图 2所示，苏氨酸对菌体的比消耗速率如图 3所示。

由图 2可知，菌体在苏氨酸分析培养基中生长缓慢，重组菌与对照菌生长情况大致相同，但苏氨酸的消耗速率差异显著。由图 3和表 3可知，tdcC、sstT、livJ基因单敲除菌株T01、T02和T03 10 h内苏氨酸平均比消耗速率分别为10.25、9.79和11.49 nmol/(min·mg DCW)，与对照菌W3110 [11.83 nmol/(min·mg DCW)]相比分别降低了13.36%、17.24%和2.87%。实验结果表明，tdcC、sstT、livJ基因的单敲除都能降低菌株吸收胞外苏氨酸的能力，敲除sstT基因的效果最为显著，tdcC次之，敲除livJ基因，苏氨酸吸收能力的降低幅度较小。多基因敲除菌株T04、T05、T06和T07 10 h内苏氨酸平均比消耗速率分别为6.71、7.59、9.34和5.84 nmol/(min·mg DCW)，分别比W3110降低了43.28%、35.84%、21%和50.63%。双敲除菌株中，敲除tdcC和sstT基因的T04菌株的苏氨酸比消耗速率最小。敲除tdcC、sstT和livJ基因的T07菌株的苏氨酸比消耗速率比单敲除和双敲除菌株都小，与菌株T04相比降低了12.97%。

2.3 单敲除tdcC、sstT和livJ基因对菌株生长和积累胞外苏氨酸的影响

为了检测单敲除tdcC、sstT、livJ基因对菌株生长和积累胞外苏氨酸的影响，将质粒pKKthrA^C1034TBC转入菌株W3110、T01、T02和T03中，构建重组菌W3110(pKKthrA^C1034TBC)、T01(pKKthrA^C1034TBC)、T02(pKKthrA^C1034TBC)和T03(pKKthrA^C1034TBC)，按照1.2.5的方法摇瓶发酵，菌株生长和积累胞外苏氨酸的情况如图 4和表 4所示。

由图 4A及表 4可知，tdcC、sstT和livJ基因的单敲除对菌体的生长影响较小，菌株W3110 (pKKthrA^C1034TBC)及其单敲除tdcC、sstT和livJ基因的菌株的最大比生长速率分别为0.68、0.65、0.59和0.61 h⁻¹，菌体的最终生物量接近，最大OD₆₀₀值分别为13.55、13.36、13.08和13.25。由图 4B和表 4可知，摇瓶发酵时，T01 (pKKthrA^C1034TBC)、T02(pKKthrA^C1034TBC)和T03 (pKKthrA^C1034TBC)最大胞外苏氨酸积累量分别为0.73、0.85和0.46 g/L，分别比对照菌W3110 (pKKthrA^C1034TBC，0.40 g/L)提高了82.5%、112.5%和15%，苏氨酸得率分别提高了75%、100%和10%。单敲除tdcC、sstT和livJ基因能提高菌株W3110(pKKthrA^C1034TBC)积累胞外苏氨酸的能力，敲除tdcC或sstT基因的效果较好，单敲除livJ基因只能少量增加胞外苏氨酸的积累量。

2.4 多敲除tdcC、sstT和livJ基因对菌株生长和积累胞外苏氨酸的影响

单敲除tdcC、sstT和livJ基因都能增加胞外苏氨酸积累量，为了减少菌株对胞外苏氨酸的吸收，增加胞外苏氨酸积累量，将质粒pKKthrA^C1034TBC分别转入多基因敲除菌T04、T05、T06和T07，构建重组菌T04(pKKthrA^C1034TBC)、T05(pKKthrA^C1034TBC)、T06(pKKthrA^C1034TBC)和T07(pKKthrA^C1034TBC)，按照1.2.5的方法摇瓶发酵，菌株生长和积累胞外苏氨酸的情况如图 5和表 4所示。

由图 5A及表 4可知，tdcC、sstT和livJ基因的多敲除对菌体的生长影响较小，菌株T04(pKKthrA^C1034TBC)、T05(pKKthrA^C1034TBC)、T06(pKKthrA^C1034TBC)和T07(pKKthrA^C1034TBC)的最大比生长速率分别为0.66、0.64、0.60和0.59 h⁻¹，最大OD₆₀₀值分别为13.26、12.99、13.20和12.78，与W3110(pKKthrA^C1034TBC)接近。由图 5B及表 4可知，tdcC、sstT和livJ基因的双敲除菌株中，T04(pKKthrA^C1034TBC)、T05(pKKthrA^C1034TBC)和T06(pKKthrA^C1034TBC)最大胞外苏氨酸积累量分别为1.09、0.69、0.83 g/L，与对照菌W3110 (pKthrA^C1034TBC)相比分别提高了172.5%、72.5%和107.5%，苏氨酸得率分别提高了145%、65%和95%，T04(pKKtrA^C1034TBC)积累胞外苏氨酸的能力最好。敲除tdcC、sstT和livJ基因的菌株T07(pKthrA^C1034TBC)最大胞外苏氨酸积累量为0.63 g/L，比W3110(pKKthA^C1034TBC)提高了57.5%，但与T04(pKKthrA^C1034TBC)相比却降低了42.2%，苏氨酸得率与T04(pKKthrA^C1034TBC)相比降低了32.7%。由T05(pKKthrA^C1034TBC)与T01(pKKthrA^C1034TBC)、T06(pKKthrA^C1034TBC)与T02(pKKthrA^C1034TBC)、T07(pKKthrA^C1034TBC)与T04(pKKthrA^C1034TBC)的胞外苏氨酸积累量比较可知，在多基因敲除菌株中，livJ基因的敲除会降低胞外苏氨酸积累量，这可能是由于LIV-1系统吸收的氨基酸种类较多，又是支链氨基酸的主要吸收系统之一^[20]，LIV-1系统缺失，菌株对多种氨基酸的吸收能力降低，代谢平衡发生变化，进而影响苏氨酸的合成，具体原因还需进一步探究。

3 讨论

转运系统工程作为一种重要的育种手段，对氨基酸生产菌的构建具有重要意义。Okamoto等^[23]通过多次随机诱变获得苏氨酸高产菌E. coliKY10935，研究表明其苏氨酸吸收系统受损，这可能是苏氨酸高产的原因之一。在苏氨酸发酵过程中，当菌体胞内苏氨酸积累到一定浓度时，会抑制其合成途径中关键酶的活力，减弱苏氨酸的合成能力。改造大肠杆菌苏氨酸吸收系统，降低菌株吸收胞外苏氨酸的能力，可以减弱菌株对胞外苏氨酸的重吸收，减少无效循环和能量浪费，降低胞内苏氨酸浓度，进而减弱合成途径受到的抑制作用，促进苏氨酸的合成^[16]。

本研究从野生型E. coli W3110出发，阻断已知的大肠杆菌苏氨酸吸收系统TdcC、SstT和LIV-1，并考察不同吸收载体缺失菌株吸收和积累胞外苏氨酸的能力。实验结果表明：双敲除tdcC和sstT基因的菌株T04(pKKthrA^C1034TBC)胞外苏氨酸积累量最高，达到1.09 g/L，分别比单敲除tdcC和sstT基因的菌株提高了49.3%和28.2%，比对照菌W3110(pKKthrA^C1034TBC)高出172.5%，同时阻断SstT和TdcC系统，能有效降低菌株吸收苏氨酸的能力，提高胞外苏氨酸积累量。敲除tdcC、sstT和livJ的菌株T07吸收苏氨酸的能力与菌株T04相比降低了12.97%，但T07(pKKthrA^C1034TBC)的胞外苏氨酸积累量与T04(pKKthrA^C1034TBC)相比却降低了42.2%，阻断LIV-1系统，虽然能降低菌株吸收苏氨酸的能力，却不利于菌株积累更多的胞外苏氨酸。

本实验构建的T07菌株同时阻断了已报道的大肠杆菌苏氨酸吸收系统TdcC、SstT和LIV-1，苏氨酸吸收速率只降低了50.63%，仍具有苏氨酸吸收能力，表明大肠杆菌还存在其它的苏氨酸吸收途径，这与Kruse等^[15]报道的大肠杆菌除了已知的苏氨酸吸收途径外，还有未知的苏氨酸吸收途径相一致。本实验出发菌株E. coli W3110为野生型菌株，其基因型没有经过改造，遗传背景清楚，这有利于准确反映苏氨酸吸收系统TdcC、SstT和LIV-1的缺失对菌株吸收和积累胞外苏氨酸的影响，为进一步改良苏氨酸高产菌提供参考依据。

大肠杆菌氨基酸分泌系统和吸收系统是氨基酸转运系统的有机组成部分，两者共同决定胞内氨基酸的浓度，影响目的氨基酸的最终产量^[16]。目前关于氨基酸转运系统的研究，分泌系统和吸收系统研究大都是分开的，将分泌系统和吸收系统在菌种改造中的应用研究有机结合起来，是转运系统工程研究的重要趋势。本文仅对苏氨酸吸收系统进行了改造，后期实验可针对苏氨酸分泌系统进行分析，将两者结合起来，考察转运系统的改造对胞外苏氨酸积累能力的影响。转运系统工程在苏氨酸以及其它氨基酸生产菌理性改造过程中发挥的作用日益明显。