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文章信息
- 李斌, 聂尧, 徐岩
- LI Bin, NIE Yao, XU Yan
- 高选择性不对称还原N, N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺的重组氧化还原酶催化性质及其酶促转化
- Characterization of highly stereoselective oxidoreductase for asymmetric reduction of N, N-dimethyl-3-keto-3-(2-thienyl)-1-propanamine
- 微生物学通报, 2017, 44(1): 1-8
- Microbiology China, 2017, 44(1): 1-8
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.160201
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文章历史
- 收稿日期: 2016-03-09
- 接受日期: 2016-04-29
- 优先数字出版日期(www.cnki.net): 2016-06-07
2. 江南大学食品生物技术国家重点实验室 江苏 无锡 214122
2. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China
氧化还原酶具有高度的化学选择性(Chemoselectivity)、区域选择性(Regionselectivity)和对应选择性(Enantioselectivity),催化氧化还原过程需要辅酶的参与,特别适合用来催化不对称反应,得到重要的手性化合物,用作工业应用中重要的手性砌块[1]。
度洛西汀,英文名(R)-Duloxetine,化学名(S)-N-甲基-3-(1-萘氧基)-3-(2-噻吩基)-1-丙胺,商品名欣百达,是一种5-羟色胺和去甲肾上腺素再摄取的双重抑制剂(SNRIs)[2]。临床上应用其盐酸盐治疗抑郁症、压力性尿失禁、抑郁症伴发慢性疼痛、糖尿病周围神经病性疼痛[3]。度洛西汀的两种化学组成相同的同分对映异构体中,只有(S)-型具有上述药理活性[4]。目前有很多不对称合成手性度洛西汀的方法[5]。通过逆合成分析可以发现,(S)-N, N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-1-丙胺(DHTP)是制备度洛西汀的一种重要手性中间体,N, N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺(DKTP)可以被不对称还原生成(S)-DHTP,因而通过(S)-专一性不对称还原DKTP已经成为高效制备度洛西汀的一种重要方法[2]。
生物法制备手性醇具有高效、专一、立体选择性好、反应条件温和等优点,已经成为制备手性醇的重要手段[6-9]。目前,已经筛选得到多株能够不对称还原DKTP制备度洛西汀中间体(S)-DHTP的微生物,例如Exiguobacterium sp.、Thermoanaerobacter sp.、Candida tropicalis、C.parapsilosis、C.viswanathii、Sporobolomyces salmonicolor AKU4429等[10-15]。其中C. tropicalis、C. viswanathii催化1 g/L DKTP不对称生成(S)-DHTP时,转化率为80%左右、对映体过量值 > 99%,但是反应时间长达60 h,效率低下,大大限制了其工业应用[12-13, 16]。目前国内度洛西汀手性中间体的研究较少,且水平较低[15, 17]。因此,有必要寻找高选择性的氧化还原酶,以实现DKTP不对称生成(S)-DHTP的高效生物反应制备。
本研究从研究室已有的多株立体选择性氧化还原酶重组大肠杆菌出发,通过Ni离子亲和层析法纯化得到重组氧化还原酶,以DKTP为底物,考察不同重组氧化还原酶对DKTP的催化活性和选择性,进一步对高选择性酶促合成(S)-DHTP的重组酶CR2进行性质分析,并考察其在最适条件下不对称还原DKTP的过程。
1 材料与方法 1.1 菌株E. coli BL21/pET21c-adhr、E. coli BL21/ pET21c-c1、E. coli BL21/pET21c-c2、E. coli BL21/pET21c-cr2、E. coli BL21/pET21c-cr4、E. coli BL21/pET21c-krd、E. coli BL21/pET21c-oye、E. coli BL21/pET21c-rcr、E. coli BL21/pET21c-s1、E. coli BL21/pET21c-scr、E. coli BL21/pET21c-scr1、E. coli BL21/pET21c-scr3由江南大学酿造微生物学及应用酶学研究室保藏。
1.2 主要试剂及仪器N, N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺(DKTP)、(S)-N, N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-1-丙胺(DHTP)、(R, S)-DHTP均购自百灵威科技有限公司;氨苄青霉素、IPTG、辅酶NAD (P) H、NAD (P)+均购自上海生工生物技术有限公司;正己烷(色谱纯)、异丙醇(色谱纯)购于Damas-beta公司;其他分析纯试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。
主要仪器:酶标仪购自Thermo公司;pH计购自Mettler Toledo公司;高效液相色谱仪Agilent 1200购自美国Agilent公司。
1.3 培养基LB培养基(g/L):酵母提取物5.0,蛋白胨10.0,NaCl 10.0,pH 7.0,固体培养基加入20.0 g/L琼脂。培养基的灭菌条件:1×105 Pa,灭菌30 min。
1.4 氧化还原酶的诱导表达及分离纯化挑取氧化还原酶重组菌单菌落接种到含80 mg/L氨苄青霉素的4 mL LB液体培养基中,37 ℃、200 r/min振荡培养过夜,并以2%的接种量转接到含80 mg/L氨苄青霉素的100 mL LB液体培养基中,37 ℃、200 r/min振荡培养至OD600为0.6−0.8时,向培养基中加入0.1 mmol/L IPTG,17℃、200 r/min诱导表达12 h。
将诱导表达后的发酵液离心,收集菌体并用生理盐水洗涤3次,重悬于20 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.0),高压匀浆破碎。4℃条件下12 000 r/min离心收集上清液并用0.22μm滤膜过滤,即为粗酶液。采用Ni离子亲和层析法对重组氧化还原酶进行分离纯化:在4℃条件下,先后用20 mL 20%乙醇、40 mL超纯水冲洗柱子,再用20 mL的Binding buffer (20 mmol/L Tris-HCl,0.3 mol/L NaCl,40 mmol/L咪唑,pH 7.0)平衡柱子,平衡完成后将粗酶液缓慢加入柱中,先后用10 ml Binding buffer、10 ml 60 mmol/L咪唑(20 mmol/L Tris-HCl,0.3 mol/L NaCl,60 mmol/L咪唑,pH 7.0)洗去亲和力较弱的杂蛋白,最后加入Elution buffer (20 mmol/L Tris-HCl,0.3 mol/L NaCl,300 mmol/L咪唑,pH 7.0)进行洗脱,得到目标蛋白液。目标蛋白液经过超滤浓缩后,参照PD-10 Desalting column脱盐柱进行目标蛋白溶液的脱盐,所得蛋白酶液经SDS-PAGE检验其纯度[18]。
1.5 重组氧化还原酶活性及酶学性质检测重组酶酶活测定体系:100 μL体系中含0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.5),0.5 mmol/L NAD (P) H,5 mmol/L底物,30℃恒温3 min,最后加入适量纯酶液混合均匀后,开始扫描340 nm处的吸光值变化。重组酶活性测定实验重复3次,取平均值。
1个酶活单位(U)是指每分钟催化氧化1 µmol辅酶NAD (P) H的酶量。
蛋白含量的测定:用Thermo Scientific Nanodrop 8000型检测器检测280 nm处的吸光值E,目标蛋白浓度根据摩尔消光系数换算得到,即蛋白浓度(g/L)=E/摩尔消光系数,重组酶的摩尔消光系数通过在线网站http://www.expasy.org/预测获得。比活计算公式:比活(U/mg)=酶活(U)/蛋白量(mg)。
测定重氧化还原酶的动力学参数时,测定体系为100 μL体系中含0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.5),辅酶NAD (P) H 0.5 mmol/L,底物(0.05−0.4 mmol/L)和适量的纯酶液。动力学性质研究实验重复3次取平均值,并利用Lineweaver-Burk作图法获得重组酶的动力学参数。
分别在不同pH梯度(6.0−9.0)和不同温度梯度(20−80 ℃)下测定重组氧化酶的酶活,以确定重组氧化酶的最适pH、最适温度。
将纯化得到的重组氧化还原酶分别置于不同温度(15−70℃)处理12 h,测定其温度稳定性。将重组氧化还原酶在4℃分别置于不同pH梯度(6.0−9.0)处理12 h,测定其酸碱耐受性。
在反应体系中添加终浓度1 mmol/L的金属离子螯合剂EDTA (Na)2,考察其对酶催化活性的影响。随后,在金属离子螯合剂EDTA (Na)2处理后的酶液体系中添加不同种类的金属离子(终浓度1 mmol/L CaCl2、CuSO4、FeSO4、FeCl3、MgSO4、MnCl2、NiSO4、ZnSO4),考察不同金属离子对酶催化活性的影响。
1.6 重组氧化还原酶对DKTP的不对称转化反应体系为2 ml Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中含有5 mmol/L DKTP、等摩尔的辅酶NAD (P) H和适量酶液于30 ℃、200 r/min反应8 h。反应结束后,加入2倍体积乙酸乙酯萃取,有机相用于高效液相色谱仪分析产物光学纯度及产率,本文中的生物转化实验均重复3次取平均值。
在最适反应pH、最适反应温度下,将纯化所得的氧化还原酶与1 g/L底物反应不同时间,测定其底物催化反应特性。
1.7 HPLC检测条件产物检测均在Agilent 1200型液相色谱仪上进行。
DKHP的检测条件:Chiralcel OD-H柱(250 mm×4.6 mm),紫外检测波长241 nm,流动相为正己烷:异丙醇(98:2,体积比),流速0.8 mL/min。出峰时间:(R)-DHTP 16.4 min、(S)-DHTP 18.3 min。
2 结果与分析 2.1 重组氧化还原酶的表达及纯化将12株重组氧化还原酶菌株E. coli BL21/pET21c-adhr、E. coli BL21/pET21c-c1、E. coli BL21/pET21c-c2、E. coli BL21/pET21c-cr2、E. coli BL21/pET21c-cr4、E. coli BL21/pET21c-krd、E. coli BL21/pET21c-oye、E. coli BL21/pET21c-rcr、E. coli BL21/pET21c-s1、E. coli BL21/pET21c-scr、E. coli BL21/pET21c-scr1、E. coli BL21/pET21c-scr3的种子液转接到含氨苄抗性的LB液体培养基中培养,并用IPTG进行诱导,将收集的菌体重悬于Tris-HCl缓冲液中,高压匀浆破碎、离心、过膜得到粗酶液。然后用Ni离子亲和层析法对各重组氧化还原酶进行分离纯化,经SDS-PAGE检验,各重组氧化还原酶条带和理论值一致,如图 1所示。纯化蛋白用于下一步的酶学特性分析。
2.2 重组氧化还原酶催化还原DKTP的活性和选择性分析分别测定12种重组氧化还原酶催化还原DKTP的活性及其相应产物DHTP的立体构型,结果如表 1所示。其中,CR2、KRD催化不对称还原DKTP的产物构象为(S)-型,CR4、OYE不对称还原DKTP的产物结构为(R)-型。在催化(S)-专一性不对称还原DKTP的氧化还原酶中,CR2的比活和选择性均明显高于KRD,且产物为光学纯的(S)-型单一对映体(图 2)。由于度洛西汀的两种对映异构体中只有(S)-型具有药理活性,因此CR2在不对称合成度洛西汀医药中间体的催化转化方面具有较为明显的应用潜力,并以CR2作为目标氧化还原酶进行催化性质的研究。
重组氧化还原酶Recombinant oxidoreductases | 基因数据库序列编号GenBank accession No. | 比活Specific activity (U/mg) | 产物构型Product configuration | 光学纯度Optical purity (% e.e.) |
ADHR | AY267012 | - | - | |
C1 | AB084515 | - | - | |
C2 | AB084516 | - | - | |
CR2 | AB183149 | 1.16 | S | 99.9 |
CR4 | E59061 | 0.58 | R | 99.9 |
KRD | AF178079 | 0.39 | S | 32.7 |
OYE | AB126227 | 1.25 | R | 99.9 |
RCR | DQ295067 | - | - | |
S1 | AB036927 | - | - | |
SCR | DQ675534 | - | - | |
SCR1 | FJ939565 | - | - | |
SCR3 | FJ939564 | - | - | |
注:e.e.:对映体过量. Note: e.e.: enantiomeric excess. |
2.3 重组氧化还原酶CR2不对称还原DKTP的催化性质 2.3.1 重组氧化还原酶CR2的动力学参数分析: 测定并计算不同底物浓度下重组酶CR2的酶促反应速率,并利用Lineweaver-Burk作图法获得重组酶的动力学参数,结果如图 3所示,所得Km=0.135 mmol/L,kcat=0.498 s−1,kcat/Km=3.689。已有文献报道表明,CR2对环类羰基化合物的亲和性较高,其Km值约为0.5 mmol/L,而对脂肪链类羰基化合物的亲和性较低,其Km值约为6.0 mmol/L[19]。DKTP作为酶促还原底物,是一种杂环类羰基化合物,其Km值低于0.5 mmol/L,表明CR2对DKTP亲和性较强,有利于其催化DKTP的还原反应。 2.3.2 重组氧化还原酶CR2的最适pH值和最适反应温度: 在不同pH梯度(6.0−9.0)下测定重组氧化还原酶CR2的相对酶活(图 4),所用缓冲液为0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS) (pH 6.0−8.0)、0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.0−8.5)和0.1 mol/L三乙醇胺缓冲液(TEA) (pH 7.5−9.0)。研究结果表明,pH值在小于7.0的范围内对CR2的酶活影响较大;在pH 7.5−9.0之间,CR2的相对酶活在50%以上;在pH 8.4 (0.1 mol/L TEA)时,CR2催化DKTP的活性最高。研究结果与已有报道相符,即CR2在中性偏碱性条件下,对环类羰基化合物的催化性能较好,而对脂肪链类羰基化合物的催化性能较差[19-20]。 在不同温度梯度(20−80 ℃)下测定重组氧化还原酶CR2的相对酶活(图 5)。研究发现,在25−40 ℃范围内,CR2的相对活性较高,保持在80%以上;在20−35 ℃范围内,随着温度的升高,CR2的活性不断上升,并在35℃时活性达到最大值;当温度大于40℃时CR2的活性开始下降,当温度高于55℃时完全失活。研究结果与CR2催化4-氯乙酰乙酸乙酯的最适温度基本一致[20]。目前已知可催化合成度洛西汀中间体的氧化还原酶,如来源于Exiguobacterium sp.和C.tropicalis的氧化还原酶,其最适温度均为30℃。与之相比,CR2具有更高的最适反应温度,更有利于反应的进行[11-12]。 2.3.3 重组氧化还原酶CR2的热稳定性、酸碱耐受性: 将重组氧化还原酶CR2的纯酶分别置于不同温度(15−70℃)处理12 h,测定其温度稳定性(图 6)。在温度低于45 ℃时,处理12 h的CR2还可以保持80%以上的活性;当温度继续升高时,酶的活性下降,甚至完全失活,这与原始野生菌株C.macedoniensis来源的CR2的热稳定性基本一致[19],同时与CR2催化4-氯乙酰乙酸乙酯的热稳定性基本一致[20],即在10−45 ℃较为稳定。 将重组氧化还原酶CR2于4 ℃分别置于不同pH梯度(6.0−9.0)处理12 h,测定其酸碱耐受性(图 7)。在pH 6.0−9.0范围内,处理12 h的CR2均保持75%以上的活性,并且在pH 7.5−8.5范围内,CR2的活性可以保持在90%以上,这与原始野生菌株C.macedoniensis来源的CR2的酸碱耐受性基本一致[19],即在中性偏碱性条件下较为稳定。 2.3.4 金属离子对重组氧化还原酶CR2活性的影响: 已有报道某些分类的氧化还原酶需要金属离子激活,因此考察了金属离子对CR2活性的影响。如表 2所示,首先考察金属离子螯合剂EDTA (Na)2对重组CR2活性的影响,在反应体系中添加终浓度为1 mmol/L的金属离子螯合剂EDTA (Na)2,其对CR2的活性有抑制作用,即CR2需要某种金属离子激活;进一步在反应体系中分别添加终浓度为1 mmol/L的不同金属离子(CaCl2、CuSO4、FeSO4、FeCl3、MgSO4、MnCl2、NiSO4和ZnSO4),考察了其对重组CR2活性的影响。其中,Zn2+对CR2酶活具有激活作用,可使CR2活性得到恢复,而其他金属离子对CR2的活性具有一定影响。研究结果说明,CR2是金属离子依赖型的立体选择性氧化还原酶,Zn2+对CR2活性具有促进作用。
化合物Compound | CR2相对酶活Relative activity of CR2 (%) |
No addition | 100 |
EDTA (Na)2 | 80 |
CaCl2 | 23 |
CuSO4 | 65 |
FeSO4 | 84 |
FeCl3 | 35 |
MgSO4 | 36 |
MnCl2 | 70 |
NiSO4 | 63 |
ZnSO4 | 108 |
在0.1 mol/L TEA缓冲液(pH 8.4)和35 ℃条件下,将纯化所得CR2催化1 g/L DKTP反应不同时间,HPLC检测反应产物(S)-DHTP的产率和光学纯度,结果如图 8所示。在CR2催化DKTP不对称还原的反应过程中,仅能检测到(S)-DHTP单一对映体产物,产物在反应0−4 h内快速生成和积累,反应4 h产物产率即可达到80%,在反应4−6 h内产率增长速率逐渐减缓,并于反应6 h时产率达到最大值92.1%,后续时间内产率保持稳定。已有文献[12-13, 16]报道,来源于C. viswanathii、C.tropicalis的氧化还原酶催化不对称还原1 g/L DKTP所需的反应时间长达60 h,并且产率只有80%左右。因此,重组氧化还原酶CR2具有进一步高效催化不对称还原DKTP生成度洛西汀中间体(S)-DHTP的应用潜力。
3 结论(S)-DHTP是生产度洛西汀的重要中间体,可由DKTP不对称还原获得。本研究从具有不同催化特性的多种立体选择性氧化还原酶出发,以DKTP为底物,获得高立体选择性不对称还原DKTP生成度洛西汀中间体(S)-DHTP的立体选择性氧化还原酶CR2。该酶对于DKTP底物具有较强的亲和性,最适pH为pH 8.4 (0.1 mol/L TEA),最适反应温度为35℃,在10−45℃和pH 7.5−8.5条件下较为稳定,Zn2+对该酶的催化活性具有促进作用。在最适条件下,重组氧化还原酶CR2催化不对称还原DKTP获得产物(S)-DHTP的产率达92.1%,光学纯度达99.9%。相比于其他已报道的可作用于DKTP生物合成(S)-DHTP的菌种和氧化还原酶,如Exiguobacterium sp.、Thermoanaerobacter sp.、C. tropicalis、C. viswanathii等菌株及其功能酶[10-13, 16],CR2具有适于转化反应的酶学性质,并能够高立体选择性催化不对称还原DKTP生成度洛西汀中间体(S)-DHTP,具有一定的应用潜力。
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