2016, Vol. 43扩展功能
文章信息
- 蒋卉, 彭小薇, 张阁, 冯宇, 张振, 孙翠丽, 朱良全, 丁家波
- JIANG Hui, PENG Xiao-Wei, ZHANG Ge, FENG Yu, ZHANG Zhen, SUN Cui-Li, ZHU Liang-Quan, DING Jia-Bo
- 绵羊红细胞敏感性对补体结合试验的最佳反应时间
- The optimum reaction time of sheep red blood cell sensitivity on complement fixation test
- 微生物学通报, 2016, 43(9): 2101-2104
- Microbiology China, 2016, 43(9): 2101-2104
- DOI: 10.13344/j.microbiol.china.151039
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文章历史
- 收稿日期: 2015-12-16
- 接受日期: 2016-05-04
2. 山东农业大学动物科技学院 山东泰安 271018
2. College of Animal Science and Veterinary Medicine,Shandong Agriculture University,Tai’an,Shandong 271018,China
补体结合试验(CFT)是一种经典的抗原、抗体检测方法，其敏感性、特异性均较高，不仅可用于诊断各种传染病，也可用于鉴定病原体，是免疫学上一个应用较广泛的重要试验[1]。在布鲁氏菌病(布病)的血清学诊断方法中，CFT被世界动物卫生组织(OIE)认可为布病血清学确诊的经典标准方法[2]。
在CFT实际操作中经常发现，使用不同保存时间的绵羊红细胞(SRBC)滴定同一批次溶血素和补体时，结果存在较大差异，有时效价可能相差一倍以上，最终导致CFT效价无法确定。SRBC作为滴定CFT其他组分效价的基点，其敏感性直接决定了溶血素效价、补体用量，并与CFT结果密切相关，而SRBC的敏感性主要受保存条件和保存时间的影响。根据以上分析，本研究采用布病CFT为研究模型，用不同保存期的SRBC配制2.5%红细胞悬液，比较其敏感性对CFT结果的影响，从而确定SRBC的最适保存时间，为CFT的科学应用提供参考。
1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器抗原由中国兽医药品监察所生产供应，批号201401。溶血素和补体购自浙江省玉环县南方试剂厂，批号201506和201509。生理盐水和阿氏液由本实验室参照《兽用生物制品规程》(2000版)制备[3]。红细胞采自绵羊，按1:1 (体积比)保存于阿氏液中，存放于4 °C。布病标准阳性血清由本实验室制备，经试管凝集试验(SAT)和虎红平板凝集试验(RBPT)标定为1 000 IU，批号201404。
SIGMA离心机，型号：SIGMA 3K18；IKA涡旋器，型号：Lab Dancer S25，由中国兽医药品监察所提供。
1.2 2.5%红细胞悬液的制备分别取在阿氏液中保存了不同天数的SRBC，以5-10倍体积的生理盐水离心沉淀并洗涤3次，最后一次以2 000 r/min离心10 min，弃去上清，取沉淀血球泥，用生理盐水配制成2.5%红细胞悬液，不同保存时间SRBC的分组情况见表 1。
| 编号 Number | 阿氏液中保存时间 Storage time in alsever’s solution (d) |
| 1 | 3 |
| 2 | 7 |
| 3 | 14 |
| 4 | 18 |
分别取2.5% SRBC悬液1、2、3、4按《家畜布鲁氏菌病细菌学及血清学诊断操作手册》(简称“手册”)[4]配制标准溶血管。
1.4 溶血素、补体和抗原效价的测定按手册中溶血素效价、补体效价和抗原效价滴定程序表[4]分别先后测定溶血素、补体及抗原的效价，与标准溶血管进行比浊，并判定结果。
1.5 血清CFT效价测定将布病标准阳性血清用0.5%石碳酸生理盐水稀释成1:100、1:200、1:300、1:400、1:500，以此类推至1:1 500，同时设立1:2 000稀释度。按手册中补体结合反应正式试验操作程序表[4]分别加入各反应成分，设补体、抗原、溶血素对照。判定反应结果时与标准溶血管作比较，阳性血清CFT判为阳性的最高稀释度即为其补体结合试验反应效价(简称“补反效价”)。
2 结果与分析 2.1 溶血素效价、补体效价、抗原效价确定用2.5% SRBC悬液1、2、3、4先后滴定溶血素效价、补体效价、抗原效价，结果见表 2。结果表明，2.5% SRBC悬液3有较好的敏感性，滴定的溶血素和补体效价均较高。2.5% SRBC悬液2敏感性高于1，但低于3。虽然2.5% SRBC悬液1、2、3滴定溶血素效价、补体效价各不相同，但是抗原效价滴定结果均为1:100。在2-8 °C阿氏液中保存18 d的SRBC配制2.5% SRBC悬液4时有部分溶血现象，其滴定的溶血素效价虽最高，但滴定的抗原效价最低。
| 2.5%红细胞悬 液编号 2.5% SRBC number | 溶血素效价 Hemolysin titer | 补体效价 Complement titer | 抗原效价 Antigen titer |
| 1 | 1:1 500 | 1:13 | 1:100 |
| 2 | 1:2 000 | 1:14 | 1:100 |
| 3 | 1:3 000 | 1:16 | 1:100 |
| 4 | 1:5 000 | 1:15 | 1:75 |
阳性血清用生理盐水做16个不同稀释度后CFT效价测定结果见表 3。2.5% SRBC悬液1、2、3滴定标准阳性血清的最高稀释度均为1:500，由于该稀释度中，阳性血清加入量为0.5 mL，占1 mL总反应体积的50%，因此判定冻干标准阳性血清 (1 mL/支)的补反效价为1:1 000。但是阳性血清在1:600-1:1 000稀释度滴定中，2.5% SRBC悬液3的滴定结果略高于2.5% SRBC悬液1、2，表现出更高的敏感性。2.5% SRBC悬液4因有溶血现象，导致其滴定标准阳性血清的阳性最高稀释度为1:200，补反效价为1:400，比2.5% SRBC悬液1、2、3滴定的标准阳性血清补反效价低60%，其敏感性远低于2.5% SRBC悬液1、2、3。
| 稀释倍数 Dilution | 2.5%红细胞悬液 2.5% SRBC | ||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | ||
| 1:100 | 4+ | 4+ | 4+ | 3+ | |
| 1:200 | 4+ | 4+ | 4+ | 3+ | |
| 1:300 | 4+ | 4+ | 4+ | 2+ | |
| 1:400 | 3+ | 3+ | 3+ | 2+ | |
| 1:500 | 3+ | 3+ | 3+ | 1+ | |
| 1:600 | 2+ | 2+ | 2+-3+ | 1+ | |
| 1:700 | 2+ | 2+ | 2+ - 3+ | 1+ | |
| 1:800 | 1+-2+ | 2+ | 2+ | - -1+ | |
| 1:900 | 1+-2+ | 1+ | 2+ | - -1+ | |
| 1:1 000 | 1+ | 1+ | 1+-2+ | - | |
| 1:1 100 | 1+ | 1+ | 1+ | - | |
| 1:1 200 | 1+ | 1+ | 1+ | - | |
| 1:1 300 | - -1+ | - -1+ | - -1+ | - | |
| 1:1 400 | - -1+ | - -1+ | - -1+ | - | |
| 1:1 500 | - | - -1+ | - -1+ | - | |
| 1:2 000 | - | - | - | - | |
| 注：−：阴性；1+−2+：可疑；3+−4+：阳性. Note: −: Negative; 1+−2+: Suspect; 3+−4+: Positive. | |||||
CFT作为经典的血清学方法已经广泛应用于多种疾病的诊断，然而以往的研究大多集中于比较不同动物红细胞对CFT试验结果的影响。如黄企光等用山羊血代替绵羊血进行CFT，证明了完全可用山羊红细胞替代SRBC用于溶血反应和CFT[5]，但尚无针对不同保存期SRBC敏感性对CFT影响的相关研究报道。本实验室在实际应用中发现SRBC的敏感性与其保存条件、保存时间密切相关，且直接影响CFT的结果。为了明确SRBC敏感性导致的差异，本研究设计了上述试验。
考虑到CFT是布病诊断中最常用的方法之一，作为农业部指定的布病专业实验室，我们需要经常用经典方法对布病进行确诊，因此本研究选取布病的CFT为研究模型，比较不同保存期SRBC的敏感性对CFT的影响。布病作为模型具有广泛的代表性，本研究中的结论并不影响SRBC在其它CFT试验中应用。
本研究中，在SRBC未发生溶血的前提下，相同保存条件的SRBC在阿氏液中保存时间与其敏感性成正相关，即SRBC在阿氏液中2-8 °C保存时间越长，敏感性越高。其中保存14 d的SRBC敏感性最高，保存7 d的SRBC敏感性次之，保存3 d的SRBC敏感性最低，本实验室经多次试验验证该结果可重复。而本研究中相同条件保存18 d的SRBC因发生轻微溶血，相对于保存14 d的SRBC其敏感性显著下降，效价由1:1 000下降至1:400，下降达60%。但是在重复试验中发现SRBC在阿氏液中2-8 °C保存18 d如果不发生溶血仍可用于CFT，其敏感性与保存14 d的SRBC相似。尽管如此，考虑到保存18 d的SRBC可能发生溶血现象，不建议使用。研究结果表明，在CFT中，SRBC在阿氏液中置于2-8 °C保存7-14 d具有较高的敏感性和重复性，其中14 d最佳。
| [1] | Sun XB, He YL, Yuan L, et al. Control physical and chemical factors of complement activity,improve effect of CFT[J]. Journal of Nongken Medicine , 2014, 36 (3) : 283–284. (in chinese) 孙向彬, 贺亚玲, 袁俐, 等. 控制好补体活性的理化因素提 高“补体结合试验”效果[J]. 农垦医学 , 2014, 36 (3) : 283–284. |
| [2] | Wang XL, Jiang YW, Mao KR, et al. Research progress on laboratory diagnosis techniques on Brucellosis[J]. Chinese Journal of Veterinary Drug , 2011, 45 (11) : 37–42. (in chinese) 王秀丽, 蒋玉文, 毛开荣, 等. 布鲁氏菌病实验室诊断方法 的研究进展[J]. 中国兽药杂志 , 2011, 45 (11) : 37–42. |
| [3] | Veterinary Biological Products Regulation Committee of the Ministry of Agriculture. Rules of veterinary biological products of the people's Republic of China (2000)[S]. Beijing: Chemistry Industry Press, 2000: 426 (in Chinese) 农业部兽用生物制品规程委员会. 中华人民共和国兽用生物 制品规程(2000 版)[S]. 北京: 化学工业出版社, 2000: 426 |
| [4] | Yang PY. Operation Manual for Diagnosis of Bacteriology and Serology on Brucellosis[M]. China Institute of Veterinary Drug Control, 1987 . (in chinese) 杨培豫. 家畜布鲁氏菌病细菌学及血清学诊断操作手册[M]. 中国兽药监察所, 1987 . |
| [5] | Huang QG, Tang S, Liu J, et al. Study on CFT of goat blood instead of sheep blood[J]. Journal of Guangxi Medical University , 1998, 15 (1) : 116–117. (in chinese) 黄企光, 唐深, 刘瑾, 等. 用山羊血代替绵羊血进行补体结 合试验的探讨[J]. 广西医科大学学报 , 1998, 15 (1) : 116–117. |