伪狂犬病是由α-疱疹病毒甲亚科的伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起，可导致母猪流产或产弱胎、死胎、木乃伊胎，导致公猪睾丸炎等，是危害我国养猪业的重大疾病之一。自1813年报道发生以来，目前伪狂犬病已呈世界性分布。我国虽长期采取广泛的免疫、净化措施，但该病仍呈局部流行，种猪淘汰率较高^[1]。2011年底，由于抗原变异等原因，一些免疫后猪场暴发严重的伪狂犬病并迅速蔓延到全国大部分猪场，给养殖业带来巨大损失^[2]。

microRNA (miRNA)是长度约为22 nt的生物内源性非编码单链小RNA，广泛存在于动植物及病毒等多种有机体中^[3]，由具有茎环结构的长约70个碱基的单链前体RNA剪切而成。成熟的miRNA小分子通常与细胞内效应蛋白Argonaute等结合组成RNA诱导的沉默复合体(RISC)，之后与靶mRNAs 3′端非翻译区(Untranslated region，UTR)、5′UTR或翻译区的碱基特异性互补配对，从而抑制靶mRNA翻译(部分配对)或直接降解mRNA (完全配对)，最终下调靶基因的表达水平，发挥靶基因的转录后表达调控功能^[4]。在植物中，多数miRNAs与其靶mRNAs的3′UTR完全互补配对，导致切割与降解；在动物中则多数为不完全配对，从而抑制翻译^[5-6]。通常一个miRNA可调控多个靶mRNAs，多个miRNAs也可调控同一个靶mRNA。研究显示，miRNA通过与靶mRNA的作用，参与调控细胞的增殖、分化、凋亡、代谢和肿瘤转移等生物学过程^[7-9]。

大量研究表明，病毒与宿主都可利用miRNAs调节自身及对方转录物，从而实现免疫逃避和自我保护。病毒侵染可导致宿主miRNAs表达谱发生变化，为其生存创造有利条件，同时宿主也可利用miRNAs来实现免疫清除。目前关于miRNAs水平PRV与宿主的相互作用的研究较少，Huang等^[10]通过miRNA芯片杂交筛选获得PRV感染PK-15细胞后差异表达的miR-21，并以小鼠肝癌细胞Hepal-6为模型，经双荧光素酶报告基因结合ELISA实验证明干扰素-γ诱导蛋白10 (IFN-γ inducible protein 10，IP10)是miR-21的靶基因；Anselmo 等^[11]经高通量测序研究PRV感染猪树突状细胞后宿主与病毒miRNAs的表达情况，对差异表达miRNAs进行靶基因预测和Pathway通路分析，表明病毒和宿主miRNAs调控对PRV的潜伏感染均起重要作用；Mahjoub等^[12]研究表明，当PRV病毒缺失位于潜伏期相关转录位点(Latency-associated-t ranscript locus，LAT)的9个miRNAs后，会影响宿主三叉神经节对病毒潜伏感染的反应。

本研究拟阐明PRV-Fa株侵染后PK-15细胞miRNAs表达谱并对其进行深入分析，为进一步揭示miRNAs在PRV感染过程中的作用及筛选抗PRV候选miRNAs奠定基础。

1 材料与方法 1.1 细胞和病毒

猪肾传代细胞(PK-15)，由四川农业大学动物医学院动物生物技术中心提供；伪狂犬病毒Fa株，购自中国兽医药品监察所。

1.2 主要试剂和仪器

Trizol Reagent，Life Technologies公司；2xSYBR Green PCR master mix，Arraystar公司；miRNA mimics及其对照mir-NC，上海吉玛公司；Xfect™ MicroRNA Transfection Reagent Protocol-At-A-Glance，成都天泰生物技术有限公司。NanoDrop ND-1000分光光度计，Thermo Scientific公司；Illumina HiSeq 2000 instrument，Illumina公司；Agilent 2100Bioanalyzer，Agilent Technologies公司；ViiATM7实时荧光定量PCR仪，Applied Biosystems公司。

1.3 细胞样品RNA的提取及鉴定

将长势良好的PK-15细胞传代至3个感染组细胞瓶和3个未感染组(对照组)细胞瓶中，置培养箱中培养(37 ℃，5% CO₂)。待单细胞层长至约85%，感染组细胞接种PRV-Fa (MOI为1)并于接毒后24 h收毒，非感染组细胞不接毒且在相同时间点收取。依照细胞RNA抽提方法分别提取RNA^[13]，并将每组的3个重复样品混合。用NanoDrop ND-1000对提取RNA进行浓度和纯度鉴定，A₂₆₀/A₂₈₀比值范围为1.8-2.1时则为合格。

1.4 总RNA的高通量测序

将合格RNA产品送上海康成生物工程有限公司，采用Illumina高通量测序技术进行深度测序。

1.5 生物信息学分析

高通量测序原始序列存在许多没用信息，经以下分析获得有效、高质量的小RNA序列：(1) 去除低质量Reads；(2) 去除没有3′接头序列Reads；(3) 去除5′接头有污染的Reads；(4) 去除没有插入片段的Reads；(5) 去除包含poly A的Reads；(6) 去除长度≤15 nt和数量≤2的Reads。将剩余序列分别与Rfam数据库(http://rfam.xfam.org/)、Repbase数据库(http://www.girinst.org/repbase/)和NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)比对，去除可能存在的mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA及重复序列。

1.6 差异miRNAs表达谱的构建

将两组样品miRNAs表达量分别采用Transcripts per million (TMP)法标准化为同一量级(单一miRNA拷贝数×10⁶/总miRNAs拷贝数)。为排除miRNA表达量为0的计算干扰，将每个miRNA的拷贝数加10再计算，最终以Fold Change (感染/非感染)≥2或≤0.5为标准，建立miRNAs差异表达谱。

1.7 miRNAs荧光定量验证

为验证高通量测序结果的准确性，随机选取10个差异表达的miRNAs (5个上调和5个下调)。利用Primer 5.0软件设计miRNAs特异性反转录引物及荧光定量PCR引物(表 1)，并送英骏生物技术有限公司合成。

将高通量测序所用细胞样品依细胞RNA抽提方法提取RNA^[13]，并保证其纯度与质量。对RNA模板依次进行加Poly A尾和RT反应，获得cDNA保存于-20 ℃备用。

荧光定量反应体系：2×SYBR Green PCR master mix 5 μL，上游引物(10 μmol/L) 0.5 μL，下游引物(10 μmol/L) 0.5 μL，cDNA 2 μL，RNase Free H₂O 2 μL。反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40个循环，且每个样品重复3次，每个循环后检测体系中荧光信号。U6基因作为内参，采用2^-DDC_t法计算各miRNA的相对表达量，每组数据中以对照组中miRNA的表达量为标准进行相对表达分析。C_t值为反应的实时荧光强度达到设定的阈值时所需要的扩增循环数，即荧光定量PCR分析仪的直接读数。

1.8 差异表达miRNAs靶基因预测

整合TargetScan (http://www.targetscan.org/)和MiRanda (http://microorna.sanger.ac.uk/sequencs/) 两个数据库的算法，对差异表达的miRNAs进行靶基因预测分析，取这两个软件预测的交集作为差异表达miRNAs的靶基因。采用Gene ontology (GO)对靶基因的功能从细胞组成(Cellular component)、生物过程(Biological process)和分子功能(Molecular function) 3个方面进行分析。

2 结果与分析 2.1 细胞样品RNA的提取及鉴定

提取感染和未感染PK-15细胞组总RNA，经NanoDrop ND-1000平台测定纯度及浓度，结果显示感染组A₂₆₀/A₂₈₀值为1.92，非感染组A₂₆₀/A₂₈₀值为1.97，均符合高通量测序所用样品要求。

2.2 总RNA的高通量测序

PRV-Fa株感染和未感染PK-15细胞经高通量测序所得原始数据，经一系列去污染去低质量处理，分别获得干净序列(Clean reads) 586 608条和 3 987 148条，占各自测序总数的91.27%和85.42%。对所有clean reads进行长度分布统计，发现2个文库中miRNAs长度均主要分布在 21-24 nt，符合Dicer酶剪切后产物长度。

2.3 病毒感染前后PK-15细胞的miRNAs表达谱

在PRV-Fa感染及未感染PK-15细胞样本中分别检测到384个和405个miRNAs。两组样本除了分别包含miRBase19.0数据库公布的已知猪源成熟miRNAs 218个和225个外，还分别鉴定出166个和180个新的成熟猪源miRNAs，但其大部分表达量极低。经比对分析，PRV-Fa感染相对未感染细胞差异表达的miRNAs共127个，其中60个表达水平上调(44个已知的，16个新鉴定的)，67个表达下调(47个已知的，20个新鉴定的)，表达下调比上调多7个(3个已知的，4个新鉴定的)。在表达上调的miRNAs中，上调5倍以上的有24个，上调10倍以上的有10个，其中ssc-miR-10b上调幅度最大(61倍)且表达水平也最高；在表达下调的miRNAs中，下调10倍以上的有29个，下调25倍以上的有13个，其中ssc-miR-424-5p下调幅度最大为100倍(表 2)。比对可知，PRV-Fa侵染PK-15细胞后，大部分差异miRNAs表现为表达下调。

2.4 miRNAs荧光定量验证

为验证高通量测序结果的准确性，随机选取10个差异表达的miRNAs进行相对荧光定量PCR分析，计算感染与非感染细胞组中各miRNA差异表达倍数。结果显示，感染组细胞ssc-miR-221-3p、ssc-miR-16、ssc-miR-30d、ssc-miR-10a-5p和ssc-miR-378的表达水平相对非感染组表现为上调，而ssc-miR-152、ssc-miR-29a、ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-21和ssc-miR-novel-chr13_10861相对非感染组的表达水平下调，与高通量测序分析结果一致(图 1)。

2.5 差异表达miRNAs靶基因的预测

整合TargetScan和MiRanda两个数据库，对显著上调与下调的miRNAs进行靶基因预测，取其预测交集作为miRNAs的靶基因，统计获得各差异表达miRNA的靶基因个数(表 2)。选取9个差异表达miRNAs (上调的ssc-miR-10b、ssc-miR-16、ssc-miR-182、ssc-miR-30a-5p、ssc-miR-30d和下调的ssc-miR-21、ssc-miR-24-3p、ssc-miR-novel-chr6_30729、ssc-miR-novel-chr9_39041)和每个miRNA预测的所有靶基因中综合得分前3%的靶基因作为研究对象，按照四边形节点代表miRNA，圆形节点代表对应的靶基因，箭头代表靶向关系，箭头越多则靶向的节点越大的方式，构建了miRNA-Target调控网络(图 2)。

此外，ssc-miR-30a-5p与ssc-miR-30d拥有较多共同调控的靶基因(表 3)，且与其他miRNAs及靶基因形成联系密切的复杂网络，处于核心位置，影响调控网络的稳定性。进一步对ssc-miR-30a-5p与ssc-miR-30d共有靶基因进行GO分析可知，其部分富集在各GO功能上的主要靶基因可相互协同行使一定功能，其中包括在细胞内各种代谢过程中起调节作用的BM25、POLR3G、KLF10、CCNE2、GLCE、LRRK2、RUNX2、ZNF197、CHD1等，也包括细胞定位相关的JPH4等及免疫相关的ITGA4。在整个调控网络中发现有6个靶基因可同时被几个不同的miRNAs调控(表 4)。

2.6 PRV-Fa病毒编码的miRNAs

在PRV-Fa感染后PK-15细胞测序所得miRNAs中，检测到5个miRNAs基因序列可比对到PRV (NC-006151.1)基因组中具有典型miRNAs式的发卡结构上，它们均定位于大片段潜伏期转录物(Large latency transcript，LLT)，按基因组顺序分别命名为PRV-miR-LLT1、PRV-miR-LLT2、PRV-miR-LLT3、PRV-miR-LLT4、PRV-miR-LLT5。这5个miRNAs表达水平普遍非常低，但也存在显著差异(表 5)。通过软件预测其靶基因，共有1 916个宿主基因被这5个miRNAs靶标，GO分析表明其参与细胞各种生命活动调节(图 3)。但严格预测只发现一个PRV基因(即早期蛋白EPO)被PRV-miR-LLT2与PRV-miR-LLT4靶向，其余3个均未预测到针对病毒自身的靶基因。

3 讨论

PRV的潜伏感染是其难以根除的重要原因，对养猪业的健康发展危害严重。miRNAs在免疫系统功能调节中发挥重要作用，包括免疫细胞的发育、分化和功能，炎症介质的释放及调控细胞内的信号通路等。因此，鉴定PRV感染过程中与宿主免疫反应相关的候选miRNAs极为重要。

目前越来越多免疫相关miRNAs被发现，包括miR-10、miR-101、miR-106a、miR-126、miR-142-3p、miR-146、miR-150、miR-155、miR-181a、miR-196b、miR-21、miR-221、miR-223、miR-326、miR-34、miR-424、miR-9、miR-98、miR-17-92家族和let-7家族等^[14-15]。本实验经高通量测序，在PRV-Fa感染及未感染PK-15细胞中均检测到大量猪源成熟的miRNAs，其中免疫相关的差异miRNAs有10个表达上调(ssc-miR-10b、ssc-miR-146b、ssc-miR-155-5p、ssc-miR-34a、ssc-miR-221-3p、ssc-miR-126-3p、ssc-miR-17-5p、ssc-miR-92a、ssc-miR-20a、ssc-let-7i)，9个下调(ssc-miR-424-5p、ssc-miR-19a、ssc-miR-19b、ssc-miR-142-3p、ssc-miR-18a、ssc-miR-146a-5p、ssc-let-7d-5p、ssc-let-7f、sssc-miR-21)，表明PRV-Fa可能影响这些miRNAs的正常表达，从而造成持续感染。

经对比分析，PRV-Fa感染PK-15细胞后有34% miRNAs表达有显著变化，表明病毒侵染过程中对细胞编码miRNAs产生了较大影响。在感染与未感染细胞中，ssc-miR-21的表达水平均非常高。研究报道miR-21在不同细胞类型及感染病毒状态下都有很高表达量，这可能与miR-21参与细胞周期中的细胞分化有关^[11]。此外，miR-21参与前B淋巴细胞瘤的形成，既显著促进细胞增殖，又可抑制细胞凋亡^[16]。PRV-Fa感染细胞后，ssc-miR-21的表达出现显著下调，说明病毒的感染可能通过复杂的调控网络引起细胞凋亡。

细胞miRNAs除了直接靶向病毒基因组，还可通过细胞因子引发免疫反应。例如，本实验差异表达最显著的miR-10b能靶向同源异形盒基因D10并抑制其转录表达，进而调控下游转移蛋白发挥其作用^[17]；过表达的miR-18a能促进T细胞Th1型细胞分化，Th1型细胞具有很强的IFN-γ分泌功能，有利于宿主抗肿瘤免疫应答^[18]；miR-16通过靶向细胞因子IL-8、IL-6等调节NF-κB活性^[19]；miR-145-5p通过靶向SOCS7调节IFN-β的表 达^[20]；miR-499-5p能靶向FOXO4和PDCD4从而加速细胞转移^[21]。miR-146a可抑制有抗病毒复制作用的干扰素IFN-β的产生^[22]，从而达到抗细胞免疫作用。PRV-Fa株感染PK-15细胞后miR-146a表达下调，推测细胞可能通过干扰素对病毒复制产生抑制作用。

本研究筛选PRV-Fa感染组9个差异显著的miRNAs，并构建miRNA-Target调控网络图。结果显示，单个miRNA可同时调控多种靶基因，单个靶基因也可同时受多个miRNAs调控，miRNAs和靶基因都处于一个复杂的调控网络中。其中ssc-miR-30a-5p与ssc-miR-30d几乎共有所有靶基因，推测可能是由于它们同源性极高且种子序列完全相同。种子序列位于miRNA 5′端2-8个核苷酸，是靶标结合的最关键位点^[23]。对ssc-miR-30a-5p 与ssc-miR-30共有靶基因进行GO功能分析，发现它们广泛参与细胞代谢、定位和免疫反应等。miR-30a-5p有抑制细胞增殖促进其凋亡的作用^[24]，而ssc-miR-30a-5p与ssc-miR-30d在PRV-Fa感染后均表现为显著上调，提示miR-30在病毒侵染过程中可能发挥负调控作用。此外，二者也各自拥有自己独特的靶基因，可与其他miRNAs协同作用于某些靶基因功能团，行使调控作用：如ssc-miR-30d、ssc-miR-30a-5p和ssc-miR-24-3p共同调控LRRK2 (蛋白激酶)、RCC1 (染色体浓缩调控蛋白1)，GO分析显示它们主要参与细胞代谢。在miRNA-Target网络图中，调控靶基因最多的是ssc-miR-24-3p。miR-24在不同物种间是高度保守的，可通过靶基因促进细胞扩散和抑制细胞凋亡^[25]。ssc-miR-24-3p在未感染病毒的PK-15细胞中表达水平非常高，位居所有miRNAs表达量前五，但在感染PRV-Fa后表达水平显著下降，提示ssc-miR-24-3p下调可能是由细胞调控，通过促进自身凋亡来抑制病毒增殖。

通过与PRV病毒基因组对比，本研究鉴定出 5个新的病毒编码的miRNAs均定位于LLT区。预测其针对猪的靶基因有1 916个，GO分析发现其参与多种复杂的细胞调控过程。而预测针对病毒自身的靶基因却只发现一个即早期蛋白基因EPO，且仅被PRV-miR-LLT2与PRV-miR-LLT4靶向。研究表明^[26]，EPO基因是伪狂犬病毒的早期基因，可激活IE180的转录，从而抑制LLT的神经特异性启动子LAPl，与病毒的潜伏感染相关，但其在PRV中的定位及功能尚不清楚。病毒miRNAs主要通过调控宿主细胞凋亡，细胞周期和免疫应答来促进自身的存活，但是否与病毒逃避免疫、促进潜伏感染有关，需进一步研究。

综上所述，本研究深入分析了猪伪狂犬病毒Fa株侵染对PK-15细胞microRNAs表达谱的影响，并检出大量免疫相关miRNAs，证实了其在PRV感染过程中的重要作用。有助于深入了解miRNAs在宿主-病原体互作关系中的作用，为筛选抗PRV候选miRNAs和从miRNAs角度提出防控伪狂犬病新策略提供参考。