草酸(Oxalic acid，OA)虽然是最简单的有机二元酸，却是许多植物致病菌的致病因子^[1]。灰霉菌(Botrytis cinerea)^[2]、菌核菌(Sclerotinia sclerotiorum)^[3]等草酸分泌型病原菌可在致病初期向侵染环境中分泌草酸，通过降低环境pH、螯合Ca²⁺、并对植物产生毒害等作用引起和增强致病性^[4-5]。已有研究表明，草酸分泌缺陷型灰霉菌和菌核菌的突变体不具备或致病力降低^{[3, 6]}。研究者发现一些木霉具备消除草酸的能力，且该能力与生防功能有关。绿色木霉(T. viride) S7对菌核菌的拮抗作用中，提取物表现出明显的草酸氧化酶(Oxalate oxidase，OXO)活性，最高可降解23%的草酸^[7]。另有报道，绿色木霉(T. viride) TvB1、哈茨木霉(T. harzianum) ThB1及康宁木霉(T. koningii)可显著降低齐整小核菌Sclerotium rolfsii所产生的草酸，并直接导致白绢病发病率的降低^[8]。筛选具有耐受和消除草酸能力的木霉生防菌，有助于开发针对灰霉病、菌核病等草酸分泌型病害的高效生防菌剂。

哈茨木霉(T. harzianum) LTR-2，原鉴定为绿色木霉(T. viride)，后更正为哈茨木霉(T. harzianum)，是山东省应用微生物重点实验室发现并分离的 一株木霉菌株，该菌株及其制剂获国家发明专利(ZL200510104385.7)，并已在农业部注册为农药。

LTR-2在PDA平板上28 ℃培养5-7 d，对蔬菜灰霉病菌的抑菌谱为10.0 mm，其可湿性粉剂在田间可有效防治番茄、茄子、五彩椒、辣椒、扁豆和黄瓜 6种蔬菜灰霉病，防治效果为71%-81%^[9]。草酸耐受平板实验结果表明，LTR-2可耐受80 mmol/L的草酸浓度，其草酸耐受性在42株受测试的木霉菌株中最为突出。本文分析了LTR-2耐受、消除草酸的特性，将作为研究LTR-2消除草酸机制的基础性数据。

本试验所使用木霉菌株由山东省应用微生物重点实验室分离并保藏，菌株情况详见表 1。

1.2.1 含草酸培养基的配制：因草酸在高温高压下分解，因此采用0.22 μm孔径的一次性针头式过滤器对0.5 mol/L的草酸母液进行过滤除菌。将PDB液体培养基(美国BD公司)、PDA培养基(在PDB中添加10.0 g/L琼脂粉)或无碳源的察氏培养基(g/L：NaNO₃ 3.0，K₂HPO₄ 1.0，MgSO₄·7H₂O 0.5，KCl 0.5，FeSO₄ 0.01)在64.73 kPa灭菌30 min，待冷却到50 ℃以下时，按比例添加草酸母液至终浓度。

1.2.2 草酸耐受性测定平板试验：将42株木霉待测菌株于PDA培养基中活化，25 ℃暗培养3 d。用5 mm打孔器取平板边缘菌丝分布均匀处的菌块，菌丝面朝下，分别接种于含20、30 mmol/L的PDA培养基上。菌块距离平板边缘1 cm，置于25 ℃暗培养4 d。设不添加草酸的PDA平板为对照，试验共设3个重复。分别测量草酸平板的菌落半径(r^草酸+，mm)和对照平板的菌落半径 (r^草酸-，mm)，计算草酸耐受率(T^草酸，%)，公式为。

1.2.3 草酸胁迫下木霉的形态观察：将3 d龄LTR-2的5 mm菌块分别接种于含有10、20、50、80和100 mmol/L草酸的PDA培养基上，25 ℃半光照培养10 d，观察并描述菌落形态。在无菌载玻片上涂布分别含有0、10、20、50、80和100 mmol/L草酸的PDA培养基，将3 d龄LTR-2的菌丝分别接种于培养基上，置于无菌培养皿中用封口膜封口。25 ℃培养1 d。直接将载玻片置于显微镜下，观察菌丝、分生孢子梗和厚垣孢子等结构。

1.2.4 木霉消除不同浓度草酸的定量测定：取4 d龄LTR-2的培养平板，用无菌接种针轻轻刮下分生孢子，悬浮在含有0.01% triton的无菌水中，滤纸过滤，制成浓度为10⁷分生孢子/mL的孢子悬浮液。将PDB培养液分装在500 mL三角瓶中，每瓶100 mL。分别往培养基中加入不同量的草酸母液，使其终浓度分别为0、10、20、50、80和100 mmol/L，将 100 μL木霉分生孢子悬浮液接种至各处理三角瓶(初始浓度为10⁴分生孢子/mL)，以含有不同浓度 草酸但不接种木霉(以100 μL含有0.01% triton的无菌水代替)的PDB培养液为对照。每处理设3个重复。25℃、160 r/min培养5 d。用预先称重的滤纸抽滤，分离各三角瓶中的木霉菌丝和培养液。将带有菌丝的滤纸置于50 ℃烘箱中，烘烤至恒重，计算菌丝干重。用pH计测定三角瓶培养物滤液的pH。

参考Kim等的方法测定培养物滤液中的草酸含量^[10]。

1.2.5 草酸为碳源的木霉培养：以1.2.4的方法制得分生孢子悬浮液。将无碳源的察氏培养基分装在500 mL三角瓶中，每瓶100 mL。添加草酸母液，使其终浓度分别为0、10、20、50、80和100 mmol/L，将100 μL木霉分生孢子悬浮液接种至各处理三角瓶，以含有不同浓度草酸但不接种木霉(以100 μL含有0.01% triton的无菌水代替)的无碳源察氏培养液为对照。每处理设3个重复。25 ℃、160 r/min培养5 d。观察生长情况。

1.2.6 不同时期LTR-2中草酸脱羧酶(Oxalate decarboxylase，OXDC)基因LTR_04445表达水平的Real-time PCR检测：LTR-2总RNA的提取按照OMEGA公司的试剂盒说明书进行，反转录按照Takara公司的试剂盒说明书进行。本实验采用相对定量法分别对培养3、4、5、6、7和8 d的LTR_04445表达水平进行Real-time PCR检测。采用Beacon Designer 7.0引物设计软件设 计引物，F：5′-ATTTCTCCCTCTTCCAGT-3′，R：5′-TCGTAATCTCGTCCTTCT-3′，扩增长度为132 bp的木霉LTR_04445基因片段。Real-time PCR反应体系(15 μL)：2×Sybrgreen Premix 7.5 μL，Primer Premix 1.5 μL，cDNA 1 μL，dd H₂O 5 μL。反应条件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共40个循环。熔解曲线分析条件：65 ℃-95 ℃，间隔0.5 ℃，20 s。具体操作按照Eppendorf公司的说明书进行。

木霉菌株在20 mmol/L和30 mmol/L的草酸胁迫下，菌体生长速度受到不同程度的抑制。由于在24 h内生长缓慢的菌株无法准确测量，且一半以上的木霉菌株生长96 h后即长满平板，本文分析了48 h和 72 h两个时间点的草酸耐受率。在42株测试木霉菌株中，20 mmol/L草酸胁迫下，仅有8株木霉菌株的草酸耐受率在48 h和72 h时达到50%以上，其中LTR-2的草酸耐受能力最强，培养72 h后为73% (图 1A、B)。在30 mmol/L浓度下，所有测试菌株的生长受到抑制，草酸耐受率均未超过50%。其中LTR-2在培养48 h时的草酸耐受率为43.82%，72 h时为39.50%，比其他菌株的草酸耐受性更强(图 1C、D)。

图 1　株木霉在不同浓度草酸胁迫下的耐受性 Figure 1　OA tolerance of 42 Trichoderma strains under different OA stresses 注：A-B：在含20 mmol/L草酸培养基中培养，其中A为培养48 h，B为培养72 h；C-D：在含30 mmol/L草酸培养基中培养，其中C为培养48 h；D为培养72 h；E：在含20 mmol/L草酸培养基中培养4 d时的菌落形态，以菌株LTR-2、639-1为草酸耐受性较强的木霉代表，以菌株16-16、38-7为草酸耐受性较弱的木霉代表. 培养条件为PDA，25 ℃暗培养. 数据为3个重复的平均值. Note: A-B: cultured under 20 mmol/L OA stress,of which A as cultured for 48 h,B as cultured for 72 h; C-D: cultured under 30 mmol/L OA stress,C: cultured for 48 h,D: cultured for 72 h; E: colony shape of typical strains cultured under 20 mmol/L OA stress for 4 d,LTR-2 and 639-1 represent strong tolerance strains,16-16 and 38-7 represent poor tolerance strains. The strains were cultered on PDA at 25 ℃ in the dark. The data are average of 3 replicates.

图选项

用于测试的木霉菌株分离自不同地域的土壤、水或生物样品中，生理性质差异较大，在草酸耐受能力上也是如此。从菌落形态角度分析，耐受能力较强的木霉菌株在OA含量为20 mmol/L的条件下可生长为具有正常菌落特征的形态，仅表现为生长速度的差异；耐受能力较弱的木霉菌株在20 mmol/L条件下无法形成正常菌落，无气生菌丝和分生孢子产生，而仅形成致密的不规则菌落形态(图 1E)。

经比对，LTR-2的耐受草酸能力相对较强，我们进一步分析了LTR-2在草酸胁迫下的形态变化特征。

将LTR-2分别置于草酸终浓度为0、10、20、50、80和100 mmol/L的PDA平板中25 ℃半光照培养。培养120 h时不添加草酸的平板中，LTR-2已形成大量的菌丝和绿色分生孢子(图 2A)。显微镜观察分生孢子梗由菌丝直立生出，对生，整体像树枝，分枝与分生孢子梗近似直角，末端为小梗，小梗瓶颈，分生孢子球形或长椭圆形(图 2G)。其特征与LTR-2的描述一致^[11]。在含10 mmol/L和20 mmol/L草酸的PDA平板中，LTR-2的产孢量明显降低，气生菌丝减少，菌落出现了大块的“露白”(图 2B、C)。不过显微镜观察仍可见正常的分生孢子梗、分生孢子等正常结构(图 2H、I)。当草酸浓度达到50 mmol/L和80 mmol/L时，仍可形成一定的菌落形态，但在培养了120 h后，无明显丝状菌特征，无分生孢子产生。且生长极为缓慢，浓度越高生长越缓(图 2D、E)。显微镜下发现菌丝产生变异，形成串生的厚垣孢子结构，无法观察到分生孢子梗，更无孢子产生(图 2J、K)。不过在50 mmol/L条件下培养8 d后，菌落边缘可再萌发菌丝并产生分生孢子，在新萌发的菌丝中可观察到结构简单的分生孢子梗(图 2L)。当草酸浓度达到100 mmol/L时，LTR-2停止生长(图 2F)。

图 2　草酸处理后LTR-2的菌落形态和显微结构 Figure 2　Colonies and mycelia morphology of LTR-2 under OA treatment 注：A-F：培养5 d的菌落形态；A：未添加草酸；B：添加10 mmol/L草酸；C：添加20 mmol/L草酸；D：添加50 mmol/L草酸；E：添加80 mmol/L草酸；F：添加100 mmol/L草酸. G-K：培养5 d的显微结构，G：未添加草酸；H：添加10 mmol/L草酸；I：添加20 mmol/L草酸；J：添加50 mmol/L草酸；K：添加80 mmol/L草酸. L：培养8 d时LTR-2在50 mmol/L草酸中的显微结构. 培养条件为PDA 25 ℃半光照培养. Note: A-F: colonies of LTR-2 cultured for 5 d on PDA containing different concentration of OA; A: nil; B: 10 mmol/L; C: 20 mmol/L; D: 50 mmol/L; E: 80 mmol/L; F: 100 mmol/L. G-K: microscopic morphology of LTR-2 cultured for 5 d on PDA containing different concentration of OA. G: nil; H: 10 mmol/L; I: 20 mmol/L; J: 50 mmol/L; K: 80 mmol/L. L: microscopic morphology of LTR-2 cultured on PDA containing 50 mmol/L of OA for 8 d. The strains were cultered on PDA at 25 ℃ in the semi-light.

图选项

相对于挑菌压片，载玻片上的原位观察可更加直观地反映草酸胁迫下LTR-2的发育特征变化。正常状态下，LTR-2生长24 h时，致密的菌丝生长脉络清晰，并可见大量分生孢子梗形成(图 3A)。受到10 mmol/L草酸的胁迫，培养24 h时，产生大量菌丝，但较为凌乱，且很难观察到分生孢子梗(图 3B)。当草酸浓度进一步增至20 mmol/L时，菌丝较为稀松，可见一些菌丝顶部产生膨大的厚垣孢子(图 3C)。30 mmol/L条件下，菌丝更加稀松，产生大量的球状厚垣孢子(图 3D)。50 mmol/L条件下，菌丝因过于稀疏不容易被观察到，视野被大量的球状厚垣孢子替代(图 3E)。当浓度达到80 mmol/L时，24 h培养时间内无任何菌体结构 产生(图 3F)。

图 3　草酸处理后LTR-2的原位发育情况 Figure 3　In situ development of LTR-2 treated with different concentration of OA 注：A：未添加草酸；B：添加10 mmol/L草酸；C：添加20 mmol/L草酸，箭头指示顶端厚垣孢子；D：添加30 mmol/L草酸，箭头指示球形厚垣孢子；E：添加50 mmol/L草酸，箭头指示厚垣孢子；F：添加80 mmol/L草酸. 培养条件为PDA 25 ℃暗培养1 d. Note: A: nil; B: 10 mmol/L OA; C: 20 mmol/L OA,the arrow indicates terminal chlamydospore; D: 30 mmol/L,the arrow indicates spherical chlamydospore; E: 50 mmol/L,the arrow indicated spherical chlamydospore; F: 80 mmol/L. The strains were cultered on PDA at 25 ℃ in the dark for 1 d.

图选项

为了检测LTR-2消除草酸的能力，我们采用了液体培养的方式。结果不添加草酸的液体培养基未能检测出草酸，不添加LTR-2的草酸含量在培养的5 d内没有明显变化；添加了10-100 mmol/L草酸的液体培养液接种LTR-2后，草酸含量有不同程度的降低(图 4A)。草酸消除率由高到低为添加浓度是20>10>80>50>100 mmol/L的草酸，消除率分别为66.50%、55.06%、38.94%、28.43%和6.75% (图 4B)。不添加草酸的培养液初始pH为5.89，培养5 d后pH升高为7.25；但添加了草酸的培养液其初始pH与培养5 d后的pH没有明显变化；接种LTR-2后，没有添加草酸的培养液pH较初始显著降低，添加草酸的培养液pH较初始有不同程度的提高，其中在10、20 mmol/L草酸条件下升高幅度最大(图 4C)。

图 4　 LTR-2消除草酸的作用分析 Figure 4　Effects of OA elimination of LTR-2 under some treatment conditions 注：A：培养滤液中的草酸浓度变化；B：LTR-2对培养滤液中草酸的消除率；C：培养滤液中pH变化；D：LTR-2的菌丝干重. 图中a-f表示培养液中草酸的初始浓度分别为0、10、20、50、80和100 mmol/L；a'-f'表示分别在a-f培养液中接种LTR-2，使每处理的分生孢子初始浓度均为104分生孢子/ml. 数据为3个重复的平 均值. 培养条件为PDB 25 ℃、160 r/min暗培养5 d. Note: A: variation of OA concentration in culture filtrate; B: OA elimination rate of LTR-2; C: variation of pH in culture filtrate; D: dry mass of LTR-2. a-f indicate the initial OA concentration in culture medium are 0,10,20,50,80 and 100 mmol/L,respectively; a'-f' indicate initial concentration of LTR-2 in a-f is 104 spores/mL. The data are average of 3 replicates. The strains were cultured in PDB at 25 ℃ and 160 r/min in the dark for 5 d.

图选项

有趣的是，在一定浓度的草酸胁迫下，木霉的生长速度有所加快。如图 4D结果所示，在不添加草酸的培养液中，5 d后，LTR-2的菌丝干重为 0.13 g。在添加了10、20 mmol/L草酸的培养液中，菌丝干重分别提高至0.20 g和0.15 g。然而当草酸浓度高于50 mmol/L时，培养5 d时菌丝的生长受到明显的抑制。这些结果表明，一定浓度的草酸胁迫对木霉菌丝的生长具有促进作用，这种作用可能由于营养吸收或某种诱导机制造成。

为了验证LTR-2是否可以利用草酸为唯一碳源，将液体察氏培养基中的碳源去掉，仅添加不同浓度的草酸培养5 d，检测LTR-2的培养情况。

结果表明，在无碳源的条件下，LTR-2无法生长(图 5A)。在草酸浓度高于50 mmol/L条件下，LTR-2也无法生长(图 5D-F)。仅在含10 mmol/L和20 mmol/L草酸的培养液中，LTR-2可形成细小的绿色菌丝球，其中以10 mmol/L培养液中的菌丝球产生更多(图 5B、C)。结果表明，LTR-2可利用<20 mmol/L浓度的草酸为碳源缓慢生长，也在一定程度上解释了低浓度草酸的促生作用；但在>20 mmol/L浓度下，LTR-2不能利用草酸为碳源生长。

图 5　 LTR-2在以草酸为碳源的察氏培养基中的生长情况 Figure 5　Growth of strain LTR-2 in Czapek-Dox liquid medium under different concentration of OA as sole carbon source 注：A：未添加草酸；B：添加10 mmol/L草酸；C：添加20 mmol/L草酸；D：添加50 mmol/L草酸；E：添加80 mmol/L草酸；F：添加100 mmol/L草酸. 培养条件为25 ℃、160 r/min暗培养5 d. Note: A: nil; B: 10 mmol/L; C: 20 mmol/L; D: 50 mmol/L; E: 80 mmol/L; F: 100 mmol/L. The strains were cultured at 25 ℃,160 r/min in the dark for 5 d.

图选项

为了进一步验证LTR-2在草酸处理下是否启动了消除草酸的机制，我们对LTR-2的OXDC基因LTR_04445在不同时间点转录水平上的表达情况进行了分析。LTR-2在添加终浓度为20 mmol/L草酸的PDB液体培养基25℃、160 r/min暗培养3-8 d，经Real-time PCR检测，LTR_04445的表达量具有明显浮动(图 6)。

图 6　各时间点LTR_04445转录水平的表达量变化 Figure 6　Transcriptional levels changes of LTR_04445 at different time points

图选项

培养2 d时，菌丝尚未大量形成，现有方法难以获得木霉转录组，因此无法分析表达水平。在培养3 d后，菌丝量增加至可检测；直至培养6 d时，处理组培养滤液的pH达到6.0；培养8 d时，菌丝已粘稠，且滤液pH稳定在6.0。因此分析3-8 d的表达水平比较合适。培养3、4 d时，LTR_04445表达量小幅上调，5 d时表达量比之前上调幅度显著增加。但意外的是，培养6 d时，表达量相比对照组有所上调，但上调幅度显著小于3 d和4 d的。而培养7 d时，表达量上调幅度回升，至8 d时，表达量上调幅度为最大。从上述结果得出：(1) 培养液中添加草酸，LTR-2的OXDC基因LTR_04445的表达量发生了上调；(2) 时间动态上，基因的表达量浮动明显，其中5 d、8 d表达量提高幅度最大。结果表明，LTR-2消除培养液中的草酸，启动了草酸代谢机制，但时间动态的表达量浮动现象还需要进一步的研究解释。另外，其他可能存在的机制也需要转录组分析等技术手段进行验证。

草酸毒素是菌核菌、灰霉菌等植物病原菌的致病因子：(1) 草酸降低植物组织受侵染区域的环境pH，使几种细胞壁降解酶可产生活性；(2) 草酸螯合植物细胞壁中的Ca²⁺，形成的草酸钙晶体可阻塞植物导管，也使细胞壁软化和扩大细胞膜的通透性，从而引起细胞器和组织的破坏；(3) 草酸造成的低pH值环境有效抑制植物氧爆的发生；(4) 草酸可干预植物保卫细胞的功能，使气孔不能正常开放，抑制在侵染时脱落酸诱导的气孔关闭行为^[12]；(5) 草酸是发病初期引发植物细胞死亡的主要原因；(6) 草酸本身具有非特异性植物毒素作用^[13]。某些单子叶植物(如大麦、小麦、高粱、玉米、水稻等)在病害侵染时，可分泌草酸降解酶(OXO)，但多数双子叶植物无此机制。除了植物自身的消除草酸机制外，目前人工消除草酸的措施通常为直接喷洒碳酸钙，中和草酸为无害的草酸钙(如防治咖啡叶斑病)。但该方法弊端明显：(1) 生成的草酸钙易阻塞气孔，影响植物正常生理功能；(2) 不易到达叶密作物的茎部或根部病害，病害隐患无法消除；(3) 施用一次仅可维持一个作物季，治标不治本；(4) 长期施用对土壤性质造成一定影响。我们的研究表明，木霉LTR-2抑制灰霉病的同时具有消除草酸的作用，木霉耐受草酸作用与抑制灰霉菌有相关性，木霉消除草酸作用与对灰霉菌的抑制率间具有正相关性(P<0.05)。同时，木霉具有丰富的抗病机制，更可诱发植物自身的抗病性，长期施用对土壤肥力也有改良作用，是防治草酸分泌型病害的优秀生防菌候选。但目前，有关木霉耐受、消除草酸的深入研究很少，本文旨在对木霉LTR-2的耐受、消除草酸作用进行初步的探讨，为进一步的防病机制研究提供理论基础。

在病原菌侵染初期所分泌的草酸溶液浓度目前并未见报道。如前述，草酸毒素的分泌可直接造成植物的叶萎(foliar wilting)，并可导致豌豆气孔无法正常闭合^[14]。草酸毒素还可诱发植物细胞死亡程序(PCD)^[15]。据报道，菌核菌粗毒素对向日葵种子萌发和胚根的生长有强烈的抑制作用，甚至造成根尖生长点死亡，对幼苗有很强的致萎活性，可导致茎基部全部坏死，叶片全部干枯^[16]。由此可推断病原菌瞬时分泌的草酸溶液浓度较高，但具体浓度有待进一步研究。有研究采用的筛选草酸降解菌的草酸浓度为20-30 mmol/L^[17]。我们的研究发现，对于绝大部分木霉在30 mmol/L草酸的胁迫下生长受到严重抑制，其中LTR-2等菌株表现较好，耐受率也未到50%；而在高于80 mmol/L的草酸浓度中，LTR-2几乎无法生长，消除草酸的能力更是大大 降低。

LTR-2在30 mmol/L的草酸环境中，初生的菌丝首先形成了厚垣孢子。厚垣孢子的形成是木霉应对逆境条件的一种生存策略^[18]。虽然人们很早就发现了厚垣孢子，并利用其特性开发了更稳定的制剂，但厚垣孢子的形成机制并不明晰。研究表明，不同真菌厚垣孢子的形成机制存在较大差异，而木霉的厚垣孢子形成有可能是多基因共同参与的复杂调控过程，因很难通过T-DNA插入突变的方式获得不产生厚垣孢子的突变菌株^[19]。本研究中，在<50 mmol/L的草酸浓度下，LTR-2在24 h内即形成厚垣孢子，再培养5-7 d后，厚垣孢子可在相同的草酸浓度下萌发出比较正常的菌丝，也可形成相对稀少的分生孢子梗，并产生分生孢子，且不再产生大量的厚垣孢子。在这个过程中，LTR-2菌体经历了从“防御”到“适应”的状态转变，其中的机制并不清楚。另外，在液体培养中，10、20 mmol/L浓度的草酸对LTR-2的生长反而起到了促进作用，LTR-2更可利用草酸为碳源进行生长。对于草酸的消除作用，通常等同于降解作用。研究比较多的是主要存在于高等植物中的氧化代谢途径^[7]及真菌和细菌中的脱羧代谢途径^[20]。木霉的提取物中已发现有OXO酶活性^[7]，在NCBI上也登记有OXDC氨基酸序列信息。本文Real-time PCR结果也验证了OXDC基因的表达在草酸处理时有所上调。表明草酸代谢途径可能也存在于木霉中，但代谢途径碳的代谢终产物为CO₂，而异养型微生物无法利用CO₂作为直接碳源。本文2.4提到木霉可利用草酸为碳源生长，并具有从“防御”到“适应”的过程。那么木霉中也许存在降解途径以外的其他消除草酸的途径，比如作为前体转化为大分子营养物质、细胞器隔离等途径。对木霉消除草酸作用的进一步研究，可为筛选针对草酸分泌型病害的高效专型防治木霉提供新靶标。