甘肃省麦积山景区地处西秦岭主脉，是秦岭地区物种多样性最丰富的地区之一，区内自然景观丰富多彩，生态系统保存完整^[1]，但近年来由于气候和人为原因，景区原始林地面积明显减少，生物多样性和生态稳定性受到严重影响^[2-3]。自1973年以来，景区引入了以日本落叶松为主的外来种，建置了大面积的人工林地，对景区内森林生态系统的构建起到了积极的促进作用^[4]。大量研究表明日本落叶松能通过改变土壤的微生物群落结构，进而改变本地植物种与土壤微生物之间经过长期协同进化形成的平衡互生关系，从而影响本地植物种的生长和种群更新^[5-6]。

珍稀物种保护与合理外来种引种是麦积山景区生物多样性保护的重要举措，而植物物种多样性的变化能通过其根际土壤微生物多样性的变化得以表征，同时土壤微生物群落的变化会对植物物种多样性产生反作用^[7]，探讨不同植物根际土壤微生物生理群生态多样性特征对了解土著植物种的生存状态及选择适合的植被类型进行生态保护具有重要意义。本研究将传统平板培养与磷酸脂脂肪酸(PLFA)分析法相结合，试图通过对麦积山景区3种典型的裸子植物，土著濒危种红豆杉[Taxus chinensis (Pilg) Rehder.]、土著建群种云杉(Picea asperata Mast)及外来种日本落叶松[Larix kaempferi (Lamb) Carriere.]根际土壤微生物区系的分析比较，以阐明不同植物种类与土壤微生物数量分布及群落结构的关系，为景区珍稀物种的保护与合理外来引种寻求科学的理论依据。

1 材料与方法 1.1 研究区域概况

小陇山自然保护区位于甘肃省东南部的天水市，地理坐标为33°31′-34°41′N和104°23′-106°43′E，海拔700-2 500 m，年平均气温7-12 ℃，年均降水量460-800 mm，多集中在7-9月，年蒸发量 989-1 658 mm，相对湿度68%-78%，年日照时数 1 520-2 313 h，无霜期120-218 d，≥10 ℃积温 2 444-3 825 ℃，土壤以山地褐土和山地棕壤为主，属于独特的温凉湿润区和半湿润区大陆性气候。

1.2 研究方法

1.2.1 根际土壤采样: 于2013年7月中旬根据小陇山环境和植被状况特征选择生境相似、生长旺盛的红豆杉、云杉、日本落叶松(编号为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)样地3个，每样地10 m×10 m，在样地内选取中等大小成年植株5株，采用抖动法采集根际土壤混合为土样，挑出土样中的石砾、植物残留根和其它废弃物后，取部分土壤风干过筛，测定土壤有机质、含水量及pH (表 1)。其余土样过2 mm筛后分为两份，一份立刻进行微生物平板培养，测定可培养微生物特征；另一部分-20 ℃冷冻，一周内测定PLFA。

1.2.2 根际土壤可培养微生物数量测定: 将处理好的根际土1 g加入9 mL无菌水制成原菌液，稀释为不同浓度梯度的土壤悬浮液，采用涂布方法进行微生物培养，细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基，37 ℃培养2-3 d，真菌和放线菌培养基分别采用马丁氏和高氏1号培养基，分别于28 ℃培养3-5 d，3种微生物各浓度均设3个重复，采用平板菌落计数法计数，培养基配方、菌种鉴定和分类参照文献^[8]的方法进行。

1.2.3 根际土壤微生物磷酸脂肪酸测定: PLFA的提取：将4 g土样加入25 mL比色管，加入12 mL体积比为2:1的甲醇、氯仿混合液后再加入3 mL柠檬酸混合均匀，萃取2次，萃取液中加入8 mL体积比为1:1的氯仿与柠檬酸混合液静置过夜，待溶液分层后取下层液氯仿萃取3次，旋转蒸发萃取液过层析柱，层析柱淋出液用三角瓶40 ℃蒸干后，加0.5 mL二氯甲烷和1 mL甲醇钠溶液50 ℃ 加热10 min甲酯化磷脂，再加6 mL分析纯正己烷振荡萃取，上清液用无水硫酸钠过滤，滤液在10 mL KD浓缩器中经氮气吹干，色谱纯正己烷定容至 100 μL上机检测^[9]。PLFA的测定：采用修正的Bligh-Dyer方法^[10]，Agilent5890气相色谱仪测定，火焰离子检测器(FID)温度280 ℃，进样口温度250 ℃，柱箱初始温度120 ℃，最高温度300 ℃，吹扫气体N₂，吹扫时间0.75 min，色谱柱采用长30.00 cm、直径为320.00 μm的HP-5MS毛细管柱，数据采集频率为20 Hz。PLFA的识别与定量：用i15:0、a15:0、i16:0、i17:0、14:0、16:0、17:0、cy17:0、cy19:0、16:1ω7作为细菌源脂肪酸，真菌源脂肪酸以16:1ω9c、18:1ω9c、18:1ω9t等表示^[11]，放线菌以10Me16:0、10Me18:0等作为源脂肪酸^[12]，PLFA含量标定与计算参照文献^[13]。 1.3 数据处理

数据统计分析与整理采用SPSS 15.0软件和Microsoft office excel 2003软件完成。

2 结果与分析 2.1 3种植物根际土壤可培养微生物数量分析

3种裸子植物根际土壤微生物数量各有不同，可培养微生物数量分布与植物种类关系密切 (表 2)。3种植物均以细菌数量最多，且以红豆杉含量最高，为18.15×10⁶ CFU/mL；云杉次之，为14.27×10⁶ CFU/mL；日本落叶松最低且与二者间有显著差异。土壤真菌数量以云杉最丰，为 9.40×10⁵ CFU/mL，与红豆杉无显著差异。放线菌数量以红豆杉最丰，云杉次之，但二者间没有显著差异，微生物总数红豆杉与云杉分别为25.67×10⁶ CFU/mL和21.37×10⁶ CFU/mL，日本落叶松最低，为5.31×10⁶ CFU/mL，与红豆杉及云杉间有显著差异。

2.2 3种裸子植物根际土壤微生物菌群PLFA含量变化

对3种裸子植物根际土壤细菌、真菌和放线菌PLFA含量变化分析表明(表 3)，以红豆杉根际土壤总PLFA种类为最丰、云杉次之，日本落叶松最低，与二者间有显著差异，3种植物的细菌和真菌PLFA含量与总PLFA量变化总趋势相似，放线菌PLFA量与总PLFA变化规律差别较大，以红豆杉最高，红豆杉次之，日本落叶松最低，且三者间有显著差异。革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌均比值以日本落叶松最高，且与红豆杉及云杉间有显著差异，真菌与细菌比值以云杉最高，红豆杉次之，二者间无显著差异，日本落叶松则最低。

2.3 3种裸子植物根际土壤PLFA标记物含量分析

对3种裸子植物根际土壤中占总PLFA含量0.5%以上的15种标记成分分析表明(图 1)，含量较高的脂肪酸为18:1ω9c、16:1ω7c、10Me16:0、16:00、i16:0和i15:0，占3种植物脂肪酸总量的40%以上，其中3种脂肪酸16:1ω7c、10Me16:0和i16:0占红豆杉土壤总脂肪酸的6%以上，10Me16:0、i16:0和16:00占云杉总脂肪酸的8%以上，i16:0、16:00和i15:0占日本落叶松总脂肪酸的9%以上。3种植物中含量最高的前5种PLFA生物标记物各不相同，且含量也存在着明显的差异，并呈现不同的变化趋势。

2.4 3种植物根际土壤微生物群落PLFA的主成分分析

对3种裸子植物根际土壤微生物群落PLFA主成分分析表明，与土壤微生物PLFA生物标记多样性相关的主成分1、2分别解释变量方差的55.47%与34.69% (图 2)。进一步分析发现，红豆杉位于主成分1的正端和主成分2的正端，云杉位于主成分1的正端和主成分2的正、负端交叉点，日本落叶松位于主成分1的负端和主成分2的负端。土壤微生物群落结构可以分成2种类型，红豆杉与云杉具有相似的微生物群落结构，日本落叶松则与前者有明显差异。因此，主成分分析再次证明外来种日本落叶松对土壤微生物的影响强于土著种红豆杉与云杉。

2.5 3种植物根际土壤微生物多样性分析

将3种裸子植物根际土壤可培养微生物数量与PLFA含量特征相结合进行多样性分析显示(表 4)，Simpson指数和Shannon-Wiener指数等多样性指数值体现了良好的一致性，均以红豆杉根际土壤微生物多样性指数为最高，云杉次之，日本落叶松为最低，且与前两者间有显著差异，说明外来种日本落叶松根际土壤微生物种群发生了较大的变化，已经改变了本地土壤微生物的结构与特征。

3 结论与讨论

多种研究方法相结合是土壤微生物多样性研究中常用的措施，实验采用传统平板计数法与磷脂脂肪酸图谱(PLFA)法研究了麦积山景区3种典型裸子植物根际土壤微生物的数量分布与群落结构特征。传统平板计数法与PLFA分析法同时显示不同植物之间根际土壤微生物数目、种类及多样性指数间均存在一定的差异，此结果与郑华、张于光、安韶山等的研究结果相一致^[14-16]。植物产生的根分泌物是微生物重要的能量物质，能在根系周围营造特殊的根际微生态环境，影响微生物的种类和繁殖，进而影响微生物群落结构和功能及其多样性^[17-18]。本研究中3种植物的PLFA图谱组成各不相同，红豆杉与云杉磷酸脂肪酸种类数目相似，而日本落叶松明显减少，同时日本落叶松根际微生物群落组成也发生了明显变化，多样性降低，且cy17:0、i17:0、i15:0等几种脂肪酸变化明显。

与土著种不同，进入新环境的外来种具有比土著种更强的竞争力，赵溪竹等将长白落叶松、兴安落叶松与外来种日本落叶松幼苗光合作用特性进行了比较，结果显示日本落叶松对强光利用能力最强，且不易发生光抑制^[19]。牛小云、陈立新等的研究表明，日本落叶松林下枯落物积累多、分解慢，加速了地力的衰退，且近熟林阶段林分郁闭度大，林下植物很难存活^[20-21]。本研究中将濒危土著种红豆杉、建群土著种云杉及外来种日本落叶松根际土壤微生物群落结构组成进行分析对比发现，日本落叶松根际土壤微生物组成发生了明显的变化，多样性降低。因此对于麦积山景区，缺乏科学依据的外来种引入及大面积日本落叶松速生林的建植是否会影响景区生物多样性的保护及珍稀植物的生存，还需更进一步的深入研究。