氮是造成环境污染和水体富营养化的重要污染物，控制含氮污水的排放越来越受到人们的重 视^[1]。异养硝化细菌在利用有机碳源进行生长的同时将含氮化合物硝化生成羟胺、亚硝酸盐、硝酸盐等产物，多数还能同时进行好氧反硝化作用，直接将硝化产物转化为含氮气体，具有经济、高效、易操作等优点^[2-3]，成为目前最有前景的脱氮方法。

已经发现的异养硝化细菌种类繁多，例如Paracoccus versutus LYM^[4]、Alcaligenes faecalis NR^[5]、Klebsiella pneumoniae CF-S9^[6]、Pseudomonas stutzeri YZN-001^[7]和Bacillus methylotrophicus L7^[8]等。但是，异养硝化细菌基质范围广泛，硝化和反硝化性能差异明显，氨氮(NH₄⁺-N)去除机理较为复杂^[5]。一种路径是NH₄⁺-N在氨单加氧酶作用下被氧化为羟胺，然后由羟胺氧化还原酶(HAO)氧化为亚硝酸盐氮(NO₂^--N)，而后NO₂^--N在亚硝酸盐还原酶(NIR)、硝酸盐还原酶(NAR)等的催化作用下还原为含氮气体^[9-11]；另一种路径是通过羟胺直接将NH₄⁺-N氧化为含氮气体^{[4, 12]}。因此，HAO、NIR、NAR是NH₄⁺-N去除过程中的3个关键酶，且两种路径之间的根本区别是HAO催化的羟胺转化途径不同，所以，在异养硝化细菌代谢过程中，HAO占据核心地位^[13-14]。HAO是周质蛋白，可以通过渗透压休克法释放。但由于超声波破碎法在实验室应用的普遍性，国内外学者对HAO提取主要采用超声波破碎法^[5-6]。目前，异养硝化细菌的相关研究多数还是集中在菌株的筛选和生物学特性上，从酶学角度研究其NH₄⁺-N去除性能的报道较少，NH₄⁺-N去除相关的关键酶的提取和酶活性研究也鲜有报道。

Acinetobacter sp. Y1是从太原焦化污水处理厂活性污泥中筛选到的一株异养硝化菌，在中国普通微生物菌种保藏中心保藏登记号为CGMCC6563。本文研究了菌株Y1的NH₄⁺-N去除性能，采用正交实验优化超声波破碎法提取粗酶的条件，SDS-PAGE分析比较渗透压休克法和超声波破碎法获得的粗酶，检测关键酶HAO、NIR、NAR的酶活性，为从酶学角度深入了解异养硝化细菌的NH₄⁺-N去除性能提供参考。

1 材料与方法 1.1 材料

菌株Acinetobacter sp. Y1与甘油混合，冷冻保存在-80 ℃。

硝化培养基(g/L)：柠檬酸钠4.902，(NH₄)₂SO₄ 0.472，NaCl 0.12，K₂HPO₄ 0.20，MgSO₄·7H₂O 0.05，MnSO₄·4H₂O 0.01，FeSO₄ 0.01，pH 7.0，C/N 14，0.1 MPa灭菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 氨氮去除: 性能：将1 mL处于对数生长期的菌株Y1接种到装有100 mL培养基的250 mL锥形瓶中。30 ℃、120 r/min摇床培养，定时取样，测定相应的菌密度(OD₆₀₀)、NH₄⁺-N、羟胺、NO₂^--N、硝酸盐氮(NO₃^--N)、总氮(TN)和COD值。结果取 3个重复实验平均值。

1.2.2 气体检测: 将1 mL处于对数生长期的菌株Y1接种到装有100 mL培养基的250 mL锥形瓶中。没有接种菌株Y1的一组作为对照。0.6 MPa下连续充纯氧5-6 min后，用橡胶塞将锥形瓶口封住，再用封口胶将瓶口密封好。30 ℃、120 r/min摇床培养，每隔6 h取样，培养至48 h。用气相色谱(SP-2100，Beifen-Ruili China)测定N₂含量。

1.2.3 超声波破碎: 将1 mL处于对数生长期的菌株Y1接种到装有100 mL培养基的250 mL锥形瓶中，30 ℃、120 r/min摇床培养16 h。将菌液4 ℃、10 000 r/min离心20 min，弃上清收集菌体。用 0.01 mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲液洗3次，重悬菌体于离心管中，用超声波细胞粉碎机破碎，工作条件按单因素和正交试验表进行。超声波破碎后，将破碎液4 ℃、14 000 r/min离心20 min，上清即为粗酶液。用考马斯亮蓝法测定粗酶液在595 nm下的吸光度，以此表征细胞破碎的效果。结果取3个重复实验平均值。

1.2.4 渗透压休克法: 将培养好的菌液4 ℃、 10 000 r/min离心20 min，弃上清收集菌体。用去离子水洗3次，重悬菌体于含0.5 mol/L蔗糖和 1.3 mmol/L EDTA二钠盐的Tris-HCl缓冲液 (20 mmol/L，pH 8.0)中，室温下轻轻振荡15 min后4 ℃、10 000 r/min离心20 min，弃上清；将菌体重悬于Tris-HCl缓冲液(20 mmol/L，pH 8.0)，室温下轻轻振荡15 min，4 ℃、14 000 r/min离心20 min取上清。

1.2.5 HAO、NIR、NAR酶活性测试: HAO测定的体系包括0.050 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4)，0.001 mmol/L K₃[Fe(CN)₆]，0.004 mmol/L EDTA，酶液，加入羟胺开始反应，30 ℃孵育15 min，根据反应体系中羟胺的减少量测定HAO的活性^[15]。NIR、NAR酶测定体系包括10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)，0.200 mmol/L NADH，酶液，分别加入亚硝酸钠、硝酸钠开始反应，30 ℃孵育15 min，根据反应前后亚硝酸钠、硝酸钠的减少量分别测定NIR、NAR的活性^[16]。 蛋白浓度的测定用Bradford Protein Assay Kit (Sangon，China)。一个酶活单位(U)定义为每分钟催化1 μmol反应物所需的酶量。酶比活力(U/mg)定义为每毫克蛋白所具有的酶活力单位。

1.2.6 分析方法: 菌密度(OD₆₀₀)采用可见分光光度计测定；氨氮采用纳氏试剂光度法；羟胺用8-羟基喹啉光度法；亚硝酸盐氮采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法；硝氮采用酚二磺酸光度法；总氮采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法；COD采用消解比色法；粗酶溶出量采用考马斯亮蓝染色法；N₂由气相色谱测定^[17-18]。 2 结果与讨论 2.1 菌株的氨氮去除性能

如图 1所示，菌株Y1生长的迟缓期较短，4 h后进入对数生长期，4-12 h时生长速度最快，最大生长速率(μ_max)达到0.11 h^-1，24 h时基本进入稳定期，OD₆₀₀可达1.280。12 h时，97%的NH₄⁺-N被去除，相应的硝化速率达到7.83 mg/(L·h)，24 h时，NH₄⁺-N降解率达到98%以上。Acinetobacter sp. HA2^[19]、Klebsiella pneumoniae CF-S9^[6]、Rhodococcus sp. CPZ24^[20]的硝化速率分别为3.03、4.3、3.4 mg/(L·h)，均低于菌株Y1的降解速率。定性实验检测到NH₄⁺-N去除过程中有N₂产生，36 h时达到稳定值，约为53.74%。硝化过程中，培养基中羟胺、NO₂^--N、NO₃^--N都没有积累，可能是NH₄⁺-N去除过程中没有生成这3种中间代谢物，也可能是生成后在HAO、NIR和NAR的催化作用下迅速进入下一步转化。

如图 1、2所示，在菌株Y1的作用下，TN、COD快速降低，24 h时，TN、COD的降解率分别达到94%、92%。证明菌株Y1不仅具有良好的NH₄⁺-N、TN去除性能，也能高效分解有机物，可以充分地利用有机碳源生长并合成生命体，具有异养微生物的特性。相比之下，Bacillus sp. LY和Brevibacillus sp. LY对TN的降解率分别为69.12%和35.16%，对COD的降解率分别为71.7%和52.16%^[21]，远低于菌株Y1的性能。

2.2 关键酶的提取

2.2.1 超声波破碎法提取粗酶条件优化: 为了研究HAO、NIR和NAR的酶活性，需要进行关键酶的提取。超声波破碎法提取粗酶在实验室规模应用普遍，但由于超声对细菌有热效应、空化效应、机械效应，应首先考察影响粗酶溶出量的因素(主要有破碎功率、工作与间歇时间、OD₆₀₀、总工作时间)，并采用正交实验进行优化，确定超声波破碎的最佳工作条件。 图 3反映了超声波破碎功率、工作与间歇时间、OD₆₀₀、总工作时间对A₅₉₅的影响。A₅₉₅随着超声波破碎功率呈现先增加后减少的趋势，50 W时，A₅₉₅达到最大值，进一步提高功率，A₅₉₅随之减小(图 3A)。这是由于超声波功率增大，细胞壁的网状结构容易被破碎为较小的碎片，但功率过大时，溶出蛋白易断裂^[22]。根据经验及参考文献^[22]，固定超声的间歇时间为7 s，工作时间为4 s时，空化效应产生的气泡能有足够时间爆炸，A₅₉₅达到最大，工作时间超过4 s后，产生的热量不能及时扩散会导致蛋白质变性(图 3B)。OD₆₀₀增加，总的蛋白含量增大，但OD₆₀₀超过1.250后，菌液粘度相对升高，菌体接触空化气泡的机会减少，导致破碎效率降低，粗酶溶出量随之减少(图 3C)。同时，延长破碎时间，细菌破碎更完全，粗酶溶出量增加(图 3D)，总工作时间超过20 min，热效应增强，空化效应也会产生高温高压，导致部分蛋白变性^[23]。 采用L₉(3⁴)正交实验，结合单因素实验结果，对粗酶提取条件进行优化。各因素所选参数如表 1所示，正交实验结果如表 2所示。由正交实验R值分析可知，各因素对粗酶溶出量影响的重要程度依次为C>D>A>B，即菌液密度对粗酶溶出量影响最大，然后是总工作时间、超声波破碎功率，工作与间歇时间影响最小。由T值分析可知，最佳参数组合为C₂D₂A₂B₂，即菌液密度1.250，总工作时间 20 min，超声波破碎功率50 W，工作与间歇时间分别为4 s和7 s。

2.2.2 渗透压休克法与超声波破碎法提取粗酶的SDS-PAGE分析比较: HAO是周质蛋白，可以通过渗透压休克法释放。但由于超声波破碎法在实验室应用的普遍性，国内外学者对HAO提取主要采用超声波破碎法^{[5-6, 24]}。将超声波破碎法和渗透压休克法获得HAO进行SDS-PAGE分析，结果如图 4所示，超声波破碎法得到的粗酶液蛋白条带较多、含量高，渗透压休克法得到的粗酶液蛋白条带少、含量也较低。原因是超声波破碎会使细胞壁、细胞膜破裂，细胞内容物完全释放，而渗透压休克法是使细菌的质壁分离，细菌外膜破裂，释放周质蛋白。基于这些优点，渗透压休克法提取周质蛋白得到了更多学者的关注^{[14, 25-27]}。但要确定渗透压休克法是否比超声波破碎法更适合提取周质蛋白HAO，仍需通过酶活实验确定。 2.3 HAO、NIR、NAR酶活性测试

根据正交实验得出的最佳工作条件对菌株Y1进行超声波破碎获得粗酶液，检测关键酶HAO、NIR和NAR酶活性，结果如表 3所示。菌株Y1的HAO酶活力为0.033 U/mL，比活力为0.011 U/mg。本实验与其他文献中报道的HAO比活力具有相当的可比性，Alcaligenes faecalis NR^[5]、Acinetobacter calcoaceticusHNR^[24]、Klebsiella pneumoniae CF-S9^[6]的HAO酶比活力与菌株Y1为一个数量级，分别为0.016、0.051和0.011 U/mg。而Agrobacteriumsp. LAD9、Achromobactersp. GAD3、Comamonas sp. GAD4的HAO相对酶活力仅为0.94×10^-4、0.31×10^-4和0.178×10^-3 U/mg^[28]。渗透压休克法得到的HAO酶活力为0.212 U/mL，比活力为0.067 U/mg，均高于超声波破碎法得到的HAO。因此渗透压休克法比超声波破碎法得到的粗酶液中HAO酶含量高，杂蛋白含量低，更有利于HAO的提取和进一步的分离纯化。

NIR、NAR的酶活力和比活力分别为0.006、 0.054 U/mL和0.002、0.018 U/mg。Klebsiella pneumoniae CF-S9^[6]的NIR、NAR比活力分别为0.018、0.007 U/mg。Providencia rettgeri YL^[14]的NIR、NAR比活力分别为0.041、0.031 U/mg。

酶活性测试结果显示，在NH₄⁺-N去除过程中，HAO、NIR、NAR都有一定量的表达。即NH₄⁺-N去除过程中的代谢产物(羟胺、NO₂^--N、NO₃^--N)在HAO、NIR、NAR的催化作用下得到进一步转化。HAO酶活性较高，但NO₂^--N在培养基中没有积累，可能是有一部分羟胺在HAO作用下直接还原为N₂^[4]。

3 结论

(1) Acinetobacter sp. Y1在柠檬酸钠为碳源、硫酸铵为氮源的条件下生长24 h，OD₆₀₀可达1.280，对氨氮、总氮、COD的降解率分别高达98%、94%、92%，硝化过程羟胺、NO₂^--N、NO₃^--N不积累，反硝化产生N₂。

(2) 超声波破碎法对HAO、NIR、NAR进行粗酶提取的最佳工作条件为：OD₆₀₀=1.250，总工作时间20 min，破碎功率50 W，工作与间歇时间分别为4 s和7 s。

(3) 超声波破碎法得到的HAO、NIR、NAR的比活力分别为0.011、0.002、0.018 U/mg。渗透压休克法得到的HAO比活力为0.067 U/mg，更适合用来提取HAO。