微生物学通报  2016, Vol. 43 Issue (8): 1795−1799

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曹龙古, 蔡恒玲, 欧阳丹明, 陈苏芳, 吴移谋, 曾铁兵
CAO Long-Gu, CAI Heng-Ling, OUYANG Dan-Ming, CHEN Su-Fang, WU Yi-Mou, ZENG Tie-Bing
梅毒螺旋体Tp92蛋白B细胞表位的预测与鉴定
Prediction and identification of B-cell epitopes of outer membrane protein Tp92 on Treponema pallidum
微生物学通报, 2016, 43(8): 1795-1799
Microbiology China, 2016, 43(8): 1795-1799
DOI: 10.13344/j.microbiol.china.150624

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收稿日期: 2015-08-18
接受日期: 2015-11-20
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曹龙古, 蔡恒玲, 欧阳丹明, 陈苏芳, 吴移谋, 曾铁兵. 梅毒螺旋体Tp92蛋白B细胞表位的预测与鉴定[J]. 微生物学通报, 2016, 43(8): 1795-1799.
CAO Long-Gu, CAI Heng-Ling, OUYANG Dan-Ming, CHEN Su-Fang, WU Yi-Mou, ZENG Tie-Bing. Prediction and identification of B-cell epitopes of outer membrane protein Tp92 on Treponema pallidum[J]. Microbiology China, 2016, 43(8): 1795-1799.
梅毒螺旋体Tp92蛋白B细胞表位的预测与鉴定
曹龙古1,2, 蔡恒玲1, 欧阳丹明2, 陈苏芳2, 吴移谋1, 曾铁兵1     
1. 南华大学医学院病原生物学研究所    湖南 衡阳    421001 ;
2. 湘南学院预防医学与医学检验系    湖南 郴州    423000
收稿日期: 2015-08-18; 接受日期: 2015-11-20
基金项目: 国家自然科学基金项目(No. 81273322)；湖南省教育厅资助科研项目(No. 13C876)；郴州市科技局资助科研项目(No. 2012CJ126)
*通讯作者: 曾铁兵, Tel：86-734-8282907；E-mail:nhdxztb@126.com
摘要： 【目的】 预测和鉴定梅毒螺旋体(Tp) Tp92蛋白的B细胞表位，为深入探讨这些表位在梅毒表位疫苗中的作用奠定基础。 【方法】 采用Mobyle、ABCpred和IEDB在线软件综合分析预测Tp92蛋白的B细胞表位，人工合成6条表位多肽，以梅毒患者/感染兔血清(同时设健康人/兔血清对照)为标本，用间接ELISA法鉴定预测Tp92蛋白B细胞表位的免疫反应性。 【结果】 软件预测显示，Tp92蛋白的P1 (24-39AA)、P2 (332-347AA)、P3 (520-536AA)、P4 (575-588AA)、P5 (103-118AA)、P6 (694-712AA)氨基酸序列可能为其B细胞表位。间接ELISA分析表明，预测的P1、P3、P5和P6均与梅毒患者/感染兔血清呈阳性反应，而与健康人/兔血清不反应。 【结论】 本研究初步得出以下结论：P1、P3、P5和P6均为Tp92蛋白潜在的特异性B细胞表位，尤其是P3和P6免疫反应性最强。
关键词： 梅毒螺旋体     Tp92     B细胞表位    
Prediction and identification of B-cell epitopes of outer membrane protein Tp92 on Treponema pallidum
CAO Long-Gu1,2, CAI Heng-Ling1, OUYANG Dan-Ming2, CHEN Su-Fang2, WU Yi-Mou1, ZENG Tie-Bing1     
1. Institution of Pathogenic Biology, Medical College, University of South China, Hengyang, Hunan 421001, China ;
2. Department of Preventive Medicine and Medical Examination, Xiangnan University, Chenzhou, Hunan 423000, China
Received: August 18, 2015; Accepted: November 20, 2015;
Foundation item: National Natural Science Foundation of China (No. 81273322); Scientific Research Fund of Hunan Provincial Education Department (No. 13C876); Chenzhou Municipal Science and Technology Bureau (No. 2012CJ126)
*Corresponding author: ZENG Tie-Bing, Tel: 86-734-8282907; E-mail:nhdxztb@126.com.
Abstract: [Objective] To predict and identify the B-cell epitopes of outer membrane protein Tp92 on Treponema pallidum and provide the basis for further discussion on effects of these epitopes for the epitope-based syphilis vaccine. [Methods] The B-cell epitopes of the protein Tp92 was analyzed with comprehensive meta-analysis Mobyle, ABCpred and IEDB online softwares, and the six peptides containing predicted epitopes were artificially synthesized. The sera from syphilis patients and Tp92-immunized rabbits (normal human and normal rabbits as negative control) were used to determine the immunoreactivity and specificity of six predicted peptides of Tp92 by indirect ELISA. [Results] Comprehensive meta-analysis of online softwares showed that P1 (24-39AA), P2 (332-347AA), P3 (520-536AA), P4 (575-588AA), P5 (103-118AA), and P6 (694-712AA) might be the B-cell epitopes. The result of indirect ELISA indicated that P1、P3、P5 and P6 were active with syphilis patient sera and Tp92-immunized rabbit sera but not with negative control sera. [Conclusion] These results indicate that P1、P3、P5 and P6 are the potential specific B-cell epitopes, and immunoreactivities of P3 and P6 are the strongest especially.
Key words: Treponema pallidum     Tp92     B-cell epitope    

梅毒是由梅毒螺旋体(Treponema pallidum，Tp)引起的一种严重危害成人和新生儿健康的性传播疾病(STD)，并可明显促进艾滋病传播[1]。近年来我国梅毒发病呈迅速上升趋势[2]。应用疫苗是梅毒防控的根本措施[3-4]，但至今未获成功。

目前认为，梅毒疫苗分子主要存在于Tp的外膜蛋白(OMPs)中[3-4]。迄今为止最有可能位于Tp表面的外膜蛋白是Tp92[5]。Tp自然感染和以重组的Tp92部分片段均能诱生新西兰兔高水平的抗Tp92的调理性抗体，促进巨噬细胞吞噬Tp[6]，动物实验表明明显抗Tp攻击感染[6]。最新的研究表明，Tp92核酸疫苗能诱导兔强烈的体液和细胞免疫应答水平，获得较高的免疫保护性[7]，进一步证实该蛋白是潜在的候选疫苗分子，而且Tp92在不同的临床株间高度保守，成为最具希望的候选疫苗分子之一[4]。

联合多个具有保护作用的抗原分子是研发梅毒高效疫苗的趋势[3-4]，但在同一载体上串联多个抗原编码基因技术上存在困难，并可能引起转录干扰[8]。多价表位疫苗能克服该困扰，同时去除了蛋白分子中可能的无关干扰甚至抑制表位，且可避免免疫耐受，此外还具有保护范围广、针对性强、稳定、高效、制备简单、经济安全等优点，具有广阔的应用前景[9]。本研究对Tp92蛋白保守区的B细胞表位进行筛选和鉴定，为发展梅毒多价表位疫苗奠定基础。

1 材料与方法 1.1 实验材料

Tp(Nichols株)为上海皮肤性病医院检验科顾伟鸣馈赠，本研究所传代保存；羊抗兔HRP-IgG、羊抗人HRP-IgG购自北京康为世纪有限公司；梅毒螺旋体抗体明胶颗粒凝集试验(TPPA)试剂盒购自日本富士瑞必欧株式会社；96孔高结合力酶标板为美国Corning公司产品；确诊梅毒患者阳性血清、健康人血清标本分别来自南华大学附属第一医院检验科和健康体检中心；梅毒感染兔阳性血清、健康兔血清标本均来自南华大学实验动物中心并经TPPA确诊。

1.2 Tp92蛋白B细胞表位的在线软件预测、合成与纯化

获取TP92氨基酸序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AAF61467.1)，将去除信号肽后的保守区氨基酸序列(Tp92全长第22−837位)输入在线Mobyle软件(http://mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py?#forms::antigenic)和ABCpred软件(http://www.imtech.res.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html)，结果按分值高低大小依次显示；应用在线预测软件IEDB (http://www.immuneepitope.org/tools/bcell/iedb_input)综合分析Tp92氨基酸序列表面可及性、亲水性、抗原性、β拐角区域以及易屈性等理化因素；综合以上3种软件预测结果预测Tp92蛋白的B细胞表位。表位多肽的合成和纯化委托北京泽溪源生物科技有限公司进行；Delta 600型HPLC进行纯化和纯度分析；质谱仪测定纯化多肽的分子量；多肽纯品分装于−20°C储存备用。

1.3 Tp92蛋白预测B细胞表位的鉴定

分别将10 mg/L合成的B表位多肽作为抗原包被在酶标板上(100μL/孔)，以l׃100稀释血清(梅毒病人/感染兔血清各10份、健康人/兔血清各10份)为一抗，同时设空白对照孔，每个样品做3个平行孔，1:10 000稀释的羊抗兔或羊抗人IgG-HRP进行间接ELISA，酶标仪测定各孔OD值(双波长450nm/630 nm)，样品结果以3个平行孔OD值均值表示。实验重复3次。

1.4 SPSS软件统计分析

每组标本取均值，各组间进行t检验。P < 0.05代表有统计学意义。待测标本OD值/阴性对照OD值 > 2.1为阳性。

2 结果与分析 2.1 Tp92蛋白B细胞表位在线软件预测与合成

综合IEDB、ABCpred和Mobyle在线软件，预测出如下6段氨基酸序列有可能为Tp92蛋白的B细胞表位：P1 (24-39 aa)、P2 (332-347 aa)、P3 (520-536 aa)、P4 (575-588 aa)、P5 (103-118 aa)、P6 (694-712 aa) (表 1)。合成多肽纯度均大于90%，质谱分析合成多肽分子量测定值与理论值一致，表明所合成的多肽符合要求。

表 1　预测的Tp92蛋白的B细胞表位 Table 1　The predicted B-cell epitopes of Tp92
No. Amino acid sequence of peptide Amino acid location
P1 NDNWYEGKPISAISFE 24−39
P2 LNKEEHRDTAEKTLSF 332−347
P3 NGLPHPYTSREQWASSP 520−536
P4 DFRVVKNFYDKDNN 575−588
P5 KERPSVKGIKMVGNSQ 103−118
P6 GKGNGVRSGALVIDGVLVG 694−712
表选项
2.2 Tp92蛋白预测B细胞表位对人的免疫反应性

间接ELISA结果显示，P1、P3、P5和P6表位多肽与梅毒患者阳性血清反应的OD值与健康人对照组之比均大于2.1，差异均有统计学意义(P < 0.01)(表 2)，表明预测的P1、P3、P5和P6表位多肽为Tp92蛋白的优势B细胞表位。

表 2　ELISA检测TP92预测表位多肽与人血清免疫反应性 Table 2　Immunoreactivity of predicted Tp92 epitopes with human sera by ELISA (OD450/OD630)
组别Group n P1 P2 P3 P4 P5 P6
梅毒患者
Syphilitic		 10 0.622±0.067 0.699±0.099 1.407±0.235 0.891±0.104 0.539±0.126 1.549±0.185
健康人
Healthy people		 10 0.045±0.012 0.646±0.084 0.039±0.011 0.912±0.098 0.033±0.007 0.039±0.009
t 26.578 1.292 18.339 −0.465 12.648 25.693
P < 0.01 > 0.05 < 0.01 > 0.05 < 0.01 < 0.01
表选项
2.3 Tp92蛋白预测B细胞表位对兔的免疫反应性

间接ELISA结果(表 3)显示，P1、P3、P5和P6表位多肽与梅毒感染兔阳性血清反应的OD值与健康兔对照组之比均大于2.1，差异均有统计学意义(P < 0.01)，进一步表明预测的P1、P3、P5和P6表位多肽为Tp92蛋白的优势B细胞表位。

表 3　ELISA检测TP92预测表位多肽与兔血清免疫反应性 Table 3　Immunoreactivity of predicted Tp92 epitopes with rabbit sera by ELISA (OD450/OD630)
组别Group n P1 P2 P3 P4 P5 P6
感染兔
Infected rabbits		 10 0.716±0.145 0.745±0.114 1.151±0.200 0.644±0.072 0.525±0.100 1.385±0.210
健康兔
Healthy rabbit		 10 0.057±0.015 0.694±0.093 0.043±0.012 0.676±0.061 0.023±0.005 0.035±0.005
t 14.318 1.109 17.416 −0.034 15.727 20.316
P < 0.01 ＞0.05 < 0.01 ＞0.05 < 0.01 < 0.01
表选项
3 讨论

疫苗的使用是预防和控制传染病发生的主要措施。各种类型疫苗均基于表位(抗原决定簇)发挥作用。B细胞表位是抗原分子中能被BCR/抗体特异性识别的基本单位。在抗Tp感染中，B细胞分泌特异性抗体介导的体液免疫应答发挥着重要作用，主要方式包括阻断Tp粘附、促进巨噬细胞的吞噬(调理作用)、激活补体溶菌作用等[3-4]。表位疫苗具有高效、安全、无毒、稳定、低成本的特点，符合未来疫苗的发展方向，尤其符合Tp这样容易通过抗原变异而免疫逃避形成慢性感染[8]的病原体。本研究预测鉴定Tp92蛋白的B细胞表位，为构建多价表位疫苗奠定基础。

传统筛选鉴定表位的方法主要有合成重叠肽法[10]、噬菌体肽库展示法[11]、水解法[12]、生物学或化学方法[13]等，其优点是能较全面筛选抗原蛋白可能表位，但工作难度大，耗时长。应用计算机软件分析筛选抗原表位，可减少盲目筛选的庞大工作量，大大提高了发现新表位的效率[14]。目前几乎所有B细胞表位预测软件均以唯象理论为基础，即通过计算蛋白亚序列二级结构或者理化性质，再利用B细胞表位与其相关性来预测。为提高预测的准确性，通常需综合多种方案来分析[15]，本文运用IEDB在线软件中提供多种方案分析亲水性、抗原性、易屈性、表面可及性与β-转角，再结合ABCpred和Mobyle在线软件总结得出6条Tp92蛋白最有可能的B细胞表位多肽。由于在线软件均基于现有的表位数据模拟和推测待预测氨基酸序列，存在一定风险和偏差，需鉴定所预测的表位。

鉴定B细胞表位的常用方法为ELISA和免疫印迹法。由于人工合成的表位多肽较短，一般只有十几个氨基酸，无法采用免疫印迹法进行鉴定。人/兔感染Tp后，外膜蛋白Tp92会刺激机体产生针对该蛋白各种表位的抗体或致敏的T淋巴细胞，因免疫反应的特异性，产生的抗体应该能够与其所对应的B细胞表位特异结合。本研究中应用间接ELISA对软件预测的B细胞表位进行鉴定。结果显示，以梅毒患者阳性血清为已知抗体，可与P1、P3、P5和P6合成表位多肽发生阳性反应，而与健康人血清不反应；同时，进一步以梅毒感染兔阳性血清为已知抗体，同样可与P1、P3、P5和P6合成表位多肽发生阳性反应，而与健康兔血清不反应。结果表明，预测P1、P3、P5和P6合成表位多肽与人源及兔源性梅毒阳性血清均具有良好的免疫反应性，为Tp92蛋白潜在的B细胞表位，尤其是P3和P6免疫反应性极强，极可能是Tp92蛋白的优势B细胞表位，可作为梅毒多价表位疫苗优先考虑的疫苗分子。

本研究首次筛选出Tp92的优势B细胞表位，为进一步构建多表位梅毒疫苗奠定了基础，但其是否具有免疫保护性、通过何种方式发挥抗Tp感染作用以及表位多肽突变检验等方面有待深入研究。

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