随着人们环保意识的不断增强，生物农药越来越多应用于植物病害的防治。其中，芽孢杆菌以其对环境的高度耐受性和具有产生各种多肽类、脂肽类和细菌素等抑菌性物质的特点成为当前生物农药的研究热点。解淀粉芽孢杆菌次生代谢产物有抗菌性脂肽、蛋白或多肽等，不仅可抑制多种植物病原性真菌，而且可促进植物生长和诱导植物抗病性。特别是一些由非核糖体多肽合成酶途径合成的脂肽，主要包括IturinA、Fengycin和Surfactin^[1]等，由于其两亲分子的结构特点和非特异性的作用模式使其能够广泛作用于多种病原菌，因此作为新一代抗生素受到关注^[2-3]。如何将这些活性物质分离纯化并制成新型、高效的生物农药，是当前研究的工作重点。

近年来，随着基因组测序工作的全面推进，枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等菌株的基因组已测序完成，为利用PCR技术快速检测同类菌株的抗生素合成基因创造了条件。由扩展青霉(Penicillium expansum)^[4]感染苹果所致的青霉病是苹果采摘后导致果实腐烂的重要病害之一，针对该病原菌，本实验室从苹果表面分离出一株可有效抑制苹果青霉病的生防菌BA-16，结合该菌株的形态、生理生化和分子系统发育等特征对其进行鉴定。为确定该菌株所产的脂肽类型及含量，先利用NCBI上已知的脂肽抗生素(Surfactin inturinA fengycin)合成基因(sfp，fenB，ituD)设计引物，以菌株BA-16的基因组DNA为模板，采用PCR技术进行脂肽抗生素合成酶的相关基因检测，然后利用脂肽提取方法制备出粗提物，并采用HPLC和MALDI-TOF-MS对粗提物中的脂肽进行纯化和鉴定，以确定脂肽类型，本研究为认识解淀粉芽孢杆菌所产的脂肽类抗生素及将其应用于苹果采后的生物防治提供理论基础。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 菌种、供试苹果和培养基: 致病菌扩展青霉(Penicillium expansum)由陕西省微生物研究所惠赠；供试苹果为红富士(Red Fuji)，由陕西洛川县渭北苹果种植园惠赠。YEB培养基和PDA培养基配方参见文献[5]；摇瓶发酵培养基配方参见文献[6]。

1.1.2 主要试剂和仪器: Fengycin和Surfactin标准品购于sigma公司；乙腈、三氟乙酸、甲醇等皆为色谱纯，购自Sigma公司。Agilnt 1100series高效液相色谱系统购自美国安捷伦公司；液相色谱-电喷雾质谱仪(LC-ESI MS)由Waters Alliance2690高效液相色谱仪(美国Waters公司)和TSQ Quantum Discovery三级四极杆质谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)组成。 1.2 细菌的分离、筛选

从感染青霉病苹果的表面分离菌株。用无菌水清洗苹果健康部位，将所得液体经10⁻¹−10⁻⁶的梯度稀释，将10⁻⁴、10⁻⁵、10⁻⁶梯度稀释液分别涂布在YEB平板上，37℃培养24 h。挑取各平板上的菌株分别进行纯化得到单克隆，将其分别编号以做进一步研究。

以扩展青霉为指示菌，用平板对峙法^[7]对分离菌株进行拮抗能力的筛选。病原菌接种于PDA平板中央，待测菌株接种于离指示菌2.5 cm处，28℃培养48 h观察其生长状况，测量抑菌带宽度，实验均重复3次，挑取抑菌条带宽的菌株至YEB平板上，保存备用。

将初筛所得菌株接种于发酵培养基中，37℃、150 r/min振荡培养72 h。参照Pathak等的方法^[8]制备菌株无细胞发酵液，取所制的发酵液200μL接入牛津杯中，采用牛津杯法^[9]检测菌株无细胞发酵液拮抗扩展青霉的能力。28℃培养24 h后测量抑菌圈直径，挑选直径最大的菌株做进一步研究。整个实验以无菌水作为对照，实验均重复3次。

1.3 菌株的形态学与生理生化鉴定

将复筛所选菌株经染色、光学显微镜观察菌体个体及群体形态，生理生化反应参照《微生物学实验指导》^[10-11]。

1.4 16S rRNA基因序列分析

使用上海生工有限公司的细菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取所筛菌株的基因组DNA，以其为模板，参考文献[12]进行16S rRNA基因的PCR扩增，扩增引物见表 1。PCR反应体系(25μL)：50 mg/L模板1μL，10μmol/L上下游引物各0.5μL，Pfu PCR MasterMix 12.5μL，双蒸水10.5μL。反应条件：94℃3 min；94℃1 min，55℃1 min，72℃2 min，30个循环；72℃10 min。目的片段经Sanprep柱式PCR试剂盒(上海生工生物工程有限公司)纯化后，提交至上海生工进行序列测定。用BLAST程序将所得序列结果与GenBank相关菌种的16S rRNA基因序列进行比对分析，利用MEGA 4.1构建系统发育树^[13]。

1.5 脂肽类抗生素合成酶相关基因的克隆

1.5.1 引物设计: 以菌株的基因组DNA为模板进行PCR，扩增引物见表 1，PCR反应体系(25μL)：50 mg/L模板1μL，10μmol/L上下游引物各0.5μL，Pfu PCR MasterMix 12.5μL，双蒸水10.5μL。反应条件如下： 扩增sfp的条件：94℃5 min；94℃1 min，48℃30 s，72℃1 min，30个循环；72℃10 min。 扩增fenB的条件：94℃5 min；94℃1 min，55℃30 s，72℃2 min，30个循环；72℃10 min。 扩增ItuD的条件：94℃5 min；94℃1 min，58℃30 s，72℃2 min，30个循环；72℃10 min。 所得PCR目的条带经Sanprep柱式PCR试剂盒(上海生工生物工程有限公司)纯化。

1.5.2 克隆测序: 将PCR产物回收连接到克隆载体pGM-T上，转化E. coli J108，蓝白斑筛选挑取阳性克隆，将之提交至上海生工测序。

1.5.3 序列分析: 所得序列提交至NCBI并采用BLAST与GenBank的数据进行同源性分析。 1.6 菌株BA-16代谢产物粗提液制备

将培养24 h的菌株发酵液于常温下8 000 r/min离心20 min，弃沉淀，将所得上清液置于无菌锥形瓶中，用浓度为7 mol/L的HCl将其pH调整至2.0，无菌条件下分装至10 mL的无菌离心管中(每管10 mL)，4℃过夜，10 000 r/min离心20 min，取沉淀，在沉淀中加入0.5 mL的中性甲醇溶液，以此方法操作2次，将所得萃取液合并，并将其浓缩至5倍浓度，经0.2μm滤膜过滤后即为粗提液。

1.7 脂肽类抗生素的分离、纯化和鉴定

1.7.1 HPLC分离纯化脂肽类抗生素: 采用的HPLC分析系统为Agilent HPLC 1200series，色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈；检测波长为280 nm，柱温为30℃，进样量10μL，采用等梯度洗脱进行样品分析，洗脱条件如表 2所示。

1.7.2 抗菌性脂肽拮抗扩展青霉活性检测: 扩展青霉转接至PDA平板上，30℃培养3 d，用规格为6 mm的打孔器在病原菌菌丝上打孔，得到直径为6 mm的菌饼，将其接种于PDA平板中央，距菌饼3 cm处放置牛津杯，牛津杯中加入10μL经HPLC分离纯化得到的抗菌脂肽，以中性甲醇为对照，30℃培养5 d，观察抑菌圈形成情况。

1.7.3 MALD-TOF-MS鉴定: 质谱鉴定所用质谱仪为Voyager DE-STR MALDI TOF/TOF串联飞行时间质谱，采用正离子模式，扫描范围100−2 000 m/z，毛细管电压为3.5 kV，离子源加速电压为20 kV，激光波长337 nm，激光频率200 Hz。 2 结果与分析 2.1 扩展青霉拮抗菌株的分离和筛选

经过初筛从苹果表面分离获得18株菌，其中酵母4株，细菌14株。通过平板对峙实验，筛选出可拮抗扩展青霉的6株。采用牛津杯法检测6株菌的无细胞发酵液抗扩展青霉活性，结果如表 3所示。结果表明：6株菌的菌株细胞和无细胞发酵液拮抗扩展青霉的效果表现出了显著的差异。其中，BA-16的拮抗效果最强，因此将其挑选出来做后续研究。

2.2 扩展青霉拮抗菌株的形态学与生理生化鉴定

菌株BA-16经革兰氏染色阳性，显微镜镜检为杆菌，有芽孢，有荚膜，具有运动性。该菌株在LB平板上形成乳白色菌落。菌落边缘不整齐，干燥不透明，中间有突起。生理生化结果见表 4。

结合菌株BA-16的形态、染色及生理生化特征，将该菌株初步鉴定为Bacillus sp.。

2.3 16S rRNA基因序列分析

提取菌株BA-16的总DNA进行PCR扩增，凝胶电泳回收扩增序列，得到一段1 468 bp长度的16S rRNA基因，所获序列提交至GenBank (登录号KR31430)。将其同GenBank中相近种属进行BLAST，对BLAST结果进行分析，通过MEGA 4.1软件构建系统发育树(图 1)。发现菌株BA-16与Bacillus amyloliquefaciens AY603658的相似性达到99%，综合形态学特征及生理生化鉴定结果，BA-16被鉴定为Bacillus amyloliquefaciens。

2.4 脂肽类抗生素合成相关基因序列分析

以所筛菌株BA-16的基因组DNA为模板进行PCR扩增，发现可得到两条大约为675 bp和1 400 bp的目的条带(图 2)，初步确认为sfp基因和fenB基因，将PCR产物纯化测序后提交至NCBI进行相关序列的BLAST同源性分析，结果显示与GenBank公布的相关基因相似性高达99%，可确定菌株BA-16具有sfp和fenB基因，因此推测该菌株可产生Fengycin和Surfactin两种脂肽类抗生素。

2.5 HPLC分析

粗提液经HPLC分离纯化后，所得片段如图 3、4所示，发现Surfactin标样在保留时间13.683、15.776、17.741和21.363 min处出现了特征峰(图 3A)。同一洗脱条件下，所测样品其Surfactin特征峰出现在13.690 min和17.781 min (图 3B)，保留时间在标准峰附近，推测是Surfactin的同系物；Fengycin标样在保留时间20.717 min，33.665 min和41.260 min处出现了特征峰(图 4A)；同一洗脱条件下，所测样品其Fengycin的特征峰出现在20.767 min和40.880 min (图 4B)，这些峰也在标准峰附近，说明粗提液中也含有Fengycin。

2.6 HPLC分离纯化蛋白抗扩展青霉效果评价

将HPLC纯化得到的Surfactin和Fengycin分别采用牛津杯方法^[9]检测其对扩展青霉的抑制效果，所得结果如表 5所示，Fengycin对扩展青霉展现了明显的抑菌效果，与之相反的是，Surfactin对扩展青霉几乎无抑制作用，推测在解淀粉芽孢杆菌抑制扩展青霉的过程中起主要作用的是脂肽类蛋白Fengycin。

2.7 MALD-TOF-MS鉴定

经飞行时间质谱检测分析，获得了粗提液中各脂肽产物同系物的分子量，所得结果如表 6所示。质谱图显示出2个系列的离子峰(图 5)，图 5a显示了Surfactin家族同系物，其[M+H]⁺、[M+Na]⁺和[M+K]⁺离子如表 6所示，所得Surfactin分别为C13-Surfactin和C15-Surfactin，且第7位氨基酸为Leu；图 5b显示了Fengycin家族同系物，其[M+H]⁺、[M+Na]⁺和[M+K]⁺离子如表 6所示，所得Fengycin分别为C14-FengycinA、C15-FengycinA、C16-FengycinA和C17-FengycinA，这些Fengycin其第6位氨基酸为丙氨酸，C16-FengycinB和C17-FengycinB这些Fengycin其第6位氨基酸为缬氨酸。结合PCR检测结果、HPLC和质谱检测，所得发酵液抗菌性脂肽提取物中含有Fengycin和Surfactin。

3 讨论

由于传统农药的广泛应用，不仅污染环境和损害人类身体健康，而且还容易使许多病原菌产生抗药性。抗菌脂肽作为生物农药，不仅没有二次污染，其非特异性的抗菌机制也可避免病菌抗药性的产生，在植物的病害防治中展现了巨大优势^[14-16]。

本研究筛选出可有效拮抗扩展青霉的菌株BA-16，该菌株被鉴定为解淀粉芽孢杆菌。在此基础上进行了抗菌物质的分离、鉴定和抑菌机制的初步探讨。以分子生物学技术为辅助手段，首先通过基因检测推测拮抗菌代谢产物中可能存在的活性物质；然后利用HPLC技术对其进行分离、纯化和抑菌性能的初步鉴定；最后通过质谱检测获得了脂肽类产物的精确分子量。综合分析基因检测、HPLC和质谱鉴定的结果^[17-18]，发现扩展青霉拮抗菌BA-16可代谢产生Surfactin和Fengycin两类脂肽类抗生素，这与关于解淀粉芽孢杆菌可以产生脂肽类抗生素的多数报道相符^[19]。

通过对比Surfactin和Fengycin两类脂肽类抗生素对扩展青霉的抑制效果，发现抑制扩展青霉活性的脂肽主要是Fengycin。Fengycin是由一条β-羟基脂肪酸链和一个10肽所形成的内酯环，它可作用于丝状真菌的磷脂双分子层，改变其细胞膜的通透性，从而显著抑制其活性^[19-21]。虽然当前鲜有针对Fengycin的抗菌机制研究，但根据报道，IturinA与Fengycin同属于脂肽类抗生素，其抑菌活性主要源于其肽环氨基酸以及脂肪酸碳链的变化，例如通过结合到病菌细胞膜上，从而改变后者的通透性；或者通过肽环上的极性氨基酸嵌合到病菌核酸分子上从而影响后者的正常表达等^[22-24]。由于Fengycin与IturinA在结构上具有很大的相似性，因此上述有关IturinA的抑菌机制为探讨Fengycin的抗菌原理提供了参考依据^[24]。根据Fengycin 6号位置氨基酸的不同将其分为FengycinA和FengycinB两种类型，本研究中通过质谱检测分析发现菌株BA-16可代谢产生多种Fengycin同系物，其类型涵盖A、B两种类型。此外，HPLC纯化物质抑菌试验结果表明，Surfactin对扩展青霉的抑制效果不明显，Fengycin可能是菌株BA-16拮抗扩展青霉的主要物质，这有待于进一步的实验研究。