大豆异黄酮(soy isoflavones)是大豆在其生长过程中形成的一类次生代谢产物，主要包括黄豆苷原(daidzein)、染料木素(Genistein)和黄豆黄素(Glycitein)。大豆异黄酮具有抗氧化^[1]、抗癌^[2-3]、预防骨质疏松^[4-5]和改变血脂水平^[6]等作用。体内外研究均表明，被机体摄入的黄豆苷原可被胃肠道微生物代谢为二氢黄豆苷原(dihydrodaidzein，DHD)、雌马酚(Equol)和去氧甲基安哥拉紫檀素(O-Desmethylangolensin，O-Dma)等多种代谢产物^[7-8]。

严格厌氧细菌AUH-JLC140 (Clostridium sp.)是本实验室从公鸡新鲜粪样中分离得到的革兰氏阳性梭菌，该菌株在厌氧条件下能将底物黄豆苷原高效转化为O-Dma^[9]。O-Dma不仅与人体雌激素受体ER_α和ER_β的亲和力高于其前体黄豆苷原，而且与ER_β结合后，在诱导基因转录方面也强于黄豆苷原^[10-11]。此外，当浓度高于10 µmol/L时，O-Dma能够明显抑制人乳腺癌细胞MCF-7的生长^[12]。

由于AUH-JLC140为严格厌氧菌株，其转接、培养以及转化过程均必需在严格厌氧条件下进行，而长期维持严格厌氧环境需要大量资金投入。为提高AUH-JLC140的耐氧能力，本实验室对其进行了耐氧驯化，并得到其耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC140^[13]。与原出发菌株AUH-JLC140相比，耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC140培养液中检测到一种未知代谢产物。本研究对该未知代谢产物进行分离纯化和结构鉴定，并测定其抗氧化能力，从微生物代谢产物方面为菌株Aeroto-AUH-JLC140的耐氧机制提供新依据。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 细菌菌株: 能将底物黄豆苷原高效转化为O-Dma的严格厌氧细菌菌株AUH-JLC140 (Clostridium sp.)^[9]以及菌株AUH-JLC140的耐氧突变菌株Aeroto-AUH-JLC140^[13]，两菌株均由本实验室保藏。

1.1.2 培养基及菌株培养条件: 严格厌氧梭菌AUH-JLC140的培养条件为：将-80℃冷冻保藏的菌株AUH-JLC140在Concept 400厌氧工作站内迅速解冻，并以10%接种量接种到盛有1 mL新鲜BHI液体培养基的带盖螺口玻璃试管中，试管盖自然拧紧后松半扣，接种后在厌氧工作站内静置培养18−24 h即为种子液。厌氧工作站内混合气体种类及配比为：5% CO₂，10% H₂和85% N₂，厌氧工作站内温度设定为37℃。耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC140的培养条件为：将−80℃冷冻保藏的菌株Aeroto-AUH-JLC140在37℃水浴下迅速解冻，在超净工作台内以10%接种量接种到盛有4 mL新鲜BHI液体培养基(培养基高度不低于4 cm)的带盖螺口玻璃试管中，试管盖自然拧紧后松半扣，将接种后的试管放在37℃普通生化培养箱内静置培养8−12 h即为种子液。

1.1.3 主要试剂和仪器: 所用培养基为脑心浸液培养基(Brain heart infusion，BHI)，美国Bacto公司；Kovac试剂(有效成分对二甲氨基苯甲醛)，南京森贝伽生物科技有限公司；乙腈、乙酸乙酯和甲醇等有机溶剂均为色谱纯，美国Fisher公司。 Concept 400厌氧工作站，英国Ruskinn公司；高效液相色谱仪，美国Waters公司；离心浓缩仪DI-VCOIO-IR，韩国Daiki公司；ESI源Finnigan LCQ Deca离子阱质谱仪，美国Thermo Finnigan公司；Bruker AVANCE 400 MHz超导核磁共振波谱仪，瑞士Bruker公司；DU-650紫外可见分光光度计，美国Beckman公司；pH211型酸度计，意大利HANNA公司；RE-2000型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂。 1.2 耐氧突变株所产未知物质的高效液相检测

在超净工作台内将Aeroto-AUH-JLC140的种子液接种在新鲜BHI液体培养基中，具体接种及培养方法同1.1.2。菌株在普通生化培养箱内静置培养12 h后，用等体积乙酸乙酯进行萃取，萃取液在离心浓缩仪内蒸干，将蒸干物重新溶解在100%甲醇溶剂中，过0.45μm有机滤膜，用高效液相色谱进行检测。检测采用C₁₈-ODS分析柱(5 µm，250 mm×4.6 mm)，流动相为乙腈和水，其中A液为90%水和10%乙腈以及0.1%冰醋酸，B液为90%乙腈和10%水以及0.1%冰醋酸，A:B为60:40，检测波长为285 nm，流速为1 mL/min。为确定未知物质产生是否与添加底物黄豆苷原有关，按上述接种条件接种后，向带盖螺口玻璃试管中加入终浓度为0.1 mmol/L的底物黄豆苷原，在普通生化培养箱内静置培养12 h后对样品进行萃取，萃取、蒸干以及高效液相检测方法同上。

为检测严格厌氧梭菌AUH-JLC140在生长过程中是否产生未知物质，按1.1.2中所述方法，在厌氧工作站内将菌株AUH-JLC140的种子液接种到新鲜BHI液体培养基中，并添加终浓度0.1 mmol/L的底物黄豆苷原，以不添加黄豆苷原的作为对照，菌株AUH-JLC140的培养、样品萃取及检测方法同上。

1.3 未知物质的分离与制备

将20 mL培养好的Aeroto-AUH-JLC140种子液接种到装有200 mL新鲜BHI液体培养基的输液瓶中，输液瓶口用铝箔纸盖好，于普通生化培养箱内37℃培养12 h。培养液用等体积乙酸乙酯萃取后用旋转蒸发仪蒸干，蒸干后样品处理方法同1.2，最后用半制备高效液相色谱对未知物质进行分离。所用色谱柱为Kromasil C₁₈ (5 µm，250 mm×10 mm)，将未知物质放置4℃保存待用。

1.4 未知物质的化学结构鉴定

1.4.1 吲哚显色反应: 取2 mL耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC140的培养液于带盖螺口玻璃试管中，向试管中加入1 mL乙醚进行萃取，静置分层后沿着试管壁缓缓加入150 µL Kovac试剂，观察颜色变化，具体方法参照文献[14]。

1.4.2 质谱检测: 将纯化后的未知物质注入ESI源质谱仪进行测定。

1.4.3 核磁共振检测: 将纯化后的未知物质进行核磁共振氢谱(¹H-NMR)和碳谱(¹³C-NMR)分析，溶剂采用CDCl₃。 1.5 吲哚产生动态

取Aeroto-AUH-JLC140的种子液400 µL接种于装有4 mL新鲜BHI液体培养基的带盖螺口玻璃试管中，于37℃普通生化培养箱中静置培养。分别在接种后3、6、9、12、15、18和21 h取样，样品的萃取及高效液相色谱检测方法同1.2，试验重复3次。分别记录不同取样时间吲哚的出峰面积，根据吲哚标准曲线绘制Aeroto-AUH-JLC140的吲哚产生动态。

1.6 吲哚抗氧化活性测定

1.6.1 DPPH自由基清除试验: 1, 1-二苯基-2-苦味酰基自由基(1, 1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH)是一种稳定的单电子自由基，在517 nm下有强的吸收。以乙醇作为溶剂，以不加吲哚的比色管为对照，用紫外可见分光光度计进行测定。具体操作按本实验室以往报道的方法进行^[15]，反应时间和温度稍有改进。具体方法为：取1 mL用乙醇溶解的样品加到比色管中，再与0.5 mL DPPH (0.4 mmol/L)混匀，在20℃黑暗环境中分别反应1、24、48和96 h，在517 nm下测定吸光度，根据对照和样品的吸光度计算清除率。清除率的计算公式为：自由基清除率(%)=(1−A_i/A_o)×100，其中A_i为将待测样品加入DPPH反应体系后测得的吸光度，A_o为不加待测样品(用100%乙醇替代样品)时DPPH反应体系本身的吸光度。所用吲哚浓度分别为0.05、0.10、0.20、0.40和0.50 mmol/L。试验至少重复3次，数据用平均值±标准误表示，统计分析用one-way ANOVA来比较。显著性以“*”(P < 0.05)或“**”(P < 0.01)表示。

1.6.2 氧化-还原电位的测定: 以盛有12 mL BHI新鲜液体培养基(培养基高度约4 cm)的带盖螺口玻璃试管(试管口直径2.5 cm)为对照，向试管中分别添加终浓度为0.1 mmol/L和0.2 mmol/L的吲哚，将螺口试管静置在37℃普通生化培养箱内，静置1、12、24和48 h后，用酸度计测定不同试管内的氧化-还原电位。 2 结果与分析 2.1 原出发菌株和耐氧突变株发酵液未知物质检测

经高效液相检测发现，不论是否添加底物黄豆苷原，在耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC140的发酵液中，均在保留时间15.8 min处检测到一未知物质峰(图 1A和B)，且图 1A和图 1B中未知物质峰的紫外吸收图谱完全一致，分别在215 nm和269 nm有最大紫外吸收(图 1C)。然而，对原出发菌株AUH-JLC140而言，不论是否添加底物黄豆苷原，在其发酵液中均未检测到未知物质峰(图 1D和E)。由于未知物质的产生与添加底物黄豆苷原无关，由此可以断定，耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC140发酵液中的未知物质为该菌株产生的次生代谢产物。

2.2 未知物质的结构鉴定

由于耐氧突变株所产未知物质的紫外吸收图谱(图 1C)与吲哚的^[16]完全吻合，因此对未知物质进行了吲哚显色反应验证。结果发现，在Aeroto-AUH-JLC140培养液萃取物中加入一定量Kovac试剂后，可明显观察到玫瑰红色，表明Aeroto-AUH-JLC140在其生长过程中可能产生了吲哚。

为确定未知物质的分子量，将分离纯化后的未知物质进行质谱分析(ESI-MS)，发现其[M-H]^-为116，因此确定Aeroto-AUH-JLC140所产未知物质的分子量应为117，这恰与吲哚(C₈H₇N)的分子量一致。为进一步准确鉴定未知物质的化学结构，将未知物质分别进行核磁共振氢谱(¹H-NMR)和碳谱(¹³C-NMR)测定，结果如图 2A (¹H-NMR)和图 2B (¹³C-NMR)所示。

未知物质核磁共振氢谱的解析结果为：¹H NMR (CDCl₃，400 MHz)：δ6.38 (1H，d，J=2.88 Hz，H-3)，6.93−6.97 (1H，t，J=7.13 Hz，H-5)，7.02−7.06 (1H，t，J=7.12 Hz，H-6)，7.10 (1H，t，J=2.88 Hz，H-2)，7.30−7.32 (1H，d，J=8.02 Hz，H-7)，7.48−7.50 (1H，d，J=7.82 Hz，H-4)，8.85 (1H，N-H)。该结果与已报道的吲哚的氢谱解析结果一致^[17]。

未知物质核磁共振碳谱的解析结果为：¹³C NMR：δ135.84 (C-9)，127.76 (C-8)，124.43 (C-2)，121.44 (C-6)，120.30 (C-4)，119.29 (C-5)，111.15 (C-7)，101.71 (C-3)。该结果与吲哚的碳骨架结构也完全相一致^[18]。

因此，根据紫外吸收图谱、颜色反应、质谱以及核磁共振氢谱和碳谱的解析结果，最终将Aeroto-AUH-JLC140产生的未知物质鉴定为吲哚。

2.3 吲哚产生动态

为了解Aeroto-AUH-JLC140在培养过程中何时开始产生吲哚及其产生量，对该耐氧突变株产吲哚的动态进行了测定，结果如图 3所示。由图 3可以看出，Aeroto-AUH-JLC140在接种后6 h开始有吲哚生成，在6 h之前检测到的少量吲哚应该为种子液中的吲哚(10%接种量)；从6−15 h吲哚生成量几乎成直线上升，到15 h吲哚生成量达到最高，为19.89 mg/L；15−21 h吲哚量急剧降低，在培养时间21 h时，吲哚量下降为8.19 mg/L。

2.4 吲哚抗氧化能力测定

2.4.1 吲哚对DPPH自由基的清除作用: 氧气本身虽然没有毒性，但进入细胞内的氧气一旦接受氧化酶(如NADPH氧化酶)传递的电子时，会产生超氧阴离子，超氧阴离子经歧化作用可产生H₂O₂等活性氧。正常条件下，细胞内产生的活性氧与其清除系统保持平衡。然而，当产生的活性氧超出活性氧清除系统的清除能力时，过量的活性氧则可对细胞造成各种损伤。Aeroto-AUH-JLC140虽能在有氧条件下生长和转化，但该突变株对氧气的耐受仍是有条件的，即接种量不能低于2.5%，同时液体培养基高度不能低于2 cm^[13]。由于吲哚为还原性物质，推测耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC140产生的吲哚可能对活性氧自由基有清除作用，进而为该菌株在有空气氧条件下的生长营造一个相对的低氧环境。 通过将不同浓度吲哚(0.05、0.10、0.20、0.40和0.50 mmol/L)与DPPH自由基共孵育，发现不同浓度吲哚均具有一定的DPPH自由基清除能力(图 4)。由图 4可以看出，相同浓度的吲哚随反应时间延长，其对DPPH自由基的清除能力也逐渐升高，这表明吲哚与多数天然产物一样，对自由基清除速度较慢，属于迟效型化合物^[15]。另外，浓度为0.2 mmol/L的吲哚即可表现出明显的DPPH自由基清除能力。在反应时间为48 h和96 h时，浓度为0.2 mmol/L的吲哚对DPPH自由基的清除率分别为14.72%和22.16%。

2.4.2 氧化-还原电位: 通过对比添加与不添加吲哚的BHI液体培养基的氧化-还原电位可以看出，添加浓度为0.1 mmol/L和0.2 mmol/L的吲哚均可有效减慢BHI液体培养基氧化-还原电位上升的速度(表 1)。由吲哚产生动态可知，Aeroto-AUH-JLC140在接种后15 h产生的吲哚量达到19.89 mg/L (即0.17 mmol/L)。因此，菌株Aeroto-AUH-JLC140产生的吲哚可有效降低BHI液体培养基的氧化-还原电位，进而为该菌株生长提供适宜的相对低氧环境。 3 讨论

有关耐氧菌的耐氧机制，目前大多认为是菌体细胞能够产生SOD和过氧化物酶(但缺乏过氧化氢酶)。本研究发现，耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC140可通过产生吲哚为菌株生长提供适宜的低氧微环境。菌株Bacillus alvei^[19]、Klebsiella oxytoca^[20]、Proteus vulgaris^[21]、Porphyromonas gingivalis^[22]、Fusobacterium nucleatum^[23]、Prevotella intermedia^[24]和Escherichia coli^[25]均产生吲哚，但不同菌株以及同一菌株在不同培养条件下产吲哚量各不相同。有研究报道，大肠杆菌MG1655在LB培养基中产吲哚量为0.5−0.6 mmol/L，当向LB培养基中添加足量色氨酸后，该菌株产吲哚量竟高达4−5 mmol/L^[25]。除大肠杆菌外，Sasaki-Imamura等还对具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)和普雷沃菌(Prevotella sp.)等无芽孢革兰氏阴性厌氧菌的吲哚产量进行了定量分析。具核梭杆菌ATCC 25586在哥伦比亚培养基中产吲哚量为0.06 mmol/L^[23]，在BHI培养基中产吲哚产量为0.22 mmol/L；普雷沃菌属菌株在BHI培养基中产吲哚量为0.05−0.10 mmol/L^[24]。本研究中的耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC140产吲哚量为0.17 mmol/L，这一吲哚产量与具核梭杆菌的相近。DPPH自由基清除试验结果表明，浓度为0.1 mmol/L和0.2 mmol/L的吲哚均能有效清除DPPH自由基。此外，通过测定培养基氧化-还原电位还发现，添加吲哚的BHI液体培养基的氧化-还原电位比不添加吲哚的上升缓慢，添加高浓度(0.2 mmol/L)吲哚的BHI液体培养基的氧化-还原电位比添加低浓度(0.1 mmol/L)的上升缓慢，说明吲哚具有一定的抗氧化活性，而有关吲哚的抗氧化能力目前尚未见报道。

长期以来，吲哚一直作为具有恶臭气味的化学排斥物为人们所认知^[26]。最新研究表明，吲哚可作为信号分子影响氨基酸代谢^[17]、生物膜形成^[23]、质粒维持^[27]、药物运输^[28]、菌株致病性^[29]及多糖产生^[30]等关键基因的表达。本实验室前期研究结果证实，当耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC140在有空气氧条件下(即普通生化培养箱中培养)生长时，在菌体外壁会形成一层以多糖为主要成分的“保护膜”结构^[13]，这层“保护膜”结构可有效阻挡培养基溶氧进入菌体进而对菌体造成伤害。有关耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC140形成的多糖“保护膜”结构是否也同样受到了吲哚的调控，尚有待进一步研究。