草甘膦为内吸传导型、非选择性的有机磷类除草剂，对许多一年生和多年生杂草有极强的控制能力^[1]，目前全球销量居首位，其广泛应用大大减少了杂草给农业带来的经济损失，抗草甘膦转基因育种是推动该类除草剂发展的动力。受aroA基因编码的5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)是草甘膦的靶标酶，主要参与莽草酸途径，抗性aroA主要通过构象的改变使除草剂无法结合而阻止其对生物的伤害。

抗草甘膦生物中非靶基因的研究也受到一定的关注。目前发现调控草甘膦抗性的非靶基因包括C−N键氧化裂解基因，如草甘膦氧化还原酶基因GOX；参与裂解C−P键的C−P裂解酶；磷酸转移酶基因glpA、glpB和igrA，甘氨酸氧化酶基因GO；草甘膦N-乙酰转移酶基因GAT使草甘膦发生乙酰化，无法与EPSPS结合，将草甘膦转化为低毒的乙酰草甘膦；此外转运蛋白能够主动运输某些磷酸化合物，推测草甘膦也可能被转运蛋白运出细胞外^[2-4]。

抗草甘膦基因被广泛应用于转基因育种研究，如Barry等将细菌中获得的GOX转入小麦获得了抗性植株^[5]；Pe aloza-Vázquez等也将磷酸转移酶基因转化烟草，提高了其抗性^[6]；谢龙旭等将抗性基因aroAM12转入棉花得到抗草甘膦的棉花^[7]。在目前被挖掘的一系列抗性基因中，已被用于商业化转基因作物中的有aroA-cp4 (根癌土壤杆菌)、GOX (人苍白杆菌)、2mepsps (玉米的双突变EPSPS)、gat (地衣芽孢杆菌)、epsps (Ag) (球形节杆菌)、mepsps (玉米的经修饰的EPSPS)、epsps grg23ace5 [人工合成的类似于epsps (Ag)的基因]。

目前转基因抗草甘膦生物育种所用的基因主要是5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶，发掘和利用不同类型的抗草甘膦基因一直受到人们重视。一些研究也发现，微生物对草甘膦的抗性涉及大量调控不同层面抗性的相关基因，深入研究和利用这些基因具有重要的理论与应用价值^[8]。本研究对抗草甘膦肠杆菌突变菌株NRS-1中5个草甘膦应答基因进行克隆研究，目前对这些基因与草甘膦的抗性研究较少，因此本实验期望通过相关实验初步了解这些基因在应对草甘膦逆境中的作用和应用潜力。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒: 肠杆菌NRS-1为草甘膦抗性菌株，农杆菌EHA105为植物表达菌株，本实验室保藏。大肠杆菌DH5α为质粒克隆宿主、大肠杆菌BL21为原核表达菌株，天根(北京)生化科技有限公司。PMDC83载体为本实验室保藏；PMD19载体、Pcold载体，日本TaKaRa公司。

1.1.2 培养基和抗生素: 研究中主要使用的培养基包括LB培养基^[3]、YEB培养基和MS培养基^[7]。主要抗生素包括氨苄青霉素50 mg/L、卡那霉素50 mg/L、潮霉素50 mg/L、利福平50 mg/L。

1.1.3 主要试剂: 限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA凝胶回收试剂盒，生工生物(上海)工程有限公司；DNA聚合酶KOD-Plus，东洋纺(上海)生物科技有限公司；细菌双杂交载体试剂盒中所用菌株及质粒，重庆医科大学张雪梅、尹一兵教授惠赠；化学试剂过硫酸铵、甘氨酸、溴酚蓝、考马斯亮蓝、硫酸锌、氯化钙等均为国产分析纯或色谱纯，北京鼎国昌盛生物技术有限公司。 1.2 方法

1.2.1 应答高浓度草甘膦逆境重要差异表达基因的筛选与克隆: 根据肠杆菌NRS-1在60 g/L草甘膦处理下的基因芯片结果^[8]，按照预测的目标基因所在通路、作用特点进行筛选，结果从43个差异表达基因中筛选出5个基因用于研究，包括易位酶延伸因子基因fusA、丁二酸脱氢酶基因sdhA、胸苷磷酸化酶基因deoA、鸟氨酸氨甲酰转移酶基因argF、周质蛋白基因osmY。这些基因从不同层面参与抵御草甘膦逆境，osmY作用于细胞最表层，sdhA、deoA和argF属于代谢水平的保护，fusA则是与核糖体相关的保护。草甘膦的靶基因aroA^[8]作为参照基因同样用于基因的功能验证。利用primer 3软件^[9]进行引物的设计(表 1)，DNA聚合酶KOD-Plus用于基因的PCR扩增，PCR反应体系及程序参照高保真聚合酶KOD-Plus简介说明书，PCR产物导入PMD19载体，详细步骤参照PMD19载体说明书，重组载体转化大肠杆菌DH5α，详细步骤参照大肠杆菌DH5α感受态说明书，获得的单克隆首先用琼脂糖胶检测，阳性克隆送上海英骏生物技术(上海)有限公司测序，获得序列在NCBI网站上进行BLAST比对，若为肠杆菌属的相应基因，相应单克隆提取重组质粒保留备用，同时获得的序列提交NCBI数据库。

1.2.2 目的基因原核表达分析: 将目的基因在大肠杆菌中表达，以进一步观察它们对细胞抗草甘膦的作用。限制性内切酶NdeⅠ和XbaⅠ对6个基因及Pcold载体进行双酶切，T4 DNA连接酶对切割后的载体和基因进行连接，将构建的重组载体转入大肠杆菌BL21 (详细步骤、体系及注意事项分别参照限制性内切酶、连接酶、大肠杆菌感受态说明书)。阳性单克隆送英骏生物技术(上海)有限公司测序，提取正确插入基因的重组载体备用。 将构建好的原核表达载体转化大肠杆菌感受态BL21细菌，37℃、150 r/min培养至OD₆₀₀=0.6，保存部分菌株作为诱导前样品，另一部分菌株用1 mmol/L IPTG 30℃诱导6 h (蛋白质fusA、sdhA较大，前期预备实验表明高温使蛋白质完全形成无功能的包涵体，而诱导温度为28℃时诱导12 h能够使菌株正常表达可溶性的功能蛋白)，5 000 r/min离心5 min收集菌液，一部分作为诱导后总样品，另一部分3 s/5 s间歇超声10 min，破碎细胞以释放蛋白质，5 000 r/min离心1 min，沉淀作为一部分样品，上清作为可溶性样品，利用SDS-PAGE^[10]对正确含有基因的4份大肠杆菌BL21样品进行目的 蛋白的可溶性鉴定。对能够可溶性表达功能蛋白的大肠杆菌进行草甘膦的处理(V_培养液:V_草甘膦:V_菌液=200:1:20)，以空载为对照，30℃、150 r/min振荡培养24 h，观察其生长情况，3次重复。

1.2.3 植物表达验证: 利用Gateway技术^[11]构建植物表达载体，含有正确基因的植物表达载体PMDC83转入农杆菌感受态EHA105。将含有正确目的基因的植物表达载体的农杆菌接种于50 mL含有卡那霉素和利福平的YEB培养基中培养，28℃、200 r/min培养过夜，2 000 r/min离心1 min，弃上清，沉淀用侵染液悬浮至OD₆₀₀为1.2−1.6，利用滴花法^[12]进行拟南芥的转化。 转化获得的T0代种子在含有潮霉素的MS固体培养基中培养，种植筛选获得阳性苗，重复相同的步骤，直至转基因拟南芥至T3代。对阳性的转基因苗进行基因的PCR验证，并测序。对正确插入基因的拟南芥进行草甘膦耐性表型检测：对生长约14 d的植株进行草甘膦(终浓度0.5 mmol/L) 48 h处理，观察其表型；用于qPCR^[13]的植株处理24 h，每隔6 h取一次样，primer 3软件设计相应的引物^[9] (表 2)，每个实验3次重复。

1.2.4 应答基因KEGG的信息学分析: 以大肠杆菌基因信息为基准，利用ClueGo^[14]软件对NRS-1在60 g/L草甘膦处理下的基因芯片结果中包括5个目的基因在内的24个差异表达基因^[8]与aroA的关系进行的信息学分析，具体步骤见软件说明书，重点分析5个目的基因与靶基因可能的相关性及其作用方式(实验结果中为方便观察，未将目的基因以外的其他基因名于图中标注)。

1.2.5 细菌双杂分析: 细菌双杂与酵母双杂的原理相似，但Escherichia coli具有转化效率高及生长速率快的优势，具有高效性^[15]，本实验选择细菌双杂来研究基因fusA、sdhA、deoA、argF、osmY与aroA是否存在互作关系。所用菌株及质粒由重庆医科大学张雪梅，尹一兵教授惠赠。主要以aroA基因为诱饵基因，选取其他基因为目标基因。利用细菌双杂进一步研究5个目的基因与aroA之间的关系。首先限制性内切酶NotⅠ和XhoⅠ对载体和基因进行双酶切，利用T4 DNA连接酶将aroA导入诱饵载体PBT，将fusA、deoA、argF、ahpC、osmY基因导入目标载体PTRG，将重组载体转入大肠杆菌DH5α中，存活的单克隆进行菌液PCR，阳性克隆测序验证并提取重组质粒备用。将阳性质粒转入报告菌株，利用Western blot^[16]验证蛋白的表达情况，进一步进行基因间的互作实验。细菌双杂的详细步骤包括载体的构建，共转化实验，Western blot中抗体的选择等参照相关论文^[17]及说明书(细菌双杂交载体试剂盒)。 2 结果与分析 2.1 应答草甘膦逆境目的基因的克隆与结构分析

通过T-A克隆获得了fusA、sdhA、deoA、argF、osmY 5个目的基因及aroA基因(图 1)。在NRS-1中，其中fusA、osmY、deoA、sdhA、argF基因在高浓度草甘膦处理下为上调表达。其结构特点总结如下。

基因fusA (GenBank登录号KT366019)是易位酶延伸因子，开放阅读框为2 112 bp，编码704个氨基酸残基，等电点为4.90，帮助蛋白质翻译过程中tRNA和mRNA转移；在翻译结束时帮助tRNA的脱落；该基因还能够增强或抑制翻译过程^[18]。除了参与蛋白质的合成，研究发现fusA能够作为分子伴侣^[19]，具有稳定蛋白质的作用。基因osmY (GenBank登录号KT366020)是功能未知的周质蛋白，开放阅读框为615 bp，编码205个氨基酸残基，等电点为5.16。它能够被高渗透压和生长速率改变表达水平，能够与磷脂相互作用，与质膜的空隙连接，防止胞质的皱缩^[20]。基因deoA (GenBank登录号KT366022)为胸苷磷酸化酶基因，开放阅读框为1 332 bp；编码444个氨基酸残基；等电点为4.96。它可以将胸腺嘧啶转化成为胸苷，这些胸苷可以被用于合成氨基酸，这是含有胸腺嘧啶氨基酸的来源之一^[21]。该基因也具有反向的功能，即将胸苷转化为胸腺嘧啶，这个过程帮助降解核苷^[22]，细胞在遇到逆境时，会发生一些错误，比如核苷合成发生错误，deoA可以帮助降解错误或多于的核苷。

基因sdhA (GenBank登录号KT366023)编码丁二酸脱氢酶，开放阅读框为1 764 bp，编码588个氨基酸残基，等电点为4.91。该酶位于质膜的内层，催化丁二酸和延胡索酸的互相转化^[23]；参与TCA循环和电子传递^[24]。受细胞分裂和铁离子浓度的影响^[25-26]；此外高浓度的丁二酸能够降低超氧化物的浓度^[27]，因此sdhA下调或上调都有可能发挥作用。

基因argF (GenBank登录号KT366021)编码鸟氨酸氨甲酰转移酶，开放阅读框为1 002 bp；编码334个氨基酸残基；等电点为5.04。该转移酶利用鸟氨酸合成精氨酸，在各种生长环境中该基因都被反向调节，过多或过少的精氨酸或其他C源都会抑制argF的表达^[28]，该基因的下调一方面能够使鸟氨酸积累，具有抗渗透的作用，另一方面可以帮助合成其他氨基酸如脯氨酸、芳香族氨基酸等^[29]。

基因aroA^[8] (GenBank登录号KT366024)编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶，开放阅读框为1 281 bp，编码427个氨基酸残基，等电点为4.98。该基因参与莽草酸途径，与芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)及其衍生物的合成相关，不仅影响细胞的代谢、蛋白质的合成，还参与细胞的抗逆。从已知的功能来看，克隆的6个基因都为逆境应答基因。

2.2 目的基因原核表达特点

由于在原核表达实验中经常会出现蛋白质的包涵体而使基因失去功能，因此首先进行SDS-PAGE实验验证蛋白质的形成情况。从图 2可见，每个基因的第3个泳道与第2个对照泳道相比都有特异性的条带，说明基因在表达菌中全部能成功合成相应的蛋白质，fusA、sdhA、deoA、argF、osmY、aroA基因合成的蛋白大小分别是77.59、64.23、47.27、36.7、21.35、46.16 kD，与图 2中显示的特异性条带大小相似。所有基因在原核表达实验中都能够表达有功能的蛋白，可用于进一步的功能验证。

对正确含有重组质粒的大肠杆菌进行草甘膦的处理，24 h后测定OD₆₀₀以观察其生长情况。结果表明含有6个基因的菌株OD₆₀₀值都比对照大，对照的值约为0.14，而含有基因的菌株的最小值是sdhA为0.15，osmY最大，其OD₆₀₀达0.4，因此可以推测体外表达这几个基因对微生物抵御草甘膦都有一定的作用，它们可以通过某种方式发挥作用，是否与NRS-1中的作用方式相同仍需进一步的验证。

2.3 转基因拟南芥的性状表现

PCR及测序结果显示6个目的基因已被转到拟南芥基因组上(图 3A)。为验证基因对植物抗草甘膦是否起作用，对生长约14 d的转基因植株进行了草甘膦(终浓度0.5 mmol/L) 48 h处理。结果如图 3B所示，在草甘膦处理后，植株叶片出现失绿现象，但转不同基因拟南芥在草甘膦处理下的形态表现有所不同，其优劣顺序依次为：aroA、argF、deoA、sdhA、GFP (空载对照)、fusA、osmY。其中转aroA、argF、deoA基因的表型相差甚小，说明deoA、argF可能对拟南芥抗草甘膦有重要作用，转fusA、osmY基因的植株表型较对照组差，说明基因对拟南芥耐草甘膦无正向积极影响。

对处于草甘膦逆境下的转基因植株进行qPCR，检测相应基因的表达情况如图 3C所示。在草甘膦处理12 h时，过表达植物中6个基因aroA、argF、deoA、osmY、sdhA和fusA都表现为上调，将每一个基因的变化对应到基因的功能及其在草甘膦逆境下转基因植株的表型，含有基因fusA和osmY的转基因苗在草甘膦处理后，受到草甘膦的影响较大，fusA为微生物中的延伸因子，参与蛋白质转录翻译过程，osmY在微生物中与膜相关，两个基因可能对物种的特异性较强，在拟南芥中表达不能产生积极的抗逆效果，反而对细胞产生负担；基因aroA、argF和deoA在草甘膦处理0 h到12 h之间基因上调量的差异比较是aroA＞argF≥deoA，这与草甘膦处理拟南芥后的表型有极大的相似性，说明aroA、argF和deoA基因对植物耐草甘膦具有一定的作用。

2.4 草甘膦应答基因与aroA靶基因的互作

2.4.1 基于KEGG分析的基因网络: 利用ClueGo程序进行KEGG分析，图 4显示了目的基因间的关系，不同的基因间通过参与不同的代谢途径连接形成一个小型的代谢网络。基因argF与aroA的相关性较大，有代谢的重叠，表明argF基因可能除了产物精氨酸对细胞抗草甘膦的作用外，还能够协助莽草酸途径抵御草甘膦；而aroA参与的过程与fusA、sdhA、deoA、osmY的关系较远，主要为间接的关系。推测本文获得的基因所参与的途径可能在不同程度上影响芳香族氨基酸及其衍生物的功能，由于NRS-1长期处于草甘膦逆境下，其耐性进化有着不可预测的一面，因此不排除基因改变其功能直接与莽草酸途径相关，从某种程度上说，这些基因可能帮助NRS-1细胞应答草甘膦存在的混合逆境，以及参与抵御草甘膦的毒性。

2.4.2 细菌双杂实验结果: Western blot验证基因在表达菌中的表达情况，实验表明所有蛋白能够较好的可溶性表达，基因能够发挥功能(图 5)。双杂实验检测基因与草甘膦靶标基因aroA的互作关系，结果表明阳性对照(PBT-LGF2+PTRG-Gal1p)有菌落出现，阴性对照(PBT-aroA+PTRG-blank，PBT-blank+PTRG-fusA、deoA、sdhA、argF、osmY)，Blank (表示不含基因)无菌落出现，表明所有表达系统均正常，进行基因互作实验时发现重组试验(PBT-aroA+PTRG-fusA、deoA、sdhA、argF、osmY)中未出现菌落，说明5个目的基因与aroA不存在直接互作的影响，尽管信息学分析表明它们之间存在某种联系，但基因间可能主要以代谢途径为依托为NRS-1提供抗草甘膦的可能。 3 讨论 3.1 NRS-1突变菌中非靶标基因对草甘膦逆境的作用

在基因芯片中上调表达的fusA和osmY在拟南芥中比对照组对草甘膦更敏感^[8]，尤其是osmY，可能是由植物细胞膜或翻译等过程与微生物的差异较大，另外细胞额外的表达功能不大的基因会浪费细胞资源，造成细胞的负担。基因argF和sdhA在NRS-1中表现为下调^[8]，但在转基因拟南芥中argF或sdhA对植物抵御草甘膦的过程效果较好，两个基因都为双功能的基因，不管为何种差异变化，对抵御逆境都有一定的作用。基因在植物中功能验证的结果说明草甘膦影响到转基因植株氨基酸的合成或利用，其中芳香族氨基酸对拟南芥抗草甘膦有较大的作用，其次是含有胸腺嘧啶的相关氨基酸，最后是精氨酸。此部分实验直接体现了拟南芥中目的基因对植物抗草甘膦的作用。

3.2 耐草甘膦非靶标基因的利用潜力

抗草甘膦基因可分为靶基因和非靶标基因，基因资源的获得是抗草甘膦转基因育种的关键。aroA是草甘膦的靶基因，在细胞对草甘膦的耐性中起着重要作用，除获得一些抗性的靶基因外，非靶标基因的研究也有所必要。目前抗草甘膦的非靶标基因挖掘较少，主要的基因包括GAT、GOX、glpA、glpB、igrA、GO^[4]，其中只有GOX、gat被用于商业化转基因作物。我国在此方面基因的挖掘上有一些研究，但主要集中于获得高效的靶基因，为拓宽相关研究领域，加速抗草甘膦的育种，对生物抗草甘膦机制进一步的了解，非靶基因的研究也应该有一定的发展。

本研究中，fusA、sdhA、deoA、argF、osmY从功能上看都是逆境应答基因，参与酸、渗透、氧化胁迫等，同时作为草甘膦应答基因，是细胞进入新稳态时调用的逆境特异性的应答基因^[30]。实验证明克隆获得的5个非靶标基因通过复杂的代谢网络，与草甘膦的靶基因aroA以间接的方式联系，通过莽草酸途径参与细胞抗草甘膦的过程。在拟南芥和大肠杆菌中对目的基因进行抗草甘膦的功能验证，表明这些基因在两种生物中均对细胞抗草甘膦有一定的作用，可能经过某种改造，仍能够具有高效抗草甘膦的作用，更深的调控机制研究仍需进一步的进行。