从1956年人们分离得到谷氨酸生产的优势菌株谷氨酸棒杆菌之后，这种菌便在发酵生产氨基酸、有机酸、高级醇等工业产品中扮演着重要角色^[1-2]。基因工程技术的不断发展，以及合成生物学技术的出现和应用，为人们提供了更多对谷氨酸棒杆菌的改造方法，从而提高产品产量。如还晓静等通过在谷氨酸棒杆菌中使用pDXW系列质粒过表达NAD激酶，提高L-异亮氨酸合成必需的辅因子NADPH的供应，从而提高L-异亮氨酸的产量^[3]。来书娟等使用含tac启动子的质粒pXMJ19过表达3-磷酸甘油酸激酶，增强糖酵解途径和三羧酸循环^[4]。杨柳等应用groES基因的表达元件Pgro实现了木糖异构酶在谷氨酸棒杆菌中的过表达^[5]。不过，谷氨酸棒杆菌的基因操作工具依旧较少，使人们在蛋白表达和代谢途径的改造中局限于tac、trc、cspB等有限的启动子中，而且缺乏丰富的RBS序列与之搭配。谷氨酸棒杆菌因其无内毒素、胞外无水解酶活性等特点，成为未来极具潜力的表达宿主^[6]，这也引起了不少人对开发谷氨酸棒杆菌高效表达系统的尝试。如Yim等对谷氨酸棒杆菌人工合成启动子文库进行筛选，获得了高效启动子P_H36，并且成功用于单链抗体scFv的分泌表达^[7-8]。Rytter等对tac启动子的关键区域进行突变，获得了一系列不同强度的tac启动子突变体^[9]。面对代谢工程和合成生物学的飞速发展，谷氨酸棒杆菌需要开发更多的表达元件，从而满足不同目标基因各自的要求，协调各个功能蛋白之间的相互作用，使生物系统更加高效平稳^[10]。

本研究基于应用广泛的谷氨酸棒杆菌-大肠杆菌穿梭表达质粒pXMJ19^[11]，使用新型克隆技术构建谷氨酸棒杆菌表达元件探测载体。目前，针对高效和高通量克隆的需求，有很多新的方法更加快捷和简单，对于基因序列的要求更少，如Clontech的In-Fusion系统、胞外PCR和胞内同源重组法等^[12-13]。本文使用的Golden Gate方法^[14]，价格低廉并且更适于多个片段与同一载体无缝连接，见图 1。将所筛选的片段与报告基因egfp无缝连接，从而避免传统探测载体上的EcoRⅠ、BamHⅠ等酶切位点对表达元件效果的评估产生干扰，使探测载体能够更加精确地对插入表达元件的效果进行测定。本实验室在前期工作中通过对Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum) BZH001在高、中、低溶氧条件下的发酵样品转录组进行测定，得到了不同基因在稳定期的转录水平数据。本研究将转录组数据与计算机预测和实验测量相结合，筛选受溶氧水平影响较小的高转录水平组成型启动子，连同下游的5′UTR序列组成可以启动表达的功能元件。最终获得了一系列有效的表达元件，增加了谷氨酸棒杆菌用于表达强度调节和系统构建的功能序列。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 菌种和质粒: 谷氨酸棒杆菌C. glutamicum BZH001、大肠杆菌Escherichia coli DH5α、质粒pXMJ19、pMD19-T-EGFP由本实验室保藏。

1.1.2 主要试剂与仪器: 限制性内切酶HindⅢ、BamHⅠ、EcoRⅤ及T4 DNA连接酶等购自Thermo公司；BsaⅠ二型内切酶、Q5超保真聚合酶购自NEB公司；质粒提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒购自Axygen公司；基因组提取试剂盒购自北京天根公司；氯霉素、卡那霉素等抗生素购自上海生物工程有限公司；其余试剂均为国产或者进口分析纯。 高速冷冻离心机和PCR热循环仪，美国ThermoFisher公司；Synergy H4酶标仪，美国BioTek公司；恒温金属浴，北京天根公司；Dark Reader，北京达科为生物公司；核酸和蛋白电泳仪，美国Bio-Rad公司。

1.1.3 培养基和培养条件: 大肠杆菌使用LB培养基^[3]在37℃培养，谷氨酸棒杆菌使用BHI培养基^[7]在30℃培养。抗生素使用氯霉素，作用终浓度在大肠杆菌中为34 mg/L，在谷氨酸棒杆菌中为10 mg/L。

1.1.4 引物设计及合成: 研究所需引物使用Primer 5设计，引物名称及序列见表 1，引物合成和测序工作由苏州金唯智公司完成。 1.2 方法

1.2.1 启动子探测载体的构建: 为了使用Golden Gate无缝克隆方法，首先要将pXMJ19质粒上的干扰性BsaⅠ酶切位点GGTCTC突变为GGTCAC。以pXMJ19为模板，p19-MUT-F、p19-MUT-R为引物扩增突变后的线性质粒。反应体系为：10×Buffer 5μl、dNTPs (各2.5 mmol/L) 4μl、上下游引物各(0.2μmol/L) 1μl、Q5 DNA聚合酶(2 U/μl) 0.5μl、模板1μl，加水至50μl。PCR扩增条件为：98℃ 3 min；98℃ 15 s，72℃ 3.25 min，30个循环；72℃ 2 min。产物用DpnⅠ37℃酶切处理2 h后直接转化到E. coli DH5α中，得到正确突变的质粒命名为p19-mut。 使用EcoRⅤ和HindⅢ对质粒p19-mut进行双酶切，去掉质粒中的lacI和tac启动子片段。使用引物p19-0-F、p19-0-R将两片段中间的骨架部分用PCR克隆出来，并在下游引物中加入T7终止子，得到的质粒为p19-0。 使用引物dBsaI-E-F和dBsaI-E-R将报告基因egfp从本实验室另一含此基因序列的质粒pMD19-T-EGFP中克隆出来，在其N端加入两个反向BsaⅠ酶切位点(TGAGACCAAAAAATTTTT TGGTCTCA)。使用HindⅢ、BamHⅠ对所克隆的egfp基因片段和质粒p19-0同时进行双酶切，并且用T4连接酶将两者连接，得到谷氨酸棒杆菌探测载体p19-A0。构建过程见图 2。

1.2.2 启动子的筛选和插入: 本课题组前期实验得到了C. glutamicum BZH001在0、30%和50%溶氧条件下发酵培养至稳定期的样品RNA-Seq测序结果(GenBank登录号：GSE77502)，将在30℃下搅拌速度为400 r/min、通气速率为3 L/min的条件定义为100%溶氧条件。从这些数据中先筛选出溶氧对转录水平影响较小的基因，将筛选范围限制在V_oxygen=│log₁₀FPKM_高溶氧/FPKM_低溶氧│ < 0.15这一范围内。再从中筛选出转录水平较高的基因，转录丰度以FPKM (Fragments per kilobase of exon permillion fragments mapped)表示。对每个筛选到的基因开放阅读框上游300 bp内的序列进行启动子预测，使用软件http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html^[15]，选取启动子预测分数在0.7分以上的基因。预测的启动子上游延伸60 bp，下游延伸至ATG之前，整体作为表达元件，从而保留启动子上游潜在的UP序列和下游RBS序列。其整体认为是能够有效启动基因表达的功能性片段，同时以谷氨酸棒杆菌Pgro强表达元件作为阳性对照^[5]。根据NCBI数据库中C. glutamicum ATCC 13032 (GenBank登录号：NC_003450)基因组数据设计引物，并且在上下游引物都加上BsaⅠ酶切位点。以C. glutamicum BZH001基因组为模板，扩增出这7个片段。PCR扩增条件为：98℃ 30 s；98℃ 10 s，55℃ 20 s，72℃ 20 s，30个循环；72℃ 2 min，反应体系同上。所得片段经过PCR产物纯化试剂盒纯化后，用BsaⅠ内切酶酶切，胶回收功能元件片段，并且分别连接到同样用BsaⅠ酶切得到的p19-A0载体上。得到含7种不同表达功能元件的egfp表达质粒。

1.2.3 谷氨酸棒杆菌基因操作: 谷氨酸棒杆菌的质粒转化使用电击热击转化法^[16]。谷氨酸棒杆菌基因组的提取使用天根生化科技有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒。

1.2.4 表达元件强度的测定: 将阳性谷氨酸棒杆菌接种于BHI培养基中，使用24孔深孔培养板，30℃、230 r/min培养过夜，转接于BHI固体培养基，同时分别按1%接种量接种于另一含BHI培养基的24孔培养板中，相同条件下培养24 h。 固体培养基平板使用Dark Reader观察荧光效果。高通量培养板中的细胞样品，收集后用PBS缓冲液洗2次，重悬并将OD₆₀₀调到0.5左右，使用多功能酶标仪Synergy H4测定荧光强度。激发波长为488 nm，发射波长为507 nm^[17]。以含有p19-0质粒的谷氨酸棒杆菌作为空白对照。比较不同功能元件的表达效果。 2 结果与分析 2.1 表达元件探测载体的构建

2.1.1 原质粒pXMJ19上BsaⅠ酶切位点的突变: 使用超保真酶扩增得到的产物，经过DpnⅠ酶消化模板后，转化E. coli DH5α，挑取转化子，提取质粒测序，选出正确突变掉BsaⅠ酶切位点并且质粒其他部分没有突变的转化子。

2.1.2 p19-0的构建: 将PCR扩增得到的含T7终止子的骨架片段连入质粒p19-mut中，所得E. coli DH5α转化子提取质粒，酶切验证，经过EcoRⅤ和HindⅢ双酶切，得到318 bp和5 414 bp两个片段，酶切结果见图 3，表明重组质粒p19-0构建成功。

2.1.3 表达元件探测载体p19-A0的构建: 将PCR扩增得到N端含两个反向BsaⅠ酶切位点的报告基因egfp片段连入质粒p19-0中，所得转化子提取质粒，经过HindⅢ和BamHⅠ双酶切，得到758 bp和5 701 bp两个片段，酶切结果见图 4，表明表达元件探测载体p19-A0构建成功。 2.2 谷氨酸棒杆菌表达功能片段的插入

2.2.1 表达元件筛选结果: 通过对谷氨酸棒杆菌在3种溶氧水平下3个平行测定得到的数据进行分析，筛选出tuf、rpsM、NCgl2088、rplK、NCgl1855、NCgl2493这6个满足条件的基因，随后使用BDGP Neural Network Promoter Prediction, V2.2 (http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)进行预测，筛选结果见表 2。 为使筛选的元件能够有效启动基因的表达，保留原基因的5′UTR部分，每个基因的启动子及其5′UTR部分构成可以启动基因表达的功能元件，在本研究中被称为表达元件。

2.2.2 表达元件的克隆: 使用片段A1−A6和Pgro分别对应的引物F、R将这7个表达元件克隆出来。得到的A1−A6和Pgro片段大小分别为231、287、377、352、220、221、197 bp。电泳分析结果如图 5所示。将功能表达片段和质粒p19-A0分别用BsaⅠ酶切、胶回收纯化后，片段和载体上的BsaⅠ识别序列会被去掉，从而使表达元件序列与报告基因egfp序列随后直接相连，得到表达质粒p19-A1、A2、A3、A4、A5、A6、Pgro。经测序挑选出构建正确的转化子。提取质粒再转化到C. glutamicum BZH001中，筛选出阳性转化子。

2.2.3 表达元件强度分析: 以含有质粒p19-A0的谷氨酸棒杆菌转化子作为阴性对照菌，连同7种插入不同表达元件的工程菌在BHI固体培养基中培养后的荧光效果见图 6。 在24孔深孔培养板中培养24 h后，菌液统一稀释8倍，酶标仪所测OD₆₀₀在0.504−0.588之间，差别较小，说明使用这6个筛选得到的内源性表达元件片段表达EGFP不会对菌体生长产生明显的抑制。通过不同表达元件片段插入后报告基因egfp表达水平的比较，测定这些可以启动基因表达的功能性片段的效果见图 7。PBS重悬菌液经破碎后SDS-PAGE结果见图 8，与空白对照p19-A0菌的条带对比，检测到在25 kD和35 kD之间有一条27 kD大小的条带。
结合图 7和图 8可以看出，单位菌浓度下不同表达元件具有不同的启动表达的效果。A1表达元件效果较高，接近强启动子Pgro。A5也有一定的启动表达的活性。结果表明从谷氨酸棒杆菌基因组中获取到了有效的功能表达序列。表达元件A2没有表现出启动表达的效果，其他片段启动表达的效果由高到低排列为Pgro > A1 > A5 > A4 > A3 > A6。 3 讨论

为了进一步提高谷氨酸棒杆菌氨基酸/有机酸等物质的产量、构建新产品生产途径，需要人工改造和构建代谢通路，协调通路中各个调控蛋白的作用浓度。因此，需要开发更多有效的表达元件才能满足逐渐精细和高效化的工程改造。

本研究构建了谷氨酸棒杆菌表达元件探测载体，用于筛选包含启动子和RBS在内的具有完整启动蛋白表达功能的序列片段。在表达元件插入位点之前引入T7终止子，可以防止RNA聚合酶转录通读，同时，潜在的mRNA在T7终止子处也会截断，避免了融合蛋白的产生，不需要加入3个不同阅读框的终止密码子(例如taactaactaa)^[18]，简化了传统探测载体的序列结构。该谷氨酸棒杆菌表达元件探测载体p19-A0，大小为6 459 bp，采用谷氨酸棒杆菌经典的pBL1复制子。使用Golden Gate克隆方法设置表达元件插入位点，实现无缝连接，使表达元件效果得到了更好的评估。

应用这一探测载体，结合启动子预测软件，评估了6个表达元件的效果。其中5个片段能够启动egfp表达，最好的表达元件A3效果接近已报道的强表达元件Pgro。这5个表达元件在探测载体上的测试效果与原转录组数据中的转录水平FPKM值并不对应，因为基因的表达还受到密码子、mRNA和蛋白质稳定性、mRNA的二级结构等多方面的影响^{[9, 19-20]}，所以将内源基因换成报告基因egfp之后，mRNA的结构、稳定性等可能发生明显改变，对蛋白的表达水平产生影响。这也表明，高效的表达元件不一定要从最高转录水平的基因中获得。A2片段未检测到启动表达的效果，可能是上述原因所致，也可能是操纵子结构造成了假阳性启动子的预测。筛选得到的其他5个表达元件，即使受到各种因素的影响，依旧显示出一定的效果。说明截取高转录水平基因的表达元件，并以egfp作为报告基因的探测载体进行效果评估是一种快速有效的方法。本研究增加了谷氨酸棒杆菌基因操作可选择的元件，并且提供了一种筛选不同效果表达元件的方法，今后可以用于谷氨酸棒杆菌基因组中功能基因表达强度的调节，应对更加复杂的代谢改造方式和人工生物系统。