“菌落总数”是农业、食品、医药卫生等行业进行质量检测的重要指标之一，目前常规的菌落计数方法是肉眼观察平皿逐个计数，需要花费较多的时间和精力^{[1, 2]}。本文推荐一种简便的平板菌落计数方法，经过使用和验证，与目测直接计数法相比，其计数结果更加准确，且效果明显优于菌落自动计数仪计数结果。现将方法介绍如下。

利用相机对平板上培养好的菌落进行拍照，通过Photoshop软件对图像进行处理并使用软件中的画笔工具“画掉”图像上的菌落，同时使用鼠标点击计数软件对鼠标点击次数进行统计，即可精确得到平板上菌落数。

将冻存管中保存的无乳链球菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌种分别接种到营养肉汤^[3]中，37 °C培养16?18 h，镜检无杂菌后，用无菌营养肉汤连续做10倍稀释至10^-7。为获得更多的可用平板样本，选择不同的稀释倍数，每个稀释梯度分别吸取100 μL和200 μL至琼脂表面上，用接种环涂布均匀。待菌液全部吸干后，倒置于37 °C恒温培养箱中培养18?20 h，取出进行菌落计数。

图　1 软件计数法流程图 Figure　1 Flowchart of counting method by software

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图　2 大肠杆菌在血平板上的菌落图像 Figure　2 Picture of E. coli on blood plate

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(2) 图像处理：利用PS软件对步骤1采集得到的图片处理，首先利用裁剪工具将图片裁剪到合适大小，然后利用色阶功能提高图片对比度，使得培养基中的菌落更易观察(图 3)。

图　3 经PS处理后的菌落图像 Figure　3 Pictures of E. coli colonies after PS

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(3) 菌落计数：将PS软件中的画笔工具调节到合适大小，在图片中有菌落的地方进行点击以“画掉”或“画上”菌落，图片中每个菌落只能且必需点击一次，同时打开鼠标点击计数软件对鼠标点击次数进行统计，即得到平板上单菌落的总个数(图 4)。

图　4 菌落计数结果 Figure　4 Results of colonies counting

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分别使用3种不同的计数方法对平板上的菌落进行计数，结果表明，菌落计数仪手动计数结果与目测直接计数结果基本相符，但该仪器自动计数结果与目测计数结果相差较大。在对平板菌落进行目测计数时，出现2次明显计数错误结果。本实验所建立的方法计数结果与目测直接计数结果基本一致，且未出现明显计数错误。比较不同计数方法对同一平板菌落的两次计数结果，本实验计数方法计数结果重复性最高，其次是目测直接计数法，菌落自动计数仪计数结果重复性最差。

软件计数法(即本实验的方法)能够快速、精确地计数平板上的菌落。与菌落计数仪方法相比，不需要购买昂贵的仪器(试验中所用相机也可以用手机替代，Photoshop软件可用电脑自带的画图软件代替)，且计数结果准确；与目测直接计数法相比，计数结果差异不显著(P>0.05)，并且计数通过软件进行记录，基本可以避免因人为数错而造成的误差；此外，该方法可在Photoshop中对图像进一步处理，使得菌落更加明显、易读，不容易被漏数。然而该方法也存在不足之处，如果菌落颜色与平板上气泡颜色差异不大，易造成误判(气泡被误认为菌落)，还需进一步的试验以寻找改进的方法。

该方法可用于平板菌落的计数，具有操作简便、测量成本低、测量结果精准度高以及适用面广等优点，并且当平板上的菌落大于300而小于800时，该方法仍可较准确地进行计数，在日常检测中有推广应用的潜力。