结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)是引起结核病的主要致病菌。随着艾滋病的流行和耐药菌株的不断增多，结核病又有卷土重来的趋势，研究和开发新一代抗结核药物已迫在眉睫。结核分枝杆菌细胞壁具有独特的高疏水性结构，其核心结构由外至内分别是：分枝菌酸、聚阿拉伯糖半乳糖和肽聚糖(peptidoglyacn)。这3种生物大分子共价相连组成庞大的复合物，即肽聚糖-聚阿拉伯糖半乳糖-分枝菌酸复合物(Mycolyl-arabino-galactan-peptidoglycan complex，mAGP)。肽聚糖是mAGP中的重要组成成分，位于细胞膜的外侧，具有高度复杂的三维网状结构，在维持细菌形态方面具有重要作用，也是抗结核药物开发的有效作用部位之一^{[1, 2, 3]}。

一线抗结核药物乙胺丁醇(Ethambutol，EMB)处理结核分枝杆菌后，细胞壁聚阿拉伯糖在短时间内大量流失，阿拉伯糖基转移酶EmbCAB被认为是EMB的主要作用靶点，但各项研究表明EMB作用可能是个多靶点的过程^{[4, 5]}。进一步利用EMB处理后基因转录谱变化的基因芯片结果(GSE1642)进行统计学处理和聚类分析^[6]，在众多表达变化的基因中，筛选到与细胞壁肽聚糖代谢相关的基因，即Rv3717。EMB处理后，Rv3717基因表达明显上调。最近报道表明：Rv3717具有酰胺酶活性的自溶素，可以分解细胞壁肽聚糖^{[7, 8]}，推测影响细菌形态和细胞壁的完整性。耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis mc²155，mc²155)是结核分枝杆菌的模式

菌，与结核分枝杆菌具有相似的细胞壁结构，但其生长迅速且对人无致病性。耻垢分枝杆菌MSMEG_6281是Rv3717同源蛋白，具有76%的同源性。因此，本研究首先检测了EMB作用于耻垢分枝杆菌后MSMEG_6281基因的表达变化；再建立MSMEG_6281过表达的耻垢分枝杆菌菌株，分析MSMEG_6281过表达对耻垢分枝杆菌形态的影响，从而推测MSMEG_6281与细胞壁肽聚糖水解之间的关系，为Rv3717与细胞壁肽聚糖代谢的相关性研究奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料

耻垢分枝杆菌(M. smegmatis mc²155)以及pVV16质粒由本实验室保存。RT-PCR试剂盒、pMD^TM18-T载体克隆试剂盒、LA Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶、250 bp DNA ladder，购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)；抗His抗体购自Sigma-ALdrich有限公司；辣根过氧化物酶HRP标记的马抗小鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

PCR基因扩增仪，Thermo Fisher Scientific有限公司；JY92超声波细胞粉碎机，宁波科生仪器厂；CT18RT台式高速冷冻离心机，上海天美生化仪器设备工程有限公司；2510电转仪，Eppendorf有限公司；JSM-6360LV扫描电子显微镜，日本电子(JEOL)公司。

1.2 方法 1.2.1 反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)：当耻垢分枝杆菌菌体OD₆₀₀达到0.6时，加入终浓度为10 mg/L的一线抗结核药物乙胺丁醇(ethambutol，EMB)，继续培养6 h和12 h，50 mmol/L Tris-HCl (pH 6.8)洗涤细菌，4 ℃、5 000×g离心10 min收获细菌。将收获的菌体于液氮中冷冻2 min，在室温中放置2 min，反复冻融2次，加入1 mL Trizol/10⁹细胞，涡旋混匀后提取细菌总RNA。根据JCVI CMR数据库中MSMEG_6281的序列，设计MSMEG_6281的上下游引物(5′-GTCGTTGGCCCCGTTGTG-3′，5′-CGCGTGTTGGTCTCGACTTG-3′)进行RT-PCR扩增。反转录反应体系为：RNA 2 µg，50 μmol/L随机引物1 µL，DEPC处理水10.5 µL-RNA体积；混匀后，70 ℃水浴变性5 min，4 ℃静置5 min；再加入如下反应物：10×AMV Buffer 2 µL，10 mmol/L dNTP 2 µL，25 mmol/L MgCl₂ 4 µL，40 U/μL RNase Inhibitor 0.5 µL，5 U/μL AMV反转录酶1 µL；混匀后30 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，99 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min合成cDNA分子。25 µL PCR 反应体系为：10×PCR buffer 2.5 µL，cDNA模板1 µL，10 µmol/L上下游引物各0.5 µL，10 mmol/L dNTPs 0.5 µL，rTaq DNA 聚合酶0.5 µL，ddH₂O 19.5 µL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共28个循环；72 ℃ 10 min。以gap基因为内参，检测MSMEG_6281的基因表达变化。

1.2.2 MSMEG_6281基因在M. smegmatis mc²155中的表达：以耻垢分枝杆菌基因组DNA为模板，利用PCR方法，设计上下游引物(5′-GGCATATGCCGTGTTCGTGTCTCGG-3′，5′-TAAGCTTACGCACGGGGCTGACGGC-3′)扩增MSMEG_6281基因全长序列，PCR反应体系同MSMEG_6281的RT-PCR反应。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共30个循环；72 ℃ 10 min。设计所含限制性内切酶位点分别是：Nde I和Hind III。酶切鉴定正确的MSMEG_6281基因与线性pVV16进行连接反应构

建pVV16-MSMEG_6281重组质粒。利用电转仪在2.5 kV和1 000 Ω条件下将pVV16-MSMEG_6281质粒电转化到mc²155细胞中^[9]，获得过表达MSMEG_6281蛋白的mc²155菌株。提取野生型mc²155和过表达MSMEG_6281的细菌总蛋白，利用考马斯亮法测定细胞总蛋白质浓度。用pVV16作为表达载体表达目的蛋白N末端有His-Tag，可以用Western blotting方法检测其表达。

1.2.3 过表达MSMEG_6281对mc²155细菌生长的影响：分别挑取野生型M. smegmatis mc²155菌株和过表达MSMEG_6281的菌株接种于3 mL LB培养基^[10]，37 ℃、200 r/min培养48 h。用分光光度计测OD₆₀₀，将2个菌株浓度调至一致，按1:10 000接种于3组100 mL LB培养基中。每12 h测一次OD₆₀₀，绘制生长曲线。

1.2.4 扫描电子显微镜观察mc²155细胞的形态：接种M. smegmatis mc²155和过表达MSMEG_6281的mc²155菌液，当OD₆₀₀达到1.0时收获菌体。将细胞重悬在1 mL的2.5%的戊二醛中，4 ℃放置24−48 h。再用10 mL 0.01 mol/L PBS洗涤细胞沉淀3次，将细胞重悬于1%的四氧化锇中再固定，再用PBS洗涤。用10 mL浓度逐渐递增的乙醇洗涤细胞沉淀后，将细胞重悬在约0.1 mL的100%乙醇中。取其中0.5 μL点样到硅片上，在JSM-6360LV扫描电子显微镜下观察细胞形态变化，测量细胞长度，并计算同一视野下细胞长度变化的比例。

2 结果与分析 2.1 EMB处理后mc²155细胞中MSMEG_6281基因的表达变化

以gap为内参照基因，利用RT-PCR技术检测对照组和EMB处理组MSMEG_6281基因的表达情况，检测结果如图 1所示。用Quantity one凝胶分析软件半定量分析表明：与对照组相比，MSMEG_6281基因在EMB处理6 h和12 h均呈现较高的表达。经过SPSS对平行样品统计学分析，3组样品P<0.05，有显著性差异。

2.2 建立MSMEG_6281基因过表达的mc²155菌株

以耻垢分枝杆菌mc²155菌株的基因组DNA为模板，利用高保真的 LA Taq DNA聚合酶扩增出的PCR产物与预期片段(918 bp)大小一致。将测序得到的MSMEG_6281的DNA序列与M. smegmatis mc²155基因组数据库进行BLAST分析，结果表明所克隆的MSMEG_6281基因与基因组数据库的MSMEG_6281基因序列一致。进一步成功构建pVV16-MSMEG_6281表达载体，利用限制性内切酶图谱鉴定与预期片段大小一致(图 2)。SDS-PAGE电泳结果显示，在MSMEG_6281过表达的mc ²155菌株的裂解液上清中出现分子量约为31 kD的过表达条带。利用过表达MSMEG_6281的抗组氨酸标签通过Western blotting方法得到确认(图 3)。

2.3 过表达MSMEG_6281对mc²155菌株生长的影响

在菌株接种量一致的情况下，过表达MSMEG_6281的mc²155细胞的生长速度比野生型mc²155慢，达到对数生长期所用的时间更长(图 4)。结果表明，MSMEG_6281的过表达，对菌体的生长有抑制作用。

2.4 过表达MSMEG_6281对mc²155菌株形态的影响

野生型mc²155细胞形态呈短棒状，而过表达MSMEG_6281后，mc²155细胞相对变得更长，在一个视野范围内，菌体平均长度是野生型的1.5-2.0倍，表明MSMEG_6281的过表达影响了细胞的形态(图 5)。

3 讨论

肽聚糖是维持细菌形态的关键结构。肽聚糖水解相关基因过表达后，对细胞壁肽聚糖的水解有促进作用，破坏细胞壁的组成，使细胞的形态发生变化。过表达MSMEG_6281的细胞在形态上确实与正常细胞有差异，在对数生长的旺盛期，细胞的平均长度比野生型细胞要长。所以，本研究提示MSMEG_6281与细胞壁肽聚糖代谢密切相关，参与细菌自溶以及细胞分裂等过程。结核分枝杆菌Rv3717是MSMEG_6281的同源基因，最近有文献报道了Rv3717的蛋白构象，并确定了Rv3717是具有酰胺酶活性的结核分枝杆菌自溶素^{[7, 8]}。本研究通过细菌形态的变化进一步佐证了MSMEG_6281与细胞壁肽聚糖代谢密切相关。

结核分枝杆菌具有酰胺酶活性的自溶素，研究对揭示复杂的结核分枝杆菌免疫逃逸机制具有重要意义。肽聚糖水解酶，又称自溶素(autolysin)，是由细菌自身产生并可以降解细胞壁肽聚糖的一类水解酶，广泛参与细胞壁肽聚糖代谢。根据作用于细胞壁肽聚糖的化学键不同，自溶素分为4类，分别为N-乙酰葡萄糖苷酶、胞壁酸酶(溶菌酶)、酰胺酶和内肽酶^[11](图 6)。在这些自溶素的协同作用下，细胞壁肽聚糖方能有效降解。细胞壁肽聚糖降解的最小产物为胞壁酰二肽(muramyl dipeptide，MDP)，而MDP又是分枝杆菌细胞骨架中具有免疫佐剂活性的最小结构单位^[12]。最近研究表明，MDP在抗结核免疫过程中发挥重要作用，它能识别单核巨噬细胞内NOD2模式识别受体，激活NF-κB信号途径，诱导产生一系列如TNF-α和IF-1β等细胞因子，参与宿主对结核分枝杆菌的天然免疫防御，促进机体对外源性抗原的特异性免疫反应^{[13, 14]}。具有酰胺酶活性的自溶素很可能通过破坏MDP的产生抑制NOD2受体介导的信号转导通路，从而抑制宿主免疫反应而致病^[14]。酰胺酶自溶素与细菌致病性密切相关，在很多细菌自溶素研究中已经得到证实。例如在淋球菌中，具有酰胺酶活性的自溶素功能缺失后，引起细胞分裂抑制、细菌生长缓慢、菌体变形以及MDP释放减少等改变^{[15, 16]}；单核细胞增多性李斯特菌的自溶素基因敲除后，细菌致病力明显弱化，引起感染小鼠死亡率下降等免疫系统相关反应^{[17, 18]}。因此，在自溶素作用下的MDP被水解很可能是结核分枝杆菌复杂的免疫逃逸机制之一。但目前对肽聚糖分解代谢关键酶缺少了解，只是在肽聚糖合成代谢关键酶方面有较深入研究，并寻找到几个有价值的药物筛选靶点^{[19, 20]}，所以，对Rv3717和MSMEG_6281的进一步深入研究具有重要意义。