肌醇(Inositol)又称环己六醇，分子式为C₆H₁₂O₆，相对分子量是180.16，具有诸多重要的生理活性，广泛应用于医药、食品及饲料等行业。肌醇是细胞膜的组成成分之一，是胞内第二信使磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol，PI)合成的前体，不仅在钙平衡和信号传递方面起重要作用^[1]，还能保持脑细胞的结构完整^[2]。肌醇浓度被证实与新生儿脑病、阿尔茨海默病、唐氏综合症等持续性神经功能障碍有关；此外，肌醇还可改善PCOS (多囊卵巢综合症)女性的胰岛素敏感性和排卵功能，治疗妇女代谢综合症^{[3, 4, 5]}，具有抗氧化、抗衰老、抗炎功能^[6]。

肌醇的传统生产方法一般是从米糠或麸皮中提取出植酸钙，再加压水解制得肌醇，但此方法存在制备过程复杂、成本投入高、污染环境等缺点。所以肌醇供求之间的矛盾必需通过其它有效途径来解决，而用微生物发酵法生产肌醇正是解决这一矛盾的途径。利用微生物法生产肌醇具有很好的应用前景。

酵母从葡萄糖开始合成肌醇的生物合成与代谢途径基本明晰^[7]。在肌醇的合成过程中，肌醇-1-磷酸合成酶是关键酶，该酶的表达受到其产物肌醇的反馈抑制，野生菌株中肌醇-1-磷酸合成酶只在对数期或缺少肌醇的情况下表达。该酶的编码基因为INO1，是酵母中受控制最严格的基因之一，对INO1基因启动子的研究发现，其启动子的上游存在一些重复序列，称作UAS_INO元件。UAS_INO是对肌醇敏感的序列，如果培养基中含有肌醇，它会被激活而影响INO1的表达，酵母细胞中的肌醇-1-磷酸合成酶便受到阻遏，细胞中的肌醇合成停止^{[8- 11]}。Ye等^[12]研究发现酿酒酵母中肌醇焦磷酸激酶和KCS1编码的碱性亮氨酸拉链结构域(Basic leucine zipper domains)都是INO1表达所需要的，敲除肌醇焦磷酸激酶的编码基因KCS1引发肌醇营养缺陷，细胞内肌醇和磷脂酰肌醇减少。表明INO1的转录受肌醇焦磷酸合成的调控。Justin等^[13]在Escherichia coli中过表达拟南芥的磷脂酰肌醇合成酶1，从而通过发酵制取肌醇。张厚程等^[14]用含INO1的两个不同质粒对肌醇营养缺陷型粟酒裂殖酵母菌进行转化，发现两个质粒均能在粟酒裂殖酵母中自主复制并使其变成肌醇原养型。以上研究表明，通过调控肌醇生物合成与代谢途径中相关基因的表达，从而提高肌醇的合成量是可行的，特别是肌醇合成过程中的关键酶基因INO1。本研究通过构建rDNA介导的INO1基因多拷贝整合表达载体pURIH，电转化酿酒酵母Y01菌株，构建了高效表达INO1基因的肌醇基因工程菌YI2-1及抗性基因敲除后的菌株YI2-1△KP，为微生物发酵法产肌醇奠定了一定的基础。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株和质粒：酿酒酵母S288c (二倍体)，大连理工大学生命科学与技术学院赵心清教授惠赠；酿酒酵母Y01 (二倍体)、大肠杆菌DH5α由农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室保存。pURH、pURIH本研究构建；pUG6、pSH65载体由福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心惠赠。pMD19-T Simple Vector购于TaKaRa公司。

1.1.2 主要试剂和仪器：鲑鱼精DNA，Sigma公司；Trizol、荧光定量试剂盒，Roche公司；DNaseⅠ(RNase Free)，TaKaRa公司；反转录试剂盒，fermentas公司；Transfast Taq DNA聚合酶、纯化试剂盒，北京全式金生物技术有限公司；其余生化药品为进口或国产分析纯试剂。UV-1100紫外分光光度计，上海美谱达仪器有限公司，7500 Real-Time PCR System，Applied Biosystems；Waters e2695 HPLC，美国Waters公司。

1.1.3 培养基：(1) YPD培养基(g/L)：酵母提取物10、葡萄糖20、蛋白胨20，pH自然，1×10⁵ Pa灭菌20 min。(2) Zeocin抗性选择培养基：用ddH₂O将Zeocin粉末溶解后用无菌过滤器过滤。配制成浓度为100 g/L的Zeocin母液，避光保存。用时直接加入到灭菌后冷却至50 °C左右的YPD 培养基中使其终浓度为50 mg/L。由于Zeocin致死浓度和pH有关，因此在YPD培养基灭菌前先用NaOH溶液调节pH至7.0。(3) G418抗性选择培养基：冷却至50 °C左右的YPD培养基中按需要加入G418，配制不同终浓度的G418抗性培养基。(4) YPG诱导培养基(g/L)：酵母提取物10、半乳糖20、蛋白胨20。

1.2 引物设计

根据GenBank数据库公布的酿酒酵母S288c的INO1基因序列与S288c基因组上位于rDNA前后的序列，利用软件Prime Premier 5.0分别设计INO1特异性引物和验证引物。在RTPrimerDB (http://medgen.ugent.be/rtprimerdb)网站找到已证实可用的qRT-PCR内参引物ACT1等。引物序列见表 1。

1.3 ScINO1的克隆及含ScINO1基因的酵母多拷贝表达载体pURIH的构建

利用PCR技术，以模式菌株酿酒酵母S288c的基因组DNA为模板，扩增酿酒酵母肌醇-1-磷酸合成酶基因(ScINO1)包含1 602 bp的开放读码框。在PUG6上连入rDNA片段及组成型强启动子PGK和CYC1终止子，构建rDNA介导的多拷贝整合表达载体pURH，并将ScINO1基因连入载体pURH，获得ScINO1基因超表达载体pURIH^[15]。

1.4 pURIH的转化及筛选

采用高效的酿酒酵母电击转化法^[16]，将KpnⅠ酶线性化的pURIH载体转化感受态酿酒酵母Y01。KpnⅠ的单酶切位点位于2.2 kb rDNA片段的中部，重组质粒载体经该酶线性化后可以整合到酿酒酵母染色体的特定部位，实现多拷贝同源重组。电转条件为：2 mm转化杯；电压：1.5 kV；电阻：200 Ω，电容：25 μF。通过G418 (0.5−2.0 g/L)梯度平板筛选转化子。挑取高拷贝转化子。采用酵母基因组提取试剂盒提取菌落PCR阳性克隆子的基因组DNA，用rDNA-F、rDNA-R引物PCR验证载体是否已整合到酿酒酵母的染色体上。

1.5 重组菌及对照菌株生长曲线的测定

分别将出发菌株Y01、过表达菌株YI2-1和YI2-2按1%的接种量接种于0.05 L YPD液体培养基中，30 °C、220 r/min培养，每隔4 h取样并用紫外分光光度计在600 nm波长下测定其光吸收值以分析生长速率。以未接种的YPD液体培养基作为空白对照。以OD₆₀₀值为纵坐标，生长时间为横坐标，做生长曲线。

1.6 实时荧光定量PCR分析

收集YPD液体培养基培养24 h的Y01、YI2-1和YI2-2菌株菌体，液氮研磨，Trizol提取总RNA，DNase 酶进行RNA纯化后，用Fermentas反转录试剂盒进行Reverse Transcription PCR来扩增cDNA，以此为模板进行qRT-PCR分析。选择ABI7500荧光定量PCR仪，采用两步法按以下程序进行定时定量PCR反应：95 °C 30 s；95 °C 10 min，95 °C 15 s，60 °C 1 min，40个循环；熔解曲线分析：95 °C 15 s，60 °C 30 s，95 °C 15 s。以酿酒酵母中的ACT1为内参基因(引物ACT1-F/R），每个基因的检测分别设置3个平行，使用2^?ΔΔCT 法分析实验数据。重复3次实验，使用GraphPad prism 5分析作图。

1.7 KanMX筛选标记的切除

采用高效电转法将质粒pSH65转化到YI2-1克隆子中，接着在YPG液体培养基中诱导培养4 h (诱导产生的Cre酶切除方向相同的2个loxp位点间的含有KanMX筛选标记的序列，留下1个loxp位点)，再将菌液涂布在YPD平板上培养1−2 d，挑取在YPD平板上的克隆子，做菌落PCR验证。将抗性基因敲除的菌株在YPD培养基中传代10−15次，涂布YPD平板，单菌落长出后影印至带有Zeocin抗性的YPD平板，从不含Zeocin的YPD平板上挑取丢失Zeocin抗性的酵母单菌落重新划线于含有Zeocin的平板上验证确实丢失了pSH65质粒。

1.8 高效液相色谱法测发酵液肌醇含量

发酵液中肌醇含量的测定：培养液振荡提取后经离心、滤纸过滤再用三氯甲烷萃取，上层水溶液经旋转蒸发浓缩，浓缩液过0.45 μm过滤器于样品瓶内，采用美国Waters e2695 HPLC检测。液相色谱分析条件如下：色谱柱：Waters sugar-pak I柱(6.5 mm×300 mm)；流动相：去离子水；流速：0.4 mL/min；柱温：90 °C；检测器：Waters 2414示差检测器。

2 结果与分析 2.1 pURIH的构建

构建得到整合表达载体pURIH，其大小为8 864 bp，测序pURIH整个载体，结果表明PGK启动子、INO1目的基因、CYC1终止子在载体上连接完全正确。pURIH采用了来源于宿主酿酒酵母自身的3个表达元件：组成型强启动子PGK、CYC1终止子和rDNA同源重组序列，能够实现目的基因的多拷贝整合及稳定表达。同时在表达盒两端有一对同尾酶AvrⅡ/SpeⅠ，可插入多个基因表达盒，实现多基因共表达。载体构建过程见图 1。

2.2 酿酒酵母过表达INO1菌株的筛选

通过G418 (0.5−2 g/L)梯度平板筛选转化子。挑取高拷贝转化子。采用酵母基因组提取试剂盒提取菌落PCR验证为阳性克隆子的基因组DNA，通过rDNA-F (酿酒酵母基因组上位于rDNA前的第237位碱基开始的序列)、rDNA-R (pURIH载体的第91位碱基开始)进行引物PCR验证(图 2)，扩增得到的DNA片段为整合在酿酒酵母基因组上的3部分相连片段，包括rDNA上游片段、rDNA及pURIH载体部分片段。电泳条带与预期大小相符，约为2 667 bp。说明rDNA介导的过表达载体pURIH成功地与酿酒酵母Y01的基因组发生同源重组，命名为YI1。为获得目的基因更高表达量的菌株，以已经整合的菌株Y01为出发菌株再次进行电转化并验证，挑选最高G418浓度(3 g/L)的YPD平板上两个长势较好的单克隆，以此作为重组菌，命名为YI2-1和YI2-2。

2.3 重组菌与出发菌Y01生长曲线的比较

YPD液体培养基摇瓶培养出发菌和过表达菌，实验结果表明(图 3)，过表达菌YI2对数期菌体生长速率均快于出发菌株Y01。说明过表达INO1能够提高菌体细胞活力，肌醇对细胞生长有一定的促进调控作用。

2.4 重组菌与出发菌INO1基因转录水平的比较

将反转录所得Y01、YI2-1和YI2-2菌株的cDNA进行qRT-PCR检测。用<2^?ΔΔCT法对菌株中INO1的表达量进行分析。以出发菌Y01为对照，进行归一化处理，作图比较(图 4)：YI2-1菌株INO1平均表达量是Y01的16.235倍，YI2-2是Y01的11.163倍。结果说明本研究构建的INO1基因工程菌在基因表达水平上是成功的。

2.5 无KanMX抗性基因菌株的获得

通过转化pSH65诱导出Cre酶切除KanMX抗性基因，挑取YPD平板上克隆子，用KanMX-F、KanMX-R引物做菌落PCR验证(图 5)。结果与预期一致，实验组KanMX抗性基因敲除的PCR条带大小为312 bp，对照组的PCR条带大小为1 862 bp。说明所挑取的克隆子KanMX抗性基因敲除成功。pSH65质粒经过传代丢失，阴影平板筛选。最后对菌种进行保藏，命名YI2-1△KP。

2.6 过表达菌株的遗传稳定性研究

将过表达菌株YI2-1、YI2-1△KP，连续传代20代后，用酵母基因组提取试剂盒提取基因组为模板，用引物rDNA-F、rDNA-R进行PCR验证。结果见图 6：电泳条带与预期大小相符，约为2 667 bp，表明转化的目的基因通过rDNA介导整合在酿酒酵母基因组上，使构建的过表达菌株YI2-1、YI2-1△KP具有很高的遗传稳定性。

2.7 INO1过表达菌株肌醇合成量的检测

摇瓶发酵检测INO1过表达菌株在30 °C、220 r/min通气培养50 h后的肌醇积累量。经试验考察色谱条件确定为，色谱柱：Waters sugar-pak I柱(6.5 mm×300 mm)；流动相：去离子水；流速：0.4 mL/min；柱温：90 °C时葡萄糖和肌醇可良好分离。

以出发菌为对照，菌株同时做3个平行，发酵实验重复3次。测得YI2-1产肌醇量为325 mg/L，YI2-1△KP为627 mg/L，而出发菌株Y01发酵液中检测不出肌醇。表明过表达菌株合成的肌醇不仅能满足自身的需要，而且能够向胞外分泌。

3 结论

微生物法生产肌醇具有巨大的优势和潜力，发展和应用生物高新技术，用其推动肌醇生产、逐步降低产品成本，是肌醇生产研究的趋势。为适应市场多方面的需求，微生物发酵工程及其产业化的发展是其必然趋势，而获取优化的微生物发酵肌醇产品的关键还在于加强选育高效、高产、优质的生产菌种，并保持其在生产过程中的适应性和稳定性。因此，本研究利用基因工程技术改造酿酒酵母菌种，通过过表达肌醇合成关键酶基因INO1，提高肌醇合成途径的正调控，促进肌醇合成；并敲除用于筛选用的抗生素抗性基因，最终构建安全无毒害的肌醇基因工程菌株，为微生物发酵法产肌醇，最终实现其工业化生产和规模化应用奠定了基础。

本研究构建的酵母高效表达载体pURH，采用了来源于宿主酿酒酵母自身的3个表达元件，能够实现目的基因的多拷贝整合及稳定表达。同时在表达盒两端有一对同尾酶AvrII/Spe I，可插入多个基因表达盒，实现多基因共表达。由qRT-PCR检测可知，将目的基因INO1插入pURH获得的rDNA介导的整合表达载体pURIH能够实现INO1基因在酿酒酵母中的超表达。

酿酒酵母菌株的生长曲线表明，过表达菌对数期菌体生长速率均快于出发菌株；YI2-1的生长速率与YI2-2存在着差异，这与菌株INO1表达量的分析结果一致。说明过表达INO1能够提高酿酒酵母细胞活力，表达量越高的菌株活力越强。这与Hong等^[17]研究发现过表达INO1对酵母耐高乙醇起着重要作用一致。以上结果存在的原因可能包括以下两方面：(1) 肌醇是磷脂酰肌醇(PI)合成的前体，在酵母菌细胞中与CDP-1,2-二酰基甘油(CDP-DAG)经PI合成酶催化反应生成PI。PI是酵母菌的磷脂主要组成成分，PI在磷酸化激酶的作用下可以形成多种磷酸化形式，在真核细胞中对于细胞形态、信号传导、代谢调控和细胞的各种生理功能发挥重要作用^[18]。(2) 肌醇有类似维生素B1和生物素的功能，为酵母生长因子。

最后，本研究对过表达菌株发酵产物肌醇进行初步的检测探究，建立了一种采用示差检测器检测肌醇的高效液相色谱法。结果表明，该方法可使发酵液中葡萄糖和肌醇良好分离，测定得YI2-1△KP肌醇产量为627 mg/L。而抗性基因敲除前的菌株肌醇产量相对较低，可能原因是高拷贝数的MX抗性标记对酵母有一定的毒害作用^[19]，从而影响酵母肌醇代谢等过程。具体原因还需进一步的研究。此外，与Hisashi等^[20]的研究相比较，发酵液中肌醇含量较低。从可获得的资料分析知，培养基对发酵有较大的影响，因培养基不同，其发酵类型表现为一、二型发酵，其发酵过程中有厌氧发酵阶段，较高浓度的葡萄糖对肌醇产生有抑制作用^[7]。因此，后期对培养基、发酵条件的优化，有望进一步提高过表达菌株肌醇产量。