食醋在中国已经有超过三千年的食用历史，酸味柔和，醇香回甜，久陈不腐，具有调理血糖、血脂、血压、软化血管的保健功效，成为深受人们喜爱的一种调味品。传统食醋生产主要以固态发酵为主，通过微生物的代谢作用产生的众多酶系将富含淀粉和糖类的原料催化生成醋酸等基本风味物质，本质上是一个微生物菌种混合发酵的复杂过程。传统食醋发酵过程中存在着复杂的微生物群落，通过微生物的协同作用，产生有机酸、氨基酸、酯类化合物等代谢产物，使传统食醋具有丰富的营养成分和独特的风味^[1]。

虽然微生物在食醋酿造过程中发挥着重要作用，但是微生物污染是亟待解决的难题。目前有关食醋酿造微生物的研究主要集中在菌种分离鉴定和群落结构分析方面^{[2, 3, 4]}，几乎没有有关食醋生产过程中微生物污染的研究报道。成品食醋被微生物污染后会产生异味、出现颜色变浅和醋中固形物减少等现象，大大地降低了食醋的营养价值，不利于人们的健康。本课题组采用PCR-DGGE技术结合纯培养技术^[5]，对正常醋样和污染醋样的微生物群落结构进行了比较研究，发现了引起食醋变质的污染菌CICC 10774。本研究采用多相分类学技术，通过16S rRNA基因序列系统发育分析，结合形态学特征和生理生化特性对菌株CICC 10774进行鉴定。在此基础上，对菌株CICC 10774的生长代谢特征与代谢产物进行了测定分析。

1 材料与方法 1.1 实验菌株及培养条件

菌株CICC 10774分离于污染食醋样品，保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心。菌株CICC 10774使用MRS培养基于37 °C下厌氧培养。

1.2 主要试剂及设备

MRS培养基、革兰氏染色试剂盒、生理生化鉴定管购于北京陆桥技术股份有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购于Omega公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、DL2000 marker购于天为时代生物有限公司；GoldView购于北京赛百盛基因技术有限公司；溶菌酶购于Sigma-Aldrich公司；蛋白酶K购于Merck公司；API试剂条购于生物梅里埃公司；其它化学药品均为进口分析纯产品。

光学显微镜Olympus BH-2购于奥林巴斯有限公司；紫外可见分光光度计7200型购于尤尼科(上海)仪器有限公司；高效液相色谱LC-20A购于Shimadzu公司；UV铂金级凝胶成像系统77WL-20M购自英国Explorer公司；温度梯度PCR仪购于Biometra公司；恒温培养箱BHG-8082型购于上海一恒科学仪器有限公司；临界点干燥仪CPD030购于BAL-TEC公司；喷金-离子溅射仪E-1045和扫描电镜SU8010购于Hitachi公司。

1.3 实验方法 1.3.1 菌株CICC 10774分子生物学鉴定：利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株CICC 10774基因组DNA，用0.8%琼脂糖凝胶电泳进行检测。以基因组DNA为模板，利用通用引物27F和1492R对该菌株的16S rRNA基因进行PCR扩增^[6]。PCR反应条件为：94 °C 10 min；94 °C 30 s，55 °C 30 s，72 °C 90 s，30个循环；72 °C 10 min。扩增产物用0.8%琼脂糖进行检测后，送北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序。使用ContigExpress软件对测序结果进行分析，将分析后结果递交到EzBioCloud数据库进行比对分析^[7]，确定菌株CICC 10774与已知菌株的同源关系。采用MEGA 4软件中的Clustal功能对菌株CICC 10774与近缘菌株的16S rRNA基因进行多序列比对^[8]，并使用Neighbour-Joining法进行系统发育及分子进化分析^[9]。

1.3.2 菌株CICC 10774表型特征鉴定：菌株CICC 10774接种到MRS培养基上，厌氧培养3 d，观察菌落形态特征^[10]。使用革兰氏染色试剂盒对菌株CICC 10774进行染色，使用光学显微镜观察菌体形态特征。使用场发射扫描电镜，对CICC 10774菌体进行电镜观察。具体操作：收集新鲜菌体，加入2.5%戊二醛4 °C固定过夜。6 000 r/min离心5 min收集菌体，100 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.2)漂洗3次。30%、50%、70%、85%、95%乙醇梯度脱水后100%乙醇脱水3次，脱水后对样品进行二氧化碳临界点干燥和喷金，使用场发射扫描电镜进行观察。

根据分子生物学鉴定结果，结合伯杰氏系统学手册^[11]，使用API 50 CHL鉴定系统和生理生化鉴定管对菌株CICC 10774进行鉴定^[12]。按照使用说明，利用API 50 CHL鉴定系统对49种碳源底物的利用能力进行测定。使用生理生化鉴定管对菌株CICC 10774的明胶液化、柠檬酸盐利用、H₂S生成、尿素利用、硝酸盐还原、VP试验和MR试验等生理生化特性进行鉴定。将新活化的菌株接种到鉴定管中，37 °C厌氧培养3 d后，根据说明书对试验结果进行判读。利用厌氧培养罐进行菌株厌氧生长特性的测定。

1.3.3 菌株CICC 10774生长特性的研究：生长特性研究包括生长最适温度和pH、热稳定性以及代谢产物分析。

生长最适温度和pH试验：菌株CICC 10774接种到MRS液体培养基中，厌氧培养3 d后作为接种液，按照1%接种到新鲜的MRS液体培养基中，分别置于20、25、37、40和45 °C培养箱中厌氧培养7 d，每天测定培养液的在600 nm下的吸光值。同时将接种液按照1%接种到新鲜的不同pH的MRS液体培养基中(pH 3.0−7.0)，每天测定培养液在600 nm下的吸光值。

热稳定性试验：菌株CICC 10774接种到pH 5.0 MRS液体培养基中，培养3 d后进行菌落计数。分别取25 mL菌液，93 °C处理15、30、45、60、90和120 s，对处理后的样品进行菌落计数。

代谢产物分析试验：菌株CICC 10774代谢产物使用高效液相色谱仪(岛津LC-20A)进行测定。色谱柱为GRACE Prevail Acid (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为10 mmol/L KH₂PO₄ (pH 2.3)和甲醇(95:5)；流速为0.6 mL/min；检测器为紫外检测器，检测波长210 nm，柱温30 °C。

2 结果与分析 2.1 分子生物学鉴定结果

菌株CICC 10774基因组DNA提取结果见图 1A，琼脂糖凝胶检测显示，提取DNA片段在23 kb附近有一条亮带，说明提取的基因组DNA完整性较好。利用引物27F和1492R扩增得到16S rRNA基因片段仅有一条带，大小在1 500 bp左右(图 1B)，说明16S rRNA基因扩增成功。

将菌株CICC 10774的16S rRNA基因序列测序后递交数据库比对，发现与其亲缘最近的是Lactobacillus acetotolerans JCM 3825^T，相似性为100%，与其他菌株的相似性均小于97%。获取相关模式菌株的16S rRNA基因序列，以Escherichia coli KCTC 2441^T (EU014689)为外群，构建菌株CICC 10774系统发育树(图 2)。系统发育结果表明，菌株CICC 10774与Lactobacillus acetotolerans JCM 3825^T聚类在一个系统发育分支，菌株CICC 10774鉴定为Lactobacillus acetotolerans。

2.2 表型特征鉴定结果

菌株CICC 10774在MRS琼脂培养基上37 °C厌氧培养3 d，菌落为乳白色，圆形，湿润，边缘整齐，表现为典型的乳杆菌菌落特征。显微镜下观察菌株呈杆状或者弯曲杆状，大小为(0.5−0.6) μm× (1.0−2.0) μm，单个，成对或者成链排列，革兰氏染色呈阳性。电镜照片见图 3。

API 50 CHL鉴定系统结果表明，菌株能够利用葡萄糖、果糖、甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺、熊果苷、七叶灵、水杨苷、纤维二糖、海藻糖和龙胆二糖作为碳源生长，蔗糖和糖原利用较弱，不能利用其他的碳源(表 1)。生理生化鉴定分析结果表明，菌株CICC 10774兼性厌氧生长，明胶水解为阳性，柠檬酸盐利用、H₂S生成、尿素利用、硝酸盐还原、VP试验和MR试验为阴性(表 2)。

2.3 菌株CICC 10774生长代谢特性研究

菌株CICC 10774 生长特性研究表明，其最适生长温度为37 °C，厌氧培养7 d后OD₆₀₀达到2.0，40 °C培养7 d后OD₆₀₀能达到1.5，然而在20 °C生长7 d后OD₆₀₀只能达到0.5，仅为37 °C培养的25%，45 °C培养几乎没有生长(图 4A)，说明温度是耐酸乳杆菌生长的关键条件，这与夏季食醋生产过程中容易出现微生物污染一致。夏季食醋生产厂房中温度较高，能够达到37 °C，甚至40 °C，是耐酸乳杆菌最易生长的温度，为其大量生长繁殖提供了有利条件；而冬季食醋生产厂房中的温度往往低于20 °C，在很大程度上抑制了耐酸乳杆菌的生长。

菌株CICC 10774生长最适pH为5.0，培养7 d后OD₆₀₀达到2.0，pH 6.0条件下培养7 d后OD₆₀₀达到1.5。然而当pH升高到7.0或者降到4.0，培养7 d后几乎没有生长(图 4B)。这也解释了6°醋没有出现变质，而3°醋经常出现变质的原因。6°醋酸度较高不适合耐酸乳杆菌CICC 10774的生长，而3°醋的酸度较低，该杆菌可生长繁殖。最初从醋中分离耐酸乳杆菌时采用的是MRS培养基(pH 6.8)，该菌生长缓慢，通常需要5−7 d，容易被忽略。根据耐酸乳杆菌生长的pH曲线，我们采用pH 5.0的MRS培养基进行耐酸乳杆菌的检测，2−3 d就能在固体平板上观察到菌落，缩短了培养周期，有利于在工厂里快速检测是否有污染菌，也为下一步污染菌的溯源奠定了基础。

耐热试验结果(图 5)表明，93 °C处理15 s后菌株的存活率为8.02%，处理30 s后菌株的存活率为0.67%，处理45 s后菌株的存活率下降到0.01%。处理60 s以上样品中几乎就没有活菌存在。目前食醋生产企业使用的灭菌方式93 °C处理30 s，当生产过程中食醋中耐酸乳杆菌浓度达到10⁷ CFU/mL时，成品醋中就会残留耐酸乳杆菌约为7×10⁵ CFU/mL，一旦遇到适合生长的外界环境，非常容易大量繁殖，引起食醋的腐败。另外，灭菌时间越长，食醋的风味越差，营养价值也越低。因此，要保持食醋风味不变的前提下增加灭菌时间，本研究的结果建议将高温灭菌时间延长到45 s。

将耐酸乳杆菌接种到正常醋样中进行回接试验。结果表明，耐酸乳杆菌的接入会引起正常醋样出现产气、淡腐、臭味、颜色变浅、可溶性固形物减少以及pH值升高等变质现象(表 3)。同时，将接种后的正常醋样立即进行93 °C处理45 s后进行菌落计数，几乎没有发现耐酸乳杆菌的存在，样品也未出现变质的现象。

使用HPLC方法，对不同培养条件下(pH 4.0、5.0和6.0)的菌株CICC 10774的代谢产物进行了分析，结果如表 4所示，37 °C厌氧培养3 d后，菌株CICC 10774的主要代谢产物为乳酸和乙酸，并且含量随pH的升高而增加。代谢产物分析发现耐酸乳杆菌能够代谢产生醋酸，并且适应高酸环境，在醋酸发酵生产过程中发挥着关键的作用，我们在食醋生产的醋醅中也发现了耐酸乳杆菌的存在。然而，灌装前如果高温灭菌不彻底，耐酸乳杆菌就会出现在成品醋中，因其能够以多种碳源为底物生长，并且代谢产生乳酸，就会使正常醋样出现产气、酸败、淡腐、臭味颜色变浅、可溶性固形物减少以及pH值升高等变质现象，降低食醋的营养价值。

3 讨论

食醋酿造是一个微生物菌种混合发酵的复杂过程，存在着复杂的微生物群落。一方面微生物能够提供丰富的酶类和风味物质，使传统食醋具有丰富的营养成分和独特的风味；另一方面，食醋中微生物的污染也会引起异味、变色、固形物减少等现象，大大降低了食醋的营养价值，必需加以控制。

近年来的研究主要集中在食醋发酵过程中功能微生物的分离鉴定和微生物群落结构分析，几乎没有关于食醋污染微生物的研究报道。本研究通过多相鉴定，发现引起食醋变质的污染菌为耐酸乳杆菌，并对其生理生化特征和生长代谢特性进行了分析，初步阐明了其污染食醋的原因。耐酸乳杆菌CICC 10774的最适生长温度与夏季常出现食醋变质的温度一致，生长的最适pH也与常出现变质的3°成品醋一致。生理生化特征和代谢产物分析发现，耐酸乳杆菌能够利用多种碳源，容易分解食醋中的营养成分，同时产生的乳酸也是引起食醋酸败的原因之一。热稳定性试验结果表明，目前生产中使用的高温灭菌方式有待改进。食醋生产企业应该从生长温度、pH等方面对生产环境进行控制，同时在不影响风味的前提下，适当增加巴氏灭菌的时间，彻底杀灭成品醋中的污染菌。本研究是有关食醋生产过程中污染菌的首次报道，为食醋生产过程中微生物控制和污染菌防治奠定了基础。