深海作为极端环境之一，蕴藏着数量庞大、种类繁多的生物资源，微生物是其中最重要的一类。深海微生物在深海的极端环境下生存，形成了独特的生理机制及代谢产物，具有重要的科研价值和经济价值，所以深海环境下极端微生物的研究不仅是目前生命科学最前沿的领域之一，也是海底深部生物圈研究和海底流体活动研究重要的组成部分^[1]。放线菌是一类有重要应用价值的微生物资源，因其产生丰富的活性次级代谢产物而备受关注，现已发现的2万多种微生物次级代谢产物中，约70%是由放线菌产生的^[2]。海洋放线菌是海洋微生物资源的重要组成部分^[3]，尤其是深海放线菌是开发新的生物活性物质的重要来源。深海具有高压、低温或高温、黑暗、寡营养的极端环境^[4]，长期适应于这种极端环境的深海放线菌必然有其特殊的代谢调控机制和物种多样性，所蕴含的应用潜力不可估量，可以说深海这一特殊环境是发现和筛选新的放线菌物种多样性和特殊代谢产物的宝贵资源。

南海是西太平洋最大的边缘海，兼具区域海洋和深海的共同特点，对东亚季风气候有着重要的影响，同时，其南部位于西太平洋暖池区，对全球气候变化具有敏感的响应^[5]，有着复杂多样的海底沉积环境及其可能蕴含的丰富的放线菌类群和潜在的大量结构新颖的代谢产物。系统地开展南海海洋放线菌多样性研究，评估其潜在的应用价值，对于开拓我国药用微生物资源具有重要意义。近年来，以南海海洋研究所和云南大学研究人员为主，针对南海海洋放线菌物种资源及其次级代谢产物进行了大量研究并取得了丰富的研究成果，发现了7个亚目、13个科和28个属的放线菌^[6]；发现和鉴定了14个放线菌新种，其中有7个来源于1 000 m以下的深海沉积物^[7]，显示出我国南海热带海域丰富的放线菌资源。但到目前为止，对于南海海洋放线菌，特别是深海沉积物环境中放线菌资源及其多样性的研究还停留在纯培养水平上，缺少系统全面的分析，由于传统纯培养方法的局限性，所获得的微生物不足自然界中微生物的1%，仅采用纯培养法开展多样性分析不足以客观地反映环境中微生物群落情况。因此，本研究利用16S rRNA基因文库技术与纯培养技术相结合的手段对南海深海沉积物放线菌物种多样性和系统发育多样性进行分析，推动对南海深海放线菌深入的认知，以便更好地发掘潜在资源，为南海放线菌资源的开发和有效利用奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样品来源： 样品选用东方红2号2011年8月南海航次的11个位点的沉积物样品，采集信息见表 1。构建文库所用的深海沉积物样品是N40-4(3 235 m，14.5°N，118°E)；N63-4(4 242 m，15°N，114°E)，样品采集后于−20 ℃保藏。

1.1.2 主要培养基： Raffinose-Histidine agar^[8]、Starch-casein agar^[8]、A1^[9]、M2^[10]、M3^[10]、M4^[11]、改良高氏一号培养基^[11]和2216E^[11]共8种分离培养基；LB^[11]、1/2ISP2^[11]。分离培养基用陈海水配制，1×10⁵ Pa灭菌30 min后，添加终浓度为100 mg/L的制霉菌素、50 mg/L的萘啶酮酸和25 mg/L的重铬酸钾。

1.1.3 主要试剂和仪器： QIAEXⅡGel Extraction Kit，德国QIAGEN公司；Gel Extraction Kit，美国OMEGA公司；pMD19-T Vector，日本TaKaRa公司；引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。电泳仪(AC100-240V)，青岛英睿仪器设备销售有限公司；凝胶成像仪(GBOX/CHEMI-XT16)，青岛爱普科生物工程有限公司。

1.2 16S rRNA基因克隆文库构建及系统发育分析 1.2.1 样品总DNA的提取和纯化： 采用SDS-CTAB溶菌酶法^[12,13]提取两个深海沉积物样品总DNA，溶于200 µL TE缓冲液。粗提DNA采用QIAEXⅡGel Extraction Kit纯化试剂盒纯化回收，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.2 克隆文库的构建： 用放线菌门特异性引物^[14]对样品总DNA进行PCR扩增，PCR反应条件参照Stach等^[14]方法，扩增片段大小约640 bp。目的条带用OMEGA胶回收试剂盒纯化后通过T4连接酶与pMD19-T载体连接，转化Escherichia coli DH5α感受态细胞。将转化产物涂布在含有氨苄青霉素、X-gal和IPTG的LB固体培养基上。随机挑取白色克隆子培养，用M13载体引物进行阳性验证，并构建克隆文库。用Hha I和Hae III对克隆子双酶切2 h^[15]，每种不同酶切带型选取1−2个代表菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。

1.2.3 系统发育分析： 将两个位点所有16S rRNA基因序列测序结果在EzBioCloud和GenBank数据库中进行BLAST比对，用MEGA 5.0^[16](Molecular evolutionary genetics analysis)软件采用邻接法(Neighbor-Joining)聚类分析，并构建系统进化树。利用Mothur DOS^[17]工具进行操作分类单元(OTU)划分，定义与其他样品之间序列相似度低于98%为一个单独的OTU。通过EstimateS 8.0软件将序列之间的比对数据进行处理，建立稀有度曲线，预测其多样性。

1.3 纯培养放线菌多样性研究 1.3.1 菌株分离、纯化和保藏：取沉积物样品0.5 g于4.5 mL的1/4格里斯溶液中，充分振荡混匀后，将各个样品稀释成10^-2、10^-3两个梯度。将逐级稀释后的液体均匀涂布于固体分离培养基上，28 ℃恒温培养2−3周，挑取不同的单菌落转接到相同培养基平板上进行二次纯化。纯化的菌株接种于1/2ISP2斜面培养基培养，随后转接于20%的甘油保种液中，于−80 ℃长期保存。

根据菌落形态、颜色、气生菌丝、基内菌丝和孢子丝形状等^[18]，对分离菌株进行分类和表观排重。

1.3.2 放线菌菌株基因组DNA提取、16S rRNA基因序列扩增： 提取放线菌基因组DNA，以提取的DNA为模板，用16S rRNA基因全长引物^[19]扩增，纯化后的扩增产物连接到pMD19-T载体，转化至E. coli DH5α感受态细胞。将经检验无误的克隆子送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。测序结果在EzBioCloud和GenBank数据库进行BLAST比对分析。

2 结果与分析 2.1 16S rRNA基因文库分析 2.1.1 克隆文库的构建和检验： 提取样品总DNA(图 1A)，总DNA约为15 kb，条带单一。用放线菌门特异性引物扩增，获得640 bp大小的目的片段(图 1B)。纯化DNA产物与pMD19-T载体连接，转化E.coli DH5α感受态细胞，挑取白色克隆。用M13引物进行菌落PCR，排除假阳性克隆。N40-4和N63-4位点样品分别得到40个阳性克隆和99个阳性克隆，通过比较Hae Ⅲ、Hha Ⅰ双酶切图谱(图 2)，挑选代表克隆子进行测序。测序结果进行分析比对，去除非放线菌序列，两个位点样品分别归于16和34个不同的OTUs。

2.1.2 文库多样性指数分析： 利用EstimateS 8.0软件构建各文库的稀有度曲线，如图 3所示。Kemp等^[20]的研究结果表明，随着库容(Library size)的增大，OTUs的数目总是在增加，几乎没有哪一个文库能够穷尽样品中微生物的多样性。因此，用稀有度曲线分析16S rRNA基因克隆文库，Coverage C不可能达到100%，当曲线趋于平缓或者趋于平台期时就可以认为库容已经足够。从图 3曲线中可以看出，在一定的范围内随着克隆子数的增加OTUs数也随之增加，当库容达到一定的数量，曲线趋于平缓，表明此时的库容已可以涵盖该位点的绝大部分放线菌类群。

利用SPADE(http://Hchao.stat.nthu.edu.tw)分析软件对文库多样性指数进行分析(表 2)。在可信区间为95%的情况下，N40-4和N63-4两个位点的覆盖度(C)分别为85.4%和81.8%；位点N63-4的香农指数(Shannon index)、最大多样性指数(Hmax)及丰富度指数(Sace)均高于位点N40-4，反映其多样性高于位点N40-4；位点N40-4的均匀性指数(Evenness index)、辛普森指数(Simpson index)均高于位点N63-4，分别为0.632、0.554和0.901、0.868。以上多样性指数表明，位点N63-4蕴含的放线菌类群比位点N40-4更丰富。

2.1.3 16S rRNA基因文库多样性分析： 将N40-4位点和N63-4位点文库的克隆序列进行同源比对分析，对比对结果进行统计(表 3)。N40-4位点沉积物样品中40个克隆的分布情况见图 4，结果表明N40-4的16S rRNA基因文库代表的序列在放线菌纲(Actinobacteria)、酸微菌纲(Acidimicrobiia)、腈基降解菌纲(Nitriliruptoria)和嗜热油菌纲(Thermoleophilia)4个纲均有分布，其中放线菌纲(Actinobacteria)有10个OTUs和27个克隆，占总OTUs的62.5%，总克隆的67.5%，其中链霉菌目(Streptomycetales)OTUs数和克隆子数最多，是该位点的优势菌群。其次为酸微菌纲(Acidimicrobiia)，4个克隆子分布于4个OTUs。嗜热油菌纲(Thermoleophilia)和腈基降解菌纲(Nitriliruptoria)都只有1个OTUs，说明这些类群在该地区中虽然都有分布但多样性较低。

在N63-4位点沉积物样品中99个克隆的分布情况见图 4。腈基降解菌纲(Nitriliruptoria)的腈基降解菌目(Nitriliruptorales)有48个克隆，占总克隆的48.5%，是该位点的优势菌群；25个克隆分布于放线菌纲(Actinobacteria)的7个目中，其中包括弗兰克氏菌目(Frankiales)、放线菌目(Actinomycetales)、棒杆菌目(Corynebacteriales)、微球菌目(Micrococcales)、链孢囊菌目(Streptosporangiales)、假诺卡式菌目(Pseudonocardiales)、链霉菌目(Streptomycetales)，7个目占总克隆的25.3%，是该环境的中等数量类群，其中放线菌目(Actinomycetales)最少，仅1个克隆，链孢囊菌目(Streptosporangiales)最多，有10个克隆。酸微菌纲中的酸微菌目(Acidimicrobiales)有18个克隆，10个OTUs，分别占总克隆的18.2%和29.4%，可以推测该位点酸微菌纲(Acidimicrobiia)多样性较高。

综合以上分析表明，两个位点的16S rRNA基因文库代表序列在放线菌纲(Actinobacteria)、酸微菌纲(Acidimicrobiia)、腈基降解菌纲(Nitriliruptoria)和嗜热油菌纲(Thermoleophilia)4个纲均有分布，N63-4位点共得到99个克隆，归为34个OTUs，N40-4位点共得到40个克隆，归为16个OTUs。从总体上分析，N63-4位点放线菌的多样性要高于N40-4位点放线菌。从各位点放线菌的具体分类上分析，两个位点虽然都来自深海，但都有各自的优势菌群，其中N40-4位点链霉菌目(Streptomycetales)占优势，N63-4位点腈基降解菌目(Nitriliruptorales)占优势。

2.2 可培养放线菌多样性研究

2.2.1 菌株分离和表观排重：经过分离纯化和表观排重，获得了41株形态各异的放线菌，多数菌株的菌落形态与陆地放线菌差异较大，没有典型的孢子丝结构，菌落形态呈细菌形态。

2.2.2菌株多样性分析：经表观排重，对得到19株菌进行16S rRNA基因全序列测定，测序结果在EzBioCloud数据库进行同源比对。19株菌分布于链霉菌属(Streptomyces)、微杆菌属(Microbacterium)、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)、考克氏菌属(Kocuria)、节杆菌属(Arthrobacter)、拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)、微球菌属(Micrococcus)、迪茨氏菌属(Dietzia)、异壁放线菌属(Actinoalloteichus)和糖多孢菌属(Saccharopolyspora)10个不同的属，包括12个不同的种，其中大多数为稀有放线菌属。

由表 4可知，有17株菌与已知模式菌株的最大序列一致性在99%以上。OAct400与已知菌株Microbacterium amylolyticum N5^T的最大一致性为97.73%。一般而言，与已知菌种一致性在99%以上，可以归为同一个种^[21,22]。所以基本可以确定OAct400为微杆菌属的一个新种，目前我们已经完成该菌株的新种鉴定工作。OAct415与已知菌株Pseudonocardia kongjuensis LM157^T的最大一致性为98.96%，推测其为一株潜在的新亚种，但是它的具体分类学位置，还需要进一步做DNA(杂交)同源性分析，并结合其他生理生化指标和化学鉴定指标才能确定。

3 讨论

特殊环境中的放线菌在长期的适应过程中，会产生特殊的代谢机制和环境适应模式，有可能产生丰富的物种多样性和独特的活性次级代谢产物，因此成为重要的微生物资源。目前针对海洋(深海)环境放线菌资源及其次级代谢产物的研究方兴未艾^[6]。在整个海洋环境中，海洋沉积物所占面积较大，可覆盖地球表面积的63.5%左右，其营养丰富、腐殖质含量较高，是海洋放线菌的重要栖息地的微栖息地，因此放线菌类群多样性显著^[23,24]，早在2003年Stach等通过DNA检测，就证明了海洋沉积环境中存在丰富的放线菌类群^[25]。近年来随着深海勘探技术的提高，人们又把探索的目光从近海浅海转向深海大洋，从深海海底沉积物中发现了许多不同于陆地或浅海的新的海洋放线菌类群^[26]。

本研究利用16S rRNA基因文库技术对N40-4和N63-4两个位点的放线菌多样性进行初步分析，两个位点N40-4(水深3 235 m)和N63-4(水深4 242 m)均为深海沉积物，16S rRNA基因克隆文库表明，两个位点的克隆序列在放线菌纲(Actinobacteria)、酸微菌纲(Acidimicrobiia)、腈基降解菌纲(Nitriliruptoria)和嗜热油菌纲(Thermoleophilia)4个纲中均有分布。这是目前首次利用免培养技术针对南海海洋沉积物放线菌多样性进行专门的分析。Stach等利用16S rRNA基因文库技术对大西洋3 814 m处深海沉积物的放线菌多样性进行分析，发现随着深度的增加放线菌群落结构相应发生变化，在每一深度均有其独特的遗传多样性，但多样性指数和物种数量随着深度增加而减少^[25]。我们的研究数据显示，随着深度的增加，放线菌群落结构组成确实发生变化，水深3 235 m的N40-4位点中放线菌纲的链霉菌目(Streptomycetales)占优势，水深4 242 m的N63-4位点中腈基降解菌纲的腈基降解菌目(Nitriliruptorales)占优势，这一结果与Stach等^[25]的发现是一致的；但在我们的研究结果中，随着深度的增加，南海深海沉积物中放线菌多样性指数和丰富度指数也相应增加，在这一方面则与Stach等的研究结果相反。尽管已有研究表明，随着海洋深度的增加，海洋环境中放线菌的数量呈下降趋势^[6]，但也有新数据证实在某些特殊海洋沉积环境中放线菌占据优势地位，如在Gulf of Mexico^[27]和日本的南开海槽(Nankai Trough)的水合物沉积环境中30%−40%的原核生物为放线菌类群^[28,29]。根据这些结果，我们推测深海放线菌多样性及群落结构也同样存在地理分布上的差异，可能既受空间隔离的影响，也受环境异质性因素的影响^[30]。

我们的纯培养研究结果也显示出我国南海深海沉积物环境蕴含着丰富且新颖的放线菌资源和多样性，共获得41株放线菌，经16S rRNA基因序列同源性比对，选取的19株南海放线菌属于10个不同的属，12个不同的种，其中稀有放线菌属比例较高；此外除了链霉菌属、诺卡氏菌属和假诺卡氏菌属这3个常见丝状放线菌外，其余的种属皆表现为类似细菌形态，不产生丰富的气生菌丝。这一结果与目前已有的深海放线菌研究报道是一致的，贾文文^[31]在南大西洋深海样品(1 500−3 200 m)中获得了36株放线菌，分属于迪茨氏菌属(Dietzia)、微球菌属(Micrococcus)、戈登氏菌属(Gordonia)、考克氏菌属(Kocuria)、微杆菌属(Microbacterium)等8个属，其中迪茨氏菌属和微球菌属为优势属。张玉便等^[32]从3个沉积物(水深均在2 600 m以下)中得到的132株放线菌，分属于放线菌亚纲下的6个目、13个科和19个属，种属多样性及稀有放线菌所占的比例也比较大，其中考克氏菌属(Kocuria)和短状杆菌属(Brachybacterium)为优势菌。Goodfellow课题组^[33]从马里亚纳海沟10 890 m处沉积物中分离到38株放线菌，分属于皮生球菌属(Dermacoccus)、考克氏菌属(Kocuria)、小单孢菌属(Micromonospora)、链霉菌属(Streptomyces)、Tsukamurella和Williamsia，其中以Dermacoccus为优势属。尽管上述研究中深海沉积物样品数量有限，所得到的研究结果不能完全代表深海中放线菌的完整多样性，但综合各研究结果来看，不同海域的深海沉积物中，虽然放线菌优势菌属不同，但分离到的纯培养菌株多数以不产气生菌丝的细菌形态放线菌为主，与浅海海洋环境中放线菌典型丝状菌落显著不同^[34,35,36]。

到目前为止，我国研究人员对南海海域放线菌物种资源进行了大量研究，田新朋等^[37]在南海沉积物中分离出的700多株放线菌分布于9个属级类群，其中在南海北部沉积环境分离到Pseudonocardia、Streptomyces和Salinispora等8个属；在南沙海域分离到Salinispora和Microbacterium等属。张道锋^[34]分析南海北部沉积环境可培养细菌多样性过程中分离到169株放线菌，分布在放线菌目(Actinomycetales)下的8个亚目18个科37个属中，其中链霉菌属为优势菌属，其次是迪茨氏属。陈名洪等^[38]在南海浅海沉积物样品中分离获得了大量的稀有放线菌，其分布于小单孢菌属(Micromonospora)、疣孢菌属(Verrucosispora)、盐生孢菌属(Salinispora)、继生菌属(Jishengella)、野村氏菌属(Nonomuraea)和马杜拉菌属(Actinomadura)等9个科、13个属中。综合上述研究结果可以看出，南海沉积物中蕴藏丰富的放线菌资源，多样性丰富；特别是深海沉积物更蕴含着丰富的物种资源及巨大的研究潜力，亟待研究者去开发和利用。此外也可以发现，利用纯培养技术各个研究结果并不一致，这是因为对于放线菌这一特殊类群的微生物而言，采用不同的样品预处理方法及分离培养基得到的种属多样性差异很大^[39]，需要根据不同类群的特性设计针对这些特定种属的选择性分离方法。

本研究利用免培养和纯培养技术结合的策略，深入研究了南海深海沉积物放线菌多样性，为南海深海放线菌的选择性分离提供了信息依据。我们将有针对性地设计多样化选择性分离培养基，改进现有分离手段，以获得南海特有或特色放线菌物种资源，丰富我国海洋放线菌资源宝库。